Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
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この研究で発表された研究は、スロベニア研究庁(研究コア資金番号。P3-0396およびI0-0029、ならびに研究プロジェクト番号。J3-9289、N3-0048、およびN3-0133)およびオーストリア科学基金/Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung(二国間助成金I3562--B27およびI4319--B30)。マルシャ・ロシェル、マシャ・チャター、ルディ・ムラカールの優れた技術支援に感謝します。

著者らは、この研究が商業的または財政的利益なしに行われたことを宣言する。

哺乳類の膵臓は大きな外分泌腺と内分泌腺です。外分泌部分は、膵臓の総体積の96〜99%を占め、腺房および管からなる。内分泌部は、膵臓総体積1の残りの1〜4%を占める多数のランゲルハンス島からなる。外分泌部は、食物中のエネルギーに富むポリマーを分解する主要な消化酵素、ならびに重炭酸塩が豊富な液体を分泌し、これは他の胃腸分泌物と組み合わせて酵素の作用に適した環境を提供する。内分泌部は、エネルギーに富む栄養素の食後の分布、貯蔵、食間放出を調節するホルモンを分泌します。外分泌組織は比較的未発達であり、内分泌は出生時に比較的よく発達しているが、前者は離乳時に後者を急速に増殖させる2,3,4。膵臓機能の初期の研究は現代の生理学の誕生をマークし、この分野における主要な方法論的進歩に続いて主要な科学的ブレークトラフが続いています5。膵臓との協働は、腺の複雑な構造のために技術的に困難ですが、膵臓癌、膵炎、糖尿病など、公衆衛生に大きな脅威をもたらし、新しい治療アプローチが必要な疾患のためにも大きな動機です。
単離された膵島6、腺房7、8、および乳管断片は、細胞株および一次分散内分泌細胞、腺房細胞、および乳管細胞9,10と比較してそれらの利点のために、ゴールドスタンダード法として何十年もの間開発され、使用されてきた。単離された細胞集合体の機能が著しく改善されたにもかかわらず、これらの方法は依然としてかなりの機械的および酵素的ストレスを伴い、周囲の組織から細胞を単離し、したがってパラクリン相互作用および機械的支持を欠いており、そして最も重要なことに、正常な生理学への有意な変化を伴う11,12,13。.急性マウス膵臓組織スライスは、保存された細胞間接触、パラクリン相互作用、間葉、および組織構造を有する脳、下垂体、および副腎スライスに似た実験プラットフォームを開発する必要性が認識された必要性から、ならびに当時の膵島研究におけるゴールドスタンダード法の最も重要な欠点のいくつかなしに、2001年に開発された - 単離された膵島12、14。これらの欠点の中には、最外層の損傷、コア膵島領域のアクセシビリティの欠如、および細胞の同一性および生理機能におそらく重要な影響を及ぼす培養の必要性が含まれる12,15。さらに、組織スライス法は、膵島を単離することが不可能な場合、または従来の単離によって膵島収量が極端に低い場合、ひどく狂った膵島構造を有する動物モデルの研究を可能にする16、17、18、19、20、21。
さらに、このスライスは、例えば、組織全体のより良い概観を可能にし、地域差の研究とも両立するため、糖尿病および膵炎の発症中の形態学的変化を研究するのにより適している。重要なことに、内分泌部分への早期の焦点にもかかわらず、組織スライス法は、本質的に、外分泌成分9、22、23の研究を可能にする。その導入後の最初の10年間、この方法は、ベータ14、24、25、26、27、28、29およびα30,31細胞の電気生理学的研究ならびに膵臓の形態学的および機能的成熟を調べるために採用された2,3.10年後の2013年、この方法は、蛍光カルシウム色素と膜電位色素34を組み合わせることにより、グルコース32に対する応答、それらの機能的連結性パターン33、および膜電位と細胞内カルシウムとの関係を特徴付けるために、CLSMを用いた膵島細胞の生細胞カルシウムイメージングに成功しました。同年後半に、この方法は、腺房細胞におけるカルシウム動態を評価するためにも使用された22,35。その後の数年間にわたり、膵臓組織スライスは、多数の異なる研究において使用され、ブタおよびヒト組織9、36、37、38、39、40、41に首尾よく適合してきた。しかし、まとめると、カルシウムイメージングは、マウス膵臓組織スライス全般、特に膵島において、依然としてほとんどがこのグループによって行われている。この主な理由の1つは、技術的に困難な組織スライス調製、共焦点顕微鏡の必要性、およびかなり複雑なデータ分析の組み合わせにある可能性があります。この論文の主な目的は、この強力な方法を他の潜在的なユーザーがよりアクセスしやすくすることです。
組織スライスの調製および構造および分泌研究のためのスライスの使用を詳細に扱う優れた方法論的論文はすでにいくつかあるが、共焦点カルシウムイメージングについてはそうではない9,42,43。したがって、このホワイトペーパーでは、スライスの準備中のいくつかの追加のヒントとコツ、染料ローディング、画像取得を成功させるために重要なステップ、および基本的なカルシウムデータ分析の主なステップに焦点を当てます。したがって、この貢献は、上記の方法の代替としてではなく、補完的であると考えるべきである。同様に、マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウムイメージングは、特定の質問に答えるために使用される実験的アプローチとして見なされるものとし、したがって、単離された管またはアシニ、単離された膵島、オルガノイド、眼の前房に移植された膵島などの膵生理学における他のカルシウムイメージングアプローチの絶対的な代替手段ではなく、 11、44、45、46、47、48のインビボでの記録を含む。マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウムイメージングの有望性は、周皮細胞49およびマクロファージ50などの膵島間葉系細胞、ならびに乳管細胞23におけるカルシウム動態の最近の成功した記録によって最もよく示されている。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

急性マウス膵臓組織スライスは、細胞間通信および組織アーキテクチャが保存されたユニークなin situ製剤であり、典型的なin vitro研究に記載されている単離された膵島、アシニ、ダクト、または分散細胞よりも有意に少ない調製誘発変化を伴う。急性膵臓組織スライスを共焦点レーザー走査顕微鏡(CLSM)における生細胞カルシウムイメージングと組み合わせることにより、カルシウムシグナルを多数の内分泌細胞および外分泌細胞で同時に、単一細胞または細胞内分解能で研究することができる。感度は変化の検出を可能にし、細胞間波動および機能的連結性の研究、ならびに膵島内でのそれらの局在化および他の細胞とのパラクリン関係に対する細胞の生理学的応答の依存性の研究を可能にする。最後に、動物福祉の観点から、一度に多数の細胞からの信号を記録することは、実験に必要な動物の数を減らし、3Rの置換、減少、および改良の原則に寄与する。

膵管へのアガロース溶液の注入は、膵臓組織スライス調製において最も重要なステップである。成功した注射は、 図3Aの左側に見られるように、膵臓組織の白化によって認識され、膵臓の不完全な注入部分は 図3Aの右側に提示される。ランゲルハンスの膵島は肉眼または実体顕微鏡下で認識することができ、これはその後のアガロースブロックへの埋め込みのために膵臓の適切な部分を切断するのに役立つ(図3B)。新しく切断されたマウス膵臓組織スライスにおいて、ランゲルハンスの膵島は、実体顕微鏡下での白い斑点(図3C)または光学顕微鏡下での茶色がかった構造(図3D)として、周囲の外分泌組織および間葉と容易に区別することができる。膵臓組織スライスは、スライス後少なくとも12時間、異なるタイプの実験に使用することができる。実体顕微鏡、光学顕微鏡、およびカルシウムイメージング中の細胞の機能応答下での肉眼的形態学的評価に加えて、膵組織スライスの生存率を評価することができる(図4)。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> 図4:組織スライス内の細胞の生存率。 細胞の生存率は、Live/Deadアッセイで決定した。生細胞はカルセインAM(緑色で表示)で染色され、死細胞はエチジウムホモダイマー-1(赤色で表示)で染色されます。黄色の線は、下部と右側に表示されるZスタックのX-Y断面の位置を示します。Zスタックの全深度は88μmです <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
カルシウムイメージング実験では、蛍光カルシウムインジケータが数層の細胞を貫通する必要があります。図5Aは、個々の膵島および腺房細胞が認識され得る膵臓組織スライスへの細胞透過性Ca2+指示色素の良好な装填を提示する。対照的に、図5B-Dのスライスは、色素の浸透に失敗したこと(図5B)、膵島細胞の欠如(図5C)、および表面に多くの壊死組織(図5D)のために最適ではない。このようなスライスは、廃棄したり、よりよく切断または染色された追加の膵島の存在をチェックしたり(トラブルシューティングについては表1を参照)、または外分泌細胞の応答を記録するために使用することができる。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> (A)ランゲルハンス島内のよく染色された細胞、ならびに乳管細胞および周囲の腺房組織を有する膵臓組織スライスの調製に成功した例。(b)染色不良の組織スライスの一例。(C)構造的な断絶を伴うランゲルハンス島の例。(D)多くの死細胞と多くの破片を含むランゲルハンス島の例。右側の「グローオーバー、グローアンダー」ルックアップテーブルには、緑で0強度、青で彩度が表示されます。スケール バー = 100 μm。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
細胞透過性Ca2+ 指示色素を用いたカルシウムイメージングからの代表的な結果を 図6に示す。 図6Aでは、ランゲルハンスの膵島、腺房組織、および膵管を含む膵臓組織スライスの高解像度画像が提示される。より良い区別のために、 図6A に提示された膵臓組織スライスの内分泌、外分泌、および乳管部分は 、図6Bに着色されている。適切な刺激を用いて、異なる膵島細胞間、または膵島細胞と非膵島細胞51とを機能的に区別することができる。ベータ細胞は、典型的には、グルコースによる二乗パルス刺激に応答し、[Ca2+]IC の一時的な増加に続いて、持続的なプラトー上での速いカルシウム振動が続く(図6C、上パネル)。
すべてのベータ細胞は単一の大きな機能的なシンシチウムに結合されているため、これらの振動は、[Ca2+]IC波32、34、52、53、54を広げることによって、異なる細胞間で非常によく同期しています(図7C)。5〜15分の周期でより遅い[Ca2+]IC発振は、高速振動の根底にあるか、または応答55,56の支配的なタイプであることさえあり得る。同じ単純なプロトコルは、特に膵島の周辺で、他のタイプの応答を明らかにする可能性がある(図6C、下パネル)。これらの細胞はベータ細胞と同期しておらず、低グルコース条件下で既に存在する、または活性の低下を伴うより速く、より不規則な振動で応答するので、そのような応答は、非ベータ細胞を強く示唆する21、32、57、58。しかし、それらの決定的な機能的特性評価には、以下で説明する追加の刺激ステップまたは代替アプローチを備えたより複雑なプロトコルが必要です。腺房細胞および乳管細胞の典型的な応答を、それぞれ図6Dおよび図6Eに提示する。腺房および乳管細胞の詳細については文献を参照されたい22,23,35。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> 図6:異なるタイプの膵臓細胞におけるカルシウム動態の代表的な結果。 (A)ランゲルハンス島の周囲組織との高解像度画像。(B)黄色で示された腺房組織、赤で示されたランゲルハンスの島、および青で示された管状木のセグメントを有する膵臓組織の別個の部分の描写。スケールバー = 100 μm. (C) 12 mM グルコースによる刺激中のベータおよび推定非ベータ細胞におけるカルシウム動態の典型的な痕跡;3mMグルコースを非刺激条件に使用した。非ベータ細胞のより具体的な識別に使用できるプロトコルは、議論のセクションで説明されています。(D)25nMアセチルコリンによって刺激された腺房細胞のカルシウム動態の典型的な痕跡。(E)1mMケノデオキシコール酸によって刺激された乳管細胞のカルシウム動態の典型的な痕跡。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
カルシウムイメージングが成功すると、データは最初にエクスポートされ、プロトコルのセクションで説明したように、指数関数と線形適合の組み合わせによって漂白用に補正されます。漂白補正前後の時系列を図7Aに示す。その後、応答の活性化および不活性化段階ならびにプラトー相におけるいくつかのパラメータを分析することができる。刺激後の[Ca2+]IC増加の開始の遅延は、図7Bの遅延Aおよび個々の細胞間の遅延の不均一性(遅延A1)によって表されるように測定することができる。同じパラメータ(遅延Dおよび遅延D1)を使用して、非アクティブ化フェーズを記述することができます。最初の一過性の[Ca2+]ICの増加に続いて、膵島内のほとんどの膵臓ベータ細胞におけるプラトー期は、比較的規則的な高周波[Ca2+]IC振動によって特徴付けられる。プラトー位相は、古典的な関数パラメータを分析することによって記述することができる。[Ca2+]IC発振の持続時間、周波数、およびアクティブ時間の割合の概略図を図7Cに示します。10Hzより高い取得率のカルシウムイメージングでは、膵島全体に繰り返し広がるカルシウム波もはっきりと認識できます(図7C)。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> 図7:時系列データの解析 。(A)フォトブリーチングのための時系列データの補正(b)12mMグルコースによる刺激の停止後の活性化および停止後の失活への遅延の解析。刺激の持続時間は、画像内の薄い灰色の陰影付きバーで示される。(C)プラトー位相のいくつかのパラメータの分析:I)半高さで決定された振動の持続時間、II)振動間間隔によって決定される振動の周波数。III)振動の周波数と持続時間の積としての活動時間。I-IV)ランゲルハンス島全体に広がる振動の任意の所与の波における振動間の遅延は、単一の細胞が振動の半分の高さに達する時間の遅延(Δt)によって決定される。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表 1.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">このテーブルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

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Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

我々は、急性膵臓組織スライスの調製と共焦点レーザー走査顕微鏡におけるそれらの使用を提示し、多数の生細胞において、長期間にわたり、高い時空間分解能でカルシウム動態を同時に研究する。

急性マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウム動態の共焦点レーザー走査顕微鏡

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

生細胞カルシウムイメージングと組み合わせることで、急性膵臓組織スライス技術は、細胞間波と多細胞機能的接続性を長期間にわたって高解像度で研究することを可能にします。この技術の主な利点は、高速であり、組織構造を維持し、組織の高収率を維持しながら、限られた酵素的および機械的ストレスを低減することである。疾患進行中の機能的および形態学的変化を検出することにより、この技術は、糖尿病などの膵臓関連疾患の理解に役立つ。この組織スライス技術は、細胞間接触の保存、パラクリン相互作用、および組織構造に重点を置いて、脳、下垂体、および副腎組織に適用することができる。マウス膵臓へのアガロースの注射を準備するには、5ミリリットルのシリンジに摂氏40度の液体アガロースを充填し、シリンジに30ゲージの針を装備する。針をキャップで慎重に覆った後、シリンジの針の端を下にして、アガロースの全量を水面の下に、摂氏40度の水浴に入れます。細胞外溶液のボトルをカルボゲンで連続的に、氷上で連続的に、気圧および室温で毎分1.5ミリリットルで泡立て、酸素化およびpH7.4を確実にする。アガロース注射を行うには、安楽死させた成体マウスを実体顕微鏡下に置き、開腹術を介してマウス腹部にアクセスした。腸を左側に静かに動かして総胆管を露出させ、鉗子を使用してダクトの十二指腸端をわずかに持ち上げてVaterの乳頭を見つけます。ヘモスタットを使用して十二指腸乳頭の胆管をクランプし、ダクトから十二指腸へのアガロースの漏れを防ぎ、小さな鋭い鉗子を使用して総胆管の下に到達し、ダクトを膵臓組織に取り付ける膜を壊します。ダクトからできるだけ多くの脂肪および結合組織を除去した後、ダクトを一対の大きな鉗子の先端に垂直に置き、シリンジプランジャーをしっかりと押して、粘性液体アガロースを総胆管の近位端に20〜30秒間注入する。組織が白っぽくなり、わずかに傾いたら、シリンジを外し、泡立った氷冷細胞外溶液20ミリリットルを膵臓にゆっくりと注ぎ、組織を冷却し、アガロースを硬化させる。膵臓組織スライスを取得するには、鉗子と細かいタフカットハサミを使用して、アガロース注入した膵臓を40ミリリットルの氷冷細胞外溶液を含む100ミリメートルのペトリ皿に静かに移します。皿を旋回させて組織をすすぎ、膵臓を氷冷した細胞外溶液の2番目の皿に移す。鉗子とハサミを使用して、白っぽくよく注入された膵臓部分を最大6つの0.1〜0.2立方センチメートル片に切断し、組織片から残りの結合組織および脂肪組織を除去する。洗浄したブロックを、摂氏40度の液体アガロースを約5ミリリットル含む35ミリメートルの非粘着性の底のペトリ皿に入れ、直ちに氷の上にペトリ皿を置く。アガロースが固まったら、100ミリメートルのペトリ皿のふたの上にペトリ皿を逆さまに持ち、カミソリの刃の半分を使ってペトリ皿の側壁とアガロースの間の余白に慎重に切り込み、皿からアガロースを取り除きます。カミソリの刃を使用して、解放されたアガロースからアガロースの1つの組織ブロックを含む個々の立方体を切断し、シアノアクリレート接着剤を使用してブロックをビブラートームのサンプルプレートに取り付けます。ビブラトームの切断チャンバを、カルボゲンで連続的に泡立てた150ミリリットルの氷冷細胞外溶液で満たす。サンプルプレートをビブラトームにネジで固定し、新しいカミソリの刃を取り付けます。チャンバーを氷で囲み、6ミリモルのグルコースを添加した細胞外溶液で作られた2つの10ミリリットル容量のアイスキューブを加える。スライサーを毎秒 0.05 ~ 1 ミリメートル、70 ヘルツに設定し、スライスを開始して、表面積が 20 ~ 100 平方ミリメートルの厚さ 140 ミクロンのアガローススライスを取得します。細かいペイントブラシを使用して、6ミリモルのグルコースを添加した40ミリメートルのHEPESバッファーで満たされた100ミリメートルのペトリ皿に各スライスを慎重に移します。カルシウム色素調製の場合、50マイクログラムの細胞透過性カルシウム指示色素、7.5マイクロリットルのDMSO、および2.5マイクロリットルのポロクサマー、および6.667ミリリットルのHBSを15ミリリットルのスクリューキャップチューブに溶解する。ピペットを使用して溶液を20秒間十分に混合した後、チューブを超音波浴槽に沈め、それぞれ30秒間ボルテックス処理します。次いで、得られたカルシウム指示色素溶液の3.333ミリリットルを、標識される組織の10スライス当たり1つの5ミリリットルのシャーレにアリコートする。染料ローディングのために、薄い柔らかいペイントブラシを使用して、染料溶液の各皿に最大10個の組織スライスを移し、室温で50分間、光から保護された毎分40回転の間、皿をオービタルシェーカーの上に置きます。インキュベーションの最後に、染色されたスライスを最大20個まで、色素を含まないHBSで満たされた個々の60ミリリットルのペトリ皿に移す。共焦点顕微鏡によるカルシウムイメージングでは、20倍または25倍の倍率を選択し、取得モードをタイムラプスイメージングに、ピンホールを100〜200ミクロンに設定し、実験に使用した蛍光色素分子の励起および発光を設定します。記録チャンバと灌流システムを顕微鏡の温度制御ステージに取り付け、入口と出口を記録チャンバの遠端に配置します。流入速度と流出速度を毎分1〜2ミリリットルに設定します。輸液系の温度を摂氏37度に設定し、非刺激溶液で氾濫を開始する。組織のカルシウム動態を記録するには、単一の組織スライスを記録チャンバに入れ、張り詰めたナイロンメッシュでU字型の白金重量で組織を固定化します。明視野オプションを使用して目的の構造を特定し、ライブイメージングを使用して調査した構造を視野に配置します。信号対雑音比を最適化するには、レーザー出力を最小限に抑えながら、レーザー出力、検出器増幅、ライン平均ビニングを調整します。焦点面を切断面から 15 ミクロン下方に調整して、損傷した可能性のある細胞からの記録を避け、画像を取得します。サンプリング周波数を1~2ヘルツに設定して、個々の振動を初期検出し、高解像度の画像を記録します。利用可能な場合は、オンラインチャートを使用して、試料作製応答、照明過多、フォトブリーチング、および機械的ドリフトに関するフィードバックを即座に取得します。すべての画像が集録されたら、後で分析するためにデータを保存します。ここで最適な組織スライスの一例は、細胞透過性カルシウム指示色素が膵臓組織スライスに正常に装填された状態で観察することができる。対照的に、これらの組織スライスは、色素浸透の失敗、膵島細胞の欠如、またはサンプル表面上の壊死組織の豊富さのいずれかのために、イメージングに最適ではない。膵臓組織スライスの高解像度画像を使用して、ランゲルハンス島、腺房組織、または膵管などの膵組織の別個の領域を描写することができる。刺激は、異なる膵島細胞間、または膵島細胞と非膵島細胞とを機能的に区別するために使用することができる。例えば、ベータ細胞は、典型的には、細胞内カルシウムの一時的な増加に続いて持続的なプラトー上での速いカルシウム振動を示すことによって、正方形パルスグルコース刺激に応答する。対照的に、非ベータ細胞はより速く、より不規則な振動で応答する。刺激後の細胞内カルシウム増加の発症の遅延、ならびに個々の細胞間の不均一性および遅延も測定され得る。同じパラメーターを使用して、非アクティブ化フェーズを記述できます。ここでは、細胞内カルシウム振動持続時間、周波数、および活性時間の割合の概略的な提示が観察され得る。10ヘルツを超える取得速度で撮像すると、膵島全体に繰り返し広がるカルシウム波をはっきりと認識することができます。膵臓に入っている枝を誤って閉塞しないように、総胆管をできるだけ十二指腸に近づけます。また、注射中はアガロースが針の中ですぐに固まるので、プランジャーを押し下げるのをやめないでください。急性マウス膵臓組織スライス技術は、パッチクランプ法とともに使用して、イオンチャネル電流を研究し、細胞症にアクセスし、免疫組織化学研究および秘書研究を行うこともできる。

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

生細胞におけるストア作動性カルシウムエントリの蛍光ベースの測定：培養癌細胞から骨格筋線維に

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

共焦点および多光子顕微鏡を用いて5蛍光タンパク質によってマーク造血幹細胞および前駆細胞の生体内でクローン追跡で

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

細胞外マトリックスを視覚化するために浸軟組織の電子顕微鏡をスキャンします

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

生体内での実時間追跡レーザー顕微鏡による眼房内で胸腺細胞

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

マウス膵島細胞の亜集団におけるカルシウムダイナミクスのイメージング

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

蛍光生細胞顕微鏡によるミトティック・マイオシス酵母核ダイナミクスの検討

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

生体組織試料のシリアルブロック顔走査電子顕微鏡(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

生きた酵母細胞におけるミトコンドリア過酸化物のレシオメトリックバイオセンサーmtHyPer7のイメージング

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

倒立共焦点顕微鏡での上皮組織動態を長期モニタリングするための合理化された生体内イメージングアプローチ

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

共焦点顕微鏡、画像取得セットアップ、および共焦点顕微鏡イメージングのための生物学的サンプル調製