Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Arbeidet som ble presentert i denne studien ble økonomisk støttet av Det slovenske forskningsbyrået (forskningskjernefinansieringsnr. P3-0396 og I0-0029, samt forskningsprosjekt nr. J3-9289, N3-0048 og N3-0133) og av Det østerrikske vitenskapsfondet / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bilaterale tilskudd I3562--B27 og I4319--B30). Vi takker Maruša Rošer, Maša Čater og Rudi Mlakar for utmerket teknisk assistanse.

Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av kommersiell eller økonomisk interesse.

Bukspyttkjertelvevsskivemetoden er en rask eksperimentell metode for å studere morfologien og fysiologien til de endokrine og eksokrine delene av bukspyttkjertelen i en mer bevart, in situ forberedelse. Mange av fordelene er allerede påpekt i innledningen. Det er verdt å påpeke at generelt (dvs. ikke bare for kalsiumavbildning), sparer skivetilnærmingen for å studere bukspyttkjertelfysiologi tid fordi det ikke innebærer en gjenopprettingsperiode etter isolasjon. Sistnevnte er ikke absolutt nødvendig med alle typer eksperimenter og bruk av isolerte holmer fra forskjellige arter, men brukes vanligvis til å øke renhet, gjenopprette levedyktighet og funksjonalitet, og noen ganger å samle holmer fra flere givere 59,60,61,62,63,64 . Men i sammenheng med kalsiumavbildning har betacelleresponser vist seg å avhenge av kulturens varighet og forhold, og dette er en viktig kilde til variasjon som bør tas i betraktning ved bruk av isolerte holmer15,65. Det samme problemet bør vurderes for vevsskiver hvis deres langsiktige kultur blir et mye brukt alternativ i fremtiden22,36. Vevsskivemetoden har også et høyt utbytte og reduserer dermed potensielt dyrelidelser og øker statistisk kraft. Videre kan så mange skiver fremstilles fra et enkelt dyr, og fordi skivene overlever i lange perioder, inkludert samme dyr eller til og med samme holme i både eksperimentelle og kontrollgruppene blir gjennomførbare.
Etter hvert som den opprinnelige arkitekturen og celle-til-celle-kommunikasjonen bevares, og fordi den er kompatibel med en rekke strukturelle analyser, elektrofysiologiske, avbildningsmetoder og hormonsekresjonsanalyser, er denne metoden spesielt nyttig for å studere bukspyttkjertelfunksjoner som er avhengige av uforstyrrede interaksjoner mellom individuelle celler, for eksempel følsomhet overfor secretagogues, paracrine og immuninteraksjoner mellom forskjellige celletyper, mønstre av elektrisk aktivitet, egenskaper av kalsiumdynamikk og sekresjon av forskjellige hormoner. For kalsiumavbildning spesielt er de viktigste fordelene ved å bruke skiver eksponeringen av holmekjernen og muligheten til å skaffe signaler fra mange forskjellige celletyper med høy oppløsning. Avhengig av kravene til eksperimentet og dyrenes alder, kan tykkelsen varieres, skivene kan transfekeres, eller oppnås fra dyr med genetisk kodede reportere. Som forklart mer detaljert nedenfor, muliggjør de to sistnevnte tilnærmingene også spesifikk funksjonell identifikasjon og karakterisering av svar fra ikke-betaceller 31,66. Videre kan holmer fra veldefinerte deler av orgelet studeres for forskjeller i respons eller følsomhet for sykdom. Selv om de ikke krever en utvinning inkubasjonsperiode, kan de lett inkuberes med forskjellige farmakologiske midler, fettsyrer, høy glukose og cytokiner.
Viktigst, da høy oppløsning er oppnåelig i kombinasjon med encellet eller til og med subcellulær oppløsning, er konfokal kalsiumavbildning i skiver en av de mest egnede metodene for å analysere kalsiumbølger, funksjonell tilkobling og de forskjellige funksjonelle rollene til celler i forskjellige deler av en holme54,67. Til tross for en rekke fordeler har vevsskivetilnærmingen viktige begrensninger. For det første er det fortsatt delvis forstyrrende for holme- og eksokrine arkitektur, spesielt på kuttoverflaten, og forholdsregler, for eksempel lav temperatur, hyppig utveksling av løsninger og mild og rask manipulering, er nødvendig under forberedelsen for å forhindre ytterligere mekanisk og endogen enzymatisk skade. For det andre er mønstrene for nærings- og secretagogue-levering fortsatt dårligere enn in vivo-ruten, preparatet er løsrevet fra systemisk innervering, og interorgantilbakemelding, som mellom holmen og målvevet, er umulig, i motsetning til in vivo-tilnærminger. For det tredje er maksimal skivetykkelse begrenset av oksygenering, næringstilførsel og pH-regulering ved ~ 200 μm9. Videre trenger både forberedelse av skiver og avbildning mye trening, og grundige analyser av kalsiumdata fra lange tidsserier og fra mange celler krever spesialisert kunnskap som ofte ikke er inkludert i verktøysettet til en klassisk fysiolog og krever hjelp fra fysikere eller dataforskere. Fordelen med at homo- og heterotypiske interaksjoner bevares, kan også komplisere analysen av prøver på grunn av tilstedeværelsen av signaler fra andre celler i interesseområder. Avhengig av protokoller kan aktivering av andre celler føre til indirekte ytterligere stimulering eller hemming av en observert celle.
Dette kan bare løses avgjørende ved dekonvolusjonstilnærminger, ved mer komplekse stimuleringsprotokoller, inkludert stoffer som blokkerer noen av de indirekte effektene, ved å bruke spesifikke knock-out dyr, og ved nøye sammenligning av resultater med resultater fra andre studier som bruker mer reduksjonistiske metoder. I tillegg, hvis sekresjonsmålinger er nødvendige, bør du huske på at noen skiver kan mangle holmer, og den totale massen av endokrine vev i en enkelt skive er vanligvis lav. Utarbeidelsen av akutte bukspyttkjertelvevsskiver for avbildning innebærer flere kritiske trinn som er omtalt i avsnittene nedenfor og oppsummert i tabell 1, der leseren også kan finne korte, men viktige tips for feilsøking. Først, når du forbereder agaroseoppløsningen, må agarosepulveret oppløses helt, ellers kan de uløste partiklene hindre injeksjonen. Hold den homogene agaroseoppløsningen ved 37-45 °C for å forhindre herding av agarose på grunn av for lav temperatur på den ene siden og for å forhindre vevsskader på grunn av for høye temperaturer på den annen side. Etter bruk kan den gjenværende agarose lagres ved 4 °C og varmes opp igjen, selv om gjentatt oppvarming kan føre til økt tetthet på grunn av vannfordampning, noe som til slutt gjør injeksjonen vanskelig eller umulig.
Det neste kritiske trinnet i preparatet er å klemme den store duodenale papillaen riktig. En hvit flekk på tolvfingertarmen indikerer krysset mellom den vanlige gallekanalen og tolvfingertarmen. En klemme plassert for proksimalt vil resultere i hindring av noen laterale bukspyttkjertelgrener av den vanlige kanalen, deaktivere injeksjonen av disse delene, mens en klemme plassert for distalt vil føre til at agarose lekker gjennom den nedre motstandsbanen direkte inn i tolvfingertarmen. Før kanalisering av den vanlige gallekanalen kan det omkringliggende fettvevet forsiktig fjernes for bedre visualisering av kanalen og større kontroll under injeksjon. Utilstrekkelig presisjon under fjerning av det omkringliggende vevet kan føre til perforering av kanalen. Valget av nålediameteren som brukes til agarose injeksjon er også viktig. Hos mus brukes en 30 G nål fortrinnsvis; mindre (32 eller 33 G) nåler krever mer innsats på grunn av høy viskositet av agaroseoppløsningen og er mer utsatt for obstruksjon. Men hvis de brukes i kombinasjon med en agaroseløsning med lavere tetthet, kan de være svært nyttige i mindre musestammer og yngre dyr. I løpet av de første barseldagene kan agarose alternativt injiseres subkapsulært i stedet for intraductally2. Bruk av nåler med større diameter hos mus vil mest sannsynlig føre til skade på den vanlige gallekanalen. Dette kan også skje med riktig nåleediameter, og en tang kan bidra til å holde nålen på plass under injeksjon. Nåler med større diameter kan være den eneste løsningen i tilfelle større kanaler, som finnes hos rotter. Hvis nålen er for smal til å sikre en tett forsegling som forhindrer tilbakelekkasje, kan en ligatur plasseres rundt den ved vellykket inntreden i kanalen.
Agarose injeksjon tar litt innsats på grunn av løsningens viskositet, og når injeksjonsprosessen har startet, bør den ikke avbrytes da den lavsmeltende agaroseoppløsningen kan størkne i nålen eller de største delene av kanaltreet før injeksjonen er fullført. Dette vil resultere i dårlig vev penetrasjon og verre støtte under kutting. Kanalen skal alltid være kanylert på det punktet hvor venstre leverkanal og den cystiske kanalen kobles sammen for å danne den vanlige gallekanalen.. Hvis den vanlige gallekanalen blir perforert, prøv gjentatte ganger å cannulating nærmere tolvfingertarmen. Når bukspyttkjertelen er tilstrekkelig stabilisert med agaroseoppløsning og ekstrahert fra bukhulen, kuttes små biter av godt injisert vev. Før du legger dem inn i agarose, er det avgjørende å fjerne alle fett- og bindevevene når rester gjør kuttingen mer utfordrende. Det samme gjelder blodkar og kanalrester, unntatt når de er fokus for eksperimentet. I dette tilfellet må du sørge for å plassere dem på en slik måte at ønsket tverrsnitt vil bli oppnådd. Når du legger inn vevet i agarose, må du sørge for at temperaturen er passende (37 °C), og at vevet er helt omgitt av agarose, da krefter under vibratom kutting kan rive ut bukspyttkjertelvevet fra de agarose blokkene.
Rask tørking av vevsblokkene før du plasserer dem i agarose ved å plassere dem kort på et papirvev, kan bidra til å forhindre dårlig kontakt mellom vev og agarose i løpet av dette trinnet. Under størkning av agarose blokker, plasser Petri parabolen horisontalt, og forhindre kontakt mellom bukspyttkjertelen vev og bunnen av Petri parabolen. Hvis bukspyttkjertelen ikke injiseres helt, vil skjæreprosessen være utfordrende. Prøv derfor å redusere skjærehastigheten for å oppnå vevsskiver. For å minimere celleskader under vibratom kutting, bytt ut ECS (og isbitene laget av ECS) regelmessig i skjærekammeret. Sistnevnte vil redusere aktiviteten til bukspyttkjertelenzymer frigjort fra acinarvev under kutting. Tykkelsen på skivene er også av avgjørende betydning. For kalsiumdynamikk og elektrofysiologiske eksperimenter blir 140 μm skiver vanligvis kuttet; Men i henhold til målet med studien kan skivetykkelsen variere fra 90 μm til 200 μm. Husk at i tykkere skiver vil diffusjonen av oksygen og næringsstoffer være begrenset, men de vil inkludere mer vev. I tillegg kan andelen uklippede holmer forventes å øke med økende skivetykkelse. Skiver kan lagres i en regelmessig byttet ECS ved romtemperatur i flere timer eller til og med dyrkes i et passende cellemedium i flere dager; Dette kan imidlertid til slutt påvirke den normale holmecellefysiologien 3,22.
Når du forbereder fargestoffløsningen, må du sørge for forsiktig blanding av alle komponenter, og unngå eksponering for omgivelseslys. Bukspyttkjertelskiven består av mange cellelag, og opptaket av kalsiumfarge er begrenset til de første mest overfladiske cellelagene, som beskrevet tidligere for isolerte holmer58,68 og hypofyseskiver69. Men i motsetning til isolerte holmer der den omkringliggende kapselen og ytre cellelag hindrer penetrasjon av fargestoffet i dypere lag, gir vevsskiver tilgang til hele tverrsnittsoverflaten av holmen, noe som muliggjør samtidig måling av kalsiumdynamikk i hundrevis av celler fra alle lag av en holme. Fluorescerende Ca2+ indikatorer er de mest brukte for måling av kalsiumdynamikk, og sammen med CLSM muliggjør de opptak med høy temporal oppløsning, og når flere hundre Hertz. Når du velger den mest passende fluorescerende Ca2+ indikatoren, bør du vurdere forskjellige faktorer, inkludert indikatorformen, som påvirker cellelastemetoden, målemodus (kvalitativ eller kvantitativ) og dissosiasjonskonstant (Kd) som må være i Ca2 + konsentrasjonsområdet av interesse og avhenger av pH, temperatur, tilstedeværelse av Mg2 + og andre ioner, samt proteinbinding. Siden cellulære Ca2+-signaler vanligvis er forbigående, bør ca2+ bindingshastighetskonstanten også vurderes. For måling av [Ca2+]IC-dynamikken i bukspyttkjertelceller bruker denne gruppen hovedsakelig den cellegjennomtrengelige Ca2+ indikatorfargen som er beskrevet i denne protokollen (Materialtabell), da det er en lang bølgelengdeindikator med utslippsbølgelengdene i spekteret der cellulær autofluorescence vanligvis er mindre problematisk, og energien til eksitasjonslys er lav, noe som reduserer potensialet for cellulær fotodamage. Fordi dette fargestoffet er fluorescerende ved lave Ca2+ konsentrasjoner, letter dette bestemmelsen av baseline [Ca2 +]IC og øker cellulær synlighet før stimulering. Etter å ha tilsagt Ca2+, øker fluorescensintensiteten til fargestoffet 14 ganger, noe som muliggjør påvisning av selv små endringer i [Ca2+]IC.
For vellykket kalsiumavbildning i levende celler må flere viktige maskinvareparametere vurderes, som beskrevet i protokolldelen. For levende celleavbildning der signalamplituder er lave og sjansene for fototoksisitet er høye, brukes mål med høyere NA fortrinnsvis til å samle mer lys fra prøven. Hvis kalsiumdynamikk må registreres med høy temporal oppløsning, bruk resonansskanneren i stedet for lineære galvanisometre. I tillegg til å velge riktig mål, unngår bruk av svært følsomme detektorer - for eksempel hybriddetektorer som krever mindre laserkraft, fototoksisitet og fotobleaching. Dette er av spesiell betydning for langvarig kalsiumavbildning. Andre viktige trinn i kalsiumavbildning er parameterinnstillinger for bildekvalitet for tidsserieanskaffelser. De viktigste er den tidsmessige og romlige oppløsningen. Ettersom kalsiumdynamikken i seg selv bestemmer den laveste akseptable temporale oppløsningen, må samplingsfrekvensen være minst to ganger høyere enn forventet signalfrekvens for å oppdage signalet eller til og med 10 ganger høyere for å oppdage formen på signalet pålitelig. I akutte bukspyttkjertelvevsskiver kan kalsiumdynamikk måles i hundrevis av celler samtidig, og derfor er den romlige oppløsningen også viktig. Dette kan forbedres ved å øke antall piksler eller ved å øke linjegjennomsnittet under direkte anskaffelse. På grunn av det inverse forholdet mellom den romlige og den tidsmessige oppløsningen er det imidlertid nødvendig med en avveining mellom begge innstillingene.
Hvis kalsiumavbildning må utføres i en bestemt cellepopulasjon i bukspyttkjertelen, er det nødvendig med en stimulans som kan skille cellene i stykket funksjonelt. Høy glukose reliably og raskt aktiverer betaceller til et oscillatorisk mønster som er lagt på et forhøyet kalsiumnivå og er svært synkronisert blant alle celler i en holme 32,58,70. Betacellene er den mest tallrike celletypen i en holme og ligger for det meste i holmekjernen hos mus. Den samme stimuleringsprotokollen reduseres og endrer noen ganger ikke sprengningen i alfaceller 30,32,58,70,71,72. For å diskriminere alfaceller funksjonelt, kan lav (3 mM) glukose, glutamat eller adrenalin brukes til å øke frekvensen eller basal [Ca2+]IC 21,72,73,74,75. De representerer 10-20% av holmecellene og vil bli oppdaget på holmen periferi1. Deltaceller finnes også i periferien. De utgjør bare ~ 5% av det totale antallet endokrine celler i en holme og er vanligvis aktive i 6 mM glukose og reagerer på glukosestimulering med økt uregelmessig sprengningsaktivitet fra grunnlinjen eller et litt forhøyet kalsiumnivå 1,32,71,76. Ghrelin kan brukes til spesifikk stimulering av deltaceller 21,77,78,79 i kalsiumavbildningsforsøk. Protokoller for spesifikk funksjonell identifikasjon av PP- og epsilonceller gjenstår imidlertid å definere. Videre aktiverer 25 nM acetylkolin pålitelig acinarceller til sprengningsaktivitet 35,80,81. I tillegg kan en rekke andre secretagogues, som cerulein, cholecystokinin og karbamylcholine, brukes til å fremkalle kalsiumresponser i acinarceller 22,40,82,83.
Til slutt fremkaller 1 mM kenodeoksykolsyre pålitelig kalsiumresponser i kanalceller i vevsskiver; angiotensin II, ATP og noen andre secretagogues kan også brukes 11,23,84,85. Når en funksjonell identifikasjon basert på karakteristiske responser på spesifikke sekretesse og hemmere ikke er tilstrekkelig, kan genetisk merkede dyr31, transfekterte celler73 eller immunocytokjemi brukes til identifisering av forskjellige celletyper 9,22,71,86 . I løpet av de siste par årene har vevsskivemetoden blitt vellykket tilpasset menneskelig vev, og åpnet mange nye viktige forskningsveier i både eksokrine41 og endokrine fysiologi 9,36,37,39. Interessant nok har en detaljert vurdering av kalsiumdynamikk i menneskelige holmer vært notorisk vanskelig og gjenstår å undersøke nærmere87. Kombinert med avansert konfektmikroskopi har pankreasvevsskivemetoden gjort det mulig for mange nye innsikter i kalsiumdynamikken hos mus og vil forhåpentligvis gjøre det samme for menneskelig vev.

Pattedyr bukspyttkjertelen er en stor eksokrine og endokrine kjertel. Eksokrindelen utgjør 96-99% av det totale bukspyttkjertelvolumet og består av akini og kanaler. Den endokrine delen består av et stort antall holmer av Langerhans som står for de resterende 1-4% av det totale bukspyttkjertelen volum1. Eksokrindelen skiller ut store fordøyelsesenzymer som bryter ned energirike polymerer i mat, samt en bikarbonatrik væske, som kombineres med andre gastrointestinale sekreter for å gi et miljø som passer for virkningen av enzymer. Den endokrine delen skiller ut hormoner som regulerer postprandial distribusjon, lagring og interprandial frigjøring av energirike næringsstoffer. Selv om eksokrine vevet er relativt underutviklet og endokrine relativt godt utviklet ved fødselen, overgroder førstnevnte raskt sistnevnte ved avvenning 2,3,4. Tidlige studier av bukspyttkjertelfunksjon markerte fødselen av moderne fysiologi, og store metodologiske fremskritt på feltet har blitt etterfulgt av store vitenskapelige breaktroughs5. Å jobbe med bukspyttkjertelen er teknisk utfordrende på grunn av den intrikate strukturen i kjertelen, men er også en stor motivasjon på grunn av sykdommer som bukspyttkjertelkreft, pankreatitt og diabetes som presenterer store trusler mot folkehelsen, og for hvilke nye terapeutiske tilnærminger som trengs.
Isolerte holmer6, acini 7,8 og kanalfragmenter hadde blitt utviklet og brukt i flere tiår som gullstandardmetoder på grunn av deres fordeler sammenlignet med cellelinjer og primære dispergerte endokrine, acinar og kanalceller 9,10. Til tross for den markant forbedrede funksjonen til isolerte cellekollektiver, innebærer disse metodene fortsatt betydelig mekanisk og enzymatisk stress, isolerer celler fra det omkringliggende vevet og mangler dermed parakrineinteraksjoner og mekanisk støtte, og viktigst av alt, ledsages av betydelige endringer i normal fysiologi 11,12,13 . Den akutte pankreasvevsskiven for mus ble utviklet i 2001 av et opplevd behov for å utvikle en eksperimentell plattform som ligner på hjerne-, hypofyse- og binyreskiver med bevarte intercellulære kontakter, parakrineinteraksjoner, mesenchyme og vevsarkitektur, samt uten noen av de viktigste manglene i gullstandardmetoden i holmeforskning av den tiden- de isolerte holmene12, 14. Blant disse manglene er skade på de ytterste lagene, mangel på tilgjengelighet av kjerne holmeområder, og behovet for dyrking med muligens viktige effekter på celleidentitet og fysiologi12,15. Videre muliggjør vevsskivemetoden studier på dyremodeller med grovt forstyrret holmearkitektur der det er umulig å isolere holmer, eller når holmeutbyttet er ekstremt lavt ved tradisjonell isolasjon 16,17,18,19,20,21.
I tillegg er stykket mer egnet for å studere morfologiske endringer under utvikling av diabetes og pankreatitt, for eksempel, da det gir en bedre oversikt over hele vevet og er også kompatibel med å studere regionale forskjeller. Viktig, til tross for det tidlige fokuset på den endokrine delen, muliggjør vevsskivemetoden iboende studiet av de eksokrine komponentene 9,22,23. I løpet av det første tiåret etter introduksjonen ble metoden brukt til elektrofysiologiske studier av beta 14,24,25,26,27,28,29 og alfa 30,31 celler samt for å undersøke morfologiske og funksjonelle modning av bukspyttkjertelen 2,3 . Et tiår senere i 2013 ble metoden vellykket tilpasset for levende celle kalsiumavbildning av holmeceller ved hjelp av CLSM for å karakterisere deres respons på glukose32, deres funksjonelle tilkoblingsmønstre33, og forholdet mellom membranpotensial og intracellulært kalsium ved å kombinere en fluorescerende kalsiumfarge med et membranpotensialfargestoff 34. Senere samme år ble metoden også brukt til å vurdere kalsiumdynamikk i acinarceller22,35. I løpet av de følgende årene har bukspyttkjertelvevsskiver blitt brukt i en rekke forskjellige studier og vellykket tilpasset gris og menneskelig vev 9,36,37,38,39,40,41. Men samlet sett er kalsiumavbildning-i-mus bukspyttkjertelvev skiver generelt og i holmer spesielt -er fortsatt for det meste utført av denne gruppen. En av hovedårsakene til dette kan ligge i kombinasjonen av en teknisk utfordrende vevsskiveforberedelse, behovet for et konfokalt mikroskop og ganske kompleks dataanalyse. Hovedmålet med det nåværende papiret er å gjøre denne kraftige metoden mer tilgjengelig for andre potensielle brukere.
Det er allerede noen gode metodologiske artikler som omhandler i detalj med vevsskiveforberedelse og bruk av skiver til strukturelle og sekresjonsstudier, men ikke for konfikal kalsiumavbildning 9,42,43. Derfor fokuserer dette papiret på noen ekstra tips og triks under utarbeidelsen av skiver, på trinn som er kritiske for vellykket fargeinnlasting, bildeanskaffelse, samt på hovedtrinnene i grunnleggende kalsiumdataanalyse. Derfor bør dette bidraget ses på som komplementært til i stedet for som et alternativ for ovennevnte metode. På samme måte skal kalsiumavbildning i pankreasvevsskiver for mus ses på som en eksperimentell tilnærming som skal brukes til å svare på spesifikke spørsmål og er dermed komplementært til snarere enn et absolutt alternativ for andre kalsiumavbildningsmetoder i bukspyttkjertelfysiologi som isolerte kanaler eller akini, isolerte holmer, organoider, holmer transplantert inn i øyets fremre kammer, og innspillinger in vivo 11,44,45,46,47,48. Løftet om kalsiumavbildning i pankreasvevskiver hos mus er sannsynligvis best illustrert ved nylige vellykkede registreringer av kalsiumdynamikk i holmemesenchymale celler som pericytter49 og makrofager50, samt i kanalceller23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

Den akutte pankreasvevsskiven for mus bukspyttkjertelen er et unikt in situ-preparat med bevart intercellulær kommunikasjon og vevsarkitektur som medfører betydelig færre forberedelsesinduserte endringer enn isolerte holmer, akini, kanaler eller dispergerte celler beskrevet i typiske in vitro-studier. Ved å kombinere den akutte bukspyttkjertelvevsskiven med levende celle kalsiumavbildning i konfokal laserskanningsmikroskopi (CLSM), kan kalsiumsignaler studeres i et stort antall endokrine og eksokrine celler samtidig, med en enkeltcellet eller til og med subcellulær oppløsning. Følsomheten tillater påvisning av endringer og muliggjør studiet av intercellulære bølger og funksjonell tilkobling samt studiet av avhengigheten av fysiologiske responser av celler på deres lokalisering innenfor holme- og parakrineforholdet med andre celler. Til slutt, fra dyrevelferdsperspektivet, senker registreringen av signaler fra et stort antall celler om gangen antall dyr som kreves i eksperimenter, noe som bidrar til 3R-erstatnings-, reduksjons- og raffineringsprinsippet.

Injeksjonen av agaroseoppløsningen i bukspyttkjertelkanalen er det mest kritiske trinnet i pankreasvevsskivepreparatet. En vellykket injeksjon kan gjenkjennes ved bleking av bukspyttkjertelen vev, som sett på venstre side av figur 3A, mens en ufullstendig injisert del av bukspyttkjertelen presenteres på høyre side av figur 3A. Langerhans holmer kan gjenkjennes av det blotte øye eller under et stereomikroskop, og dette hjelper til med å kutte de riktige delene av bukspyttkjertelen for etterfølgende innbygging i agaroseblokker (figur 3B). I en nykuttet pankreasvevsskive for mus kan holmer av Langerhans lett skille seg fra det omkringliggende eksokrinevevet og mesenchymet som hvite flekker under stereomikroskopet (figur 3C) eller som brune strukturer under lysmikroskopet (figur 3D). Bukspyttkjertelvevskivene kan brukes til forskjellige typer eksperimenter i minst 12 timer etter kutting. I tillegg til den grove morfologiske vurderingen under stereomikroskopet, lysmikroskopet og de funksjonelle responsene til celler under kalsiumavbildning, kan levedyktigheten til bukspyttkjertelvevskivene vurderes (figur 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Figur 4: Levedyktigheten til celler i vevsskiven. Levedyktigheten til celler ble bestemt med Live/Dead-analysen. Levende celler er farget av Calcein AM (vist i grønt), mens døde celler er farget med ethidium homodimer-1 (vist i rødt). Gule linjer angir plasseringen av X-Y-tverrsnittet i Z-stabelen som vises nederst og til høyre. Hele dybden på Z-stabelen er 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
For kalsiumavbildningsforsøk må fluorescerende kalsiumindikator trenge gjennom noen få lag med celler. Figur 5A presenterer vellykket lasting av den cellegjennomtrengelige Ca2+ indikatorfargen i bukspyttkjertelvevsskiven der individuelle holme- og acinarceller kan gjenkjennes. I motsetning er skiver i figur 5B-D ikke optimale på grunn av mislykket penetrasjon av fargestoffet (figur 5B), mangel på holmeceller (figur 5C) og mye nekrotisk vev på overflaten (figur 5D). Slike skiver kan kastes, kontrolleres for tilstedeværelse av ekstra holmer som er kuttet eller farget bedre (se tabell 1 for feilsøking), eller brukes til å registrere svarene til eksokrine celler.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Figur 5: Eksempler på brukbare og ubrukelige preparater. (A) Et eksempel på en vellykket fremstilling av bukspyttkjertelen vevsskive med godt fargede celler i langerhans holmer, samt ductalceller og omkringliggende acinar vev. (B) Et eksempel på en dårlig farget vevsskive. (C) Eksempel på en holme av Langerhans med strukturelle seponeringer. (D) Et eksempel på en holme av Langerhans som inneholder mange døde celler og mye rusk. Oppslagstabellen "glow-over, glow-under" til høyre viser 0 intensitet i grønt og metning i blått. Skalalinje = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Representative resultater fra kalsiumavbildning ved bruk av det cellegjennomtrengelige Ca2+ -indikatorfargen er vist i figur 6. I figur 6A presenteres et høyoppløselig bilde av en bukspyttkjertelvevskive, som inneholder en holme av Langerhans, acinarvev og en bukspyttkjertelkanal. For bedre distinksjon er den endokrine, eksokrine og kanalbaserte delen av bukspyttkjertelen vevsskive presentert i figur 6A farget i figur 6B. Bruk av passende stimuli kan funksjonelt diskriminere mellom forskjellige holmeceller, eller holme og ikke-holmeceller51. Betaceller vil vanligvis reagere på en firkantet pulsstimulering av glukose med en forbigående økning i [Ca. 2+]IC etterfulgt av raske kalsiumsvingninger på et vedvarende platå (figur 6C, øvre panel).
Siden alle betaceller er koblet til et enkelt, stort, funksjonelt synytium, er disse svingningene også svært godt synkronisert mellom forskjellige celler ved å spre [Ca2+]IC-bølger 32,34,52,53,54 (figur 7C). Langsommere [Ca2+]IC-svingninger med en periode på 5-15 minutter kan ligge til grunn for de raske svingningene eller til og med være den dominerende typen reponse55,56. Den samme enkle protokollen kan avsløre andre typer svar, spesielt i periferien av holmer (figur 6C, nedre panel). Siden disse cellene ikke er synkronisert med betaceller og reagerer med raskere og mer uregelmessige svingninger som allerede er til stede under lave glukoseforhold eller med en reduksjon i aktiviteten, er slike svar svært antydende for ikke-betaceller 21,32,57,58. Imidlertid krever deres definitive funksjonelle karakterisering mer komplekse protokoller med ekstra stimuleringstrinn eller alternative tilnærminger, som diskuteres nedenfor. Typiske responser av acinar- og kanalceller presenteres i henholdsvis figur 6D og figur 6E. Se litteraturen for mer informasjon om acinar og kanalceller 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Figur 6: Representative resultater av kalsiumdynamikk i distinkte typer bukspyttkjertelceller. (A) Et høyoppløselig bilde av en holme av Langerhans med omkringliggende vev. Skala bar = 100 μm. (B) Avgrensning av distinkte deler av bukspyttkjertelen vev med acinar vev vist i gult, en holme av Langerhans vist i rødt, og et segment av kanaltreet i blått. Skala bar = 100 μm. (C) Typiske spor av kalsiumdynamikk i beta og putative ikke-betaceller under stimulering med 12 mM glukose; 3 mM glukose ble brukt til ikke-stimulatoriske forhold. Protokoller som kan brukes til mer spesifikk diskriminering av ikke-betaceller, er beskrevet i diskusjonsdelen. (D) Et typisk spor av kalsiumdynamikk i acinarceller stimulert med 25 nM acetylkolin. (E) Et typisk spor av kalsiumdynamikk i kanalceller stimulert av 1 mM kenodeoksykolsyre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Etter vellykket kalsiumavbildning eksporteres og korrigeres dataene først for bleking ved en kombinasjon av eksponentiell og lineær passform, som beskrevet i protokolldelen. En tidsserie før og etter blekingskorreksjon presenteres i figur 7A. Deretter kan flere parametere i aktiverings- og deaktiveringsfasen av responsen samt platåfasen analyseres. En forsinkelse i utbruddet av [Ca. 2+]IC-økning etter stimulering kan måles som representert ved forsinkelseA i figur 7B og heterogeniteten i forsinkelser mellom enkeltceller (forsinkelseA1). De samme parameterne (forsinkelseD og forsinkelseD1) kan brukes til å beskrive deaktiveringsfasen. Etter den første forbigående [Ca2+]IC-økningen er platåfasen i de fleste bukspyttkjertel betaceller i en holme preget av relativt vanlig høy frekvens [Ca. 2+]IC-svingninger . Platåfasen kan beskrives ved å analysere de klassiske funksjonelle parametrene. Den skjematiske presentasjonen av [Ca. 2+]IC-svingninger , varighet, frekvens og prosentandel av aktiv tid presenteres i figur 7C. Ved kalsiumavbildning med oppkjøpsrater høyere enn 10 Hz, kan kalsiumbølger som gjentatte ganger sprer seg over holmen også gjenkjennes tydelig (figur 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Figur 7: Analyse av tidsseriedata. (A) Retting av tidsseriedata for fotobleaching. (B) Analyse av aktiveringsforsinkelser etter stimulering og deaktivering etter opphør av stimulering med 12 mM glukose. Stimuleringsvarigheten er betegnet med den lysegrå, skyggelagte linjen i bildet. (C) Analyse av flere parametere i platåfasen: I) Svingningens varighet bestemt ved halvhøyde, II) frekvens av svingninger bestemt av inter-oscillasjonsintervaller. III) aktiv tid som et produkt av frekvens og varighet av svingninger. I-IV) Forsinkelser mellom svingninger i en gitt bølge av svingninger som sprer seg over langerhans holme bestemt av forsinkelsene (Δt) i tide der en enkelt celle når halv høyde av svingningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Tabell 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Klikk her for å laste ned denne tabellen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Vi presenterer forberedelsen av akutte bukspyttkjertelvev skiver og deres bruk i konfokal laser skanning mikroskopi for å studere kalsiumdynamikk samtidig i et stort antall levende celler, over lange tidsperioder, og med høy romlig løsning.

Confocal Laser Skanning Mikroskopi Av Kalsiumdynamikk i Akutt Mus Bukspyttkjertelen Vev Skiver

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

I kombinasjon med levende cellekalsiumavbildning muliggjør den akutte vevsskiveteknikken i bukspyttkjertelen studiet av intercellulære bølger og multicellulær funksjonell tilkobling med høy oppløsning over lange tidsperioder. De viktigste fordelene med denne teknikken er at den er rask, bevarer vevsarkitektur og reduserer begrenset enzymatisk og mekanisk stress samtidig som det opprettholder et høyt utbytte av vev. Ved å oppdage funksjonelle og morfologiske endringer under sykdomsprogresjon, hjelper denne teknikken vår forståelse av bukspyttkjertelen relaterte sykdommer, for eksempel diabetes.Denne vevsskiveteknikken kan brukes på hjerne-, hypofyse- og binyrevev med vekt på bevaring av intercellulær kontakt, parakriminelle interaksjoner og vevsarkitektur. For å forberede injeksjonen av agarose i musen bukspyttkjertelen, fyll en fem milliliter sprøyte med 40 grader Celsius væske agarose og utstyr sprøyten med en 30 gauge nål. Etter å ha dekket nålen forsiktig med en hette, plasser sprøytenålen ned, med hele volumet av agarose under vannoverflaten, i et 40 grader Celsius vannbad.Boble en flaske ekstracellulær løsning med carbogen, kontinuerlig på is, på 1,5 milliliter per minutt ved barometrisk trykk og romtemperatur for å sikre oksygenering og en pH på 7,4. For å utføre agarose injeksjon plasser en euthanized voksen mus under et stereomikroskop og få tilgang til musens underliv via laparotomi. Beveg tarmen forsiktig til venstre side for å eksponere den vanlige gallekanalen og bruk tang til å løfte den tolvte enden av kanalen litt for å finne papillen til Vater.Bruk en hemostat til å klemme gallekanalen på duodenal papilla for å forhindre lekkasje av agarose fra kanalen inn i tolvfingertarmen og bruk en liten skarp tang for å nå under den vanlige gallekanalen for å bryte membranen som fester kanalen til bukspyttkjertelen vev. Etter å ha fjernet så mye fett og bindevev fra kanalen som mulig, plasser kanalen vinkelrett på spissene til et par større tang, og trykk fast på sprøytestempelet, injiser den viskøse væsken agarose i den proksimale enden av den vanlige gallekanalen i 20 til 30 sekunder. Når vevet blir hvitt og litt distended fjerne sprøyten og sakte helle 20 milliliter av boblet iskald ekstracellulær løsning på bukspyttkjertelen for å avkjøle vevet og for å herde agarose.For å skaffe bukspyttkjertelvev skiver bruke tang og fine tøffe kutt saks for å forsiktig overføre agarose injisert bukspyttkjertelen i en 100 millimeter Petri tallerken som inneholder 40 milliliter iskald ekstracellulær løsning. Virvle retten for å skylle vevet og overføre bukspyttkjertelen til en annen tallerken med iskald ekstracellulær løsning. Bruk tang og saks til å kutte den hvite, godt injiserte bukspyttkjertelen i opptil seks 0,1 til 0,2 kubikkcentimeter stykker og fjern eventuelt gjenværende bindevev og fettvev fra vevsstykkene.Legg de rensede blokkene i en 35 millimeter ikke-klebrig bunn Petri-tallerken som inneholder omtrent fem milliliter 40 grader Celsius væske agarose og legg umiddelbart Petri-parabolen på is. Når agarose har herdet, hold Petri parabolen opp ned over lokket på en 100 millimeter Petri tallerken og bruk en halvdel av et barberblad for å forsiktig kutte i margen mellom den laterale veggen av Petri-parabolen og agarose for å fjerne agarose fra parabolen. Bruk barberbladet til å kutte individuelle terninger, som hver inneholder en vevsblokk av agarose, fra frigjort agarose og bruk cyanoacrylatlim for å feste blokkene til prøveplaten til en vibratom.Fyll skjærekammeret til vibratomet med 150 milliliter iskald ekstracellulær løsning som kontinuerlig bobles med karbogen. Skru prøveplaten på vibratomet og monter et nytt barberblad. Omgi kammeret med is og tilsett to isbiter på 10 milliliter volum laget med ekstracellulær oppløsning supplert med seks millimolarglukose.Sett sliceren til 0,05 til 1 millimeter per sekund og 70 hertz, og begynn deretter å kutte for å skaffe 140 mikron tykke agarose skiver med et 20 til 100 kvadrat millimeter overflateareal. Bruk en fin pensel til å overføre hver skive forsiktig til en 100 millimeter Petri-tallerken fylt med 40 millimeter HEPES-buffer supplert med seks millimolarglukose. For kalsiumfargepreparat, oppløs 50 mikrogram cellegjennomtrengelig kalsiumindikatorfargestoff, 7,5 mikroliter DMSO og 2,5 mikroliter poloksamer og 6,667 milliliter HBS i et 15 milliliter skruehetterør.Bruk en pipette for å blande løsningen grundig i 20 sekunder før du nedsenker røret i et ultralydbadkammer og virvel, hver i 30 sekunder. Deretter aliquot 3.333 milliliter av den resulterende kalsium indikator fargestoff løsning i en 5 milliliter Petri parabolen per 10 skiver vev som skal merkes. For fargestoffbelastning, bruk en tynn myk pensel for å overføre opptil 10 vevskiver til hver tallerken fargestoffløsning og legg oppvasken på en orbital shaker i 50 minutter ved romtemperatur og 40 omdreininger per minutt beskyttet mot lys.På slutten av inkubasjonen, overfør opptil 20 fargede skiver til individuelle 60 milliliter Petri-retter fylt med fargefri HBS. For kalsiumavbildning ved konfokal mikroskopi velg en 20 eller 25 ganger forstørrelse og sett oppkjøpsmodusen til tidsforløpavbildning, pinhole til 100 til 200 mikron, og eksitasjon og utslipp for fluoroforen som brukes i eksperimentet. Monter opptakskammeret og perfusjonssystemet på det temperaturkontrollerte stadiet av mikroskopet og plasser innløpet og utløpet på ytterkantene av opptakskammeret.Sett tilstrømnings- og utstrømningshastighetene til en til to milliliter per minutt. Sett temperaturen på profusionsystemet til 37 grader Celsius og initier profusionen med den ikke-stimulerende løsningen. For å registrere kalsiumdynamikken i vevet plasserer du en enkelt vevsskive i opptakskammeret og immobiliserer vevet med en U-formet platinavekt med et stramt nylonnett.Bruk lysfeltalternativet til å finne strukturen av interesse og bruke levende avbildning til å plassere de studerte strukturene i synsfeltet. Hvis du vil optimalisere signal-til-støy-forholdet, justerer du lasereffekten, detektorforsterkningen og linjegjennomsnittet for binning samtidig som lasereffekten holdes minimal. Juster fokusplanet til 15 mikron under den kuttede overflaten for å unngå opptak fra potensielt skadede celler og skaffe bildene.Innstilling av samplingsfrekvensen til en til to hertz for å tillate første deteksjon av individuelle svingninger og opptak av et høyoppløselig bilde. Hvis det er tilgjengelig, kan du bruke et elektronisk diagram for å få umiddelbar tilbakemelding om forberedelsesresponsen, overbelysning, fotobleaching og mekanisk drift. Når alle bildene er samlet inn, lagrer du dataene for senere analyse.Her kan et eksempel på en optimal vevsskive observeres der cellens gjennomtrengelige kalsiumindikatorfarge ble vellykket lastet inn i bukspyttkjertelen vevsskiven. I motsetning er disse vevsskivene ikke optimale for avbildning på grunn av enten en mislykket fargeinntrengning, mangel på holmeceller eller en overflod av nekrotisk vev på prøveoverflaten. Høyoppløselige bilder av en bukspyttkjertelvevsskive kan brukes til å avgrense forskjellige områder av bukspyttkjertelen vev, for eksempel holmer av Langerhans, acinar vev, eller bukspyttkjertelen kanal.Stimuli kan brukes til å diskriminere mellom ulike holmeceller eller mellom holmeceller og ikke-holmeceller. For eksempel reagerer betaceller vanligvis på en firkantet pulsglukosestimulering ved å vise en forbigående økning i intracellulært kalsium etterfulgt av raske kalsiumsvingninger på et vedvarende platå. I motsetning reagerer ikke-betaceller med raskere og mer uregelmessige svingninger.En forsinkelse i utbruddet av intracellulær kalsiumøkning etter stimulering, samt heterogenitet og forsinkelser blant individuelle celler kan også måles. De samme parameterne kan brukes til å beskrive deaktiveringsfasen. Her kan en skjematisk presentasjon av den intracellulære kalsiumoscillasjonsvarigheten, frekvensen og prosentandelen av aktiv tid observeres.Ved avbildning ved oppkjøpsrater større enn 10 hertz, kan kalsiumbølger som gjentatte ganger sprer seg over holmen, tydelig gjenkjennes. Klem den vanlige gallekanalen så nær tolvfingertarmen som mulig for å forhindre at grenen som kommer inn i bukspyttkjertelen ved et uhell okkluderer. Ikke slutt å trykke stempelet under injeksjonen fordi agarose umiddelbart vil herdes i nålen.Den akutte pankreasvevsskiveteknikken for mus kan også brukes med patchklemmemetoden for å studere ionkanalstrømmer og tilgang til cytose samt immunhiistokjemistudier og sekretærstudier.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Klonal Sporing av Hematopoetiske Stem og stamceller Preget av fem Fluorescent Proteiner bruker Confocal og multiphoton Mikros

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Skanning elektronmikroskopi av oppmalte Tissue å visualisere den ekstracellulære matriks

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Sanntid i Vivo sporing av Thymocytes i fremre kammer av øyet ved bruk av Laser mikroskopi

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Imaging kalsium Dynamics i subpopulasjoner av mus bukspyttkjertelen Holme celler

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Undersøkelse av mitotisk og Meiotic fisjon gjær Nuclear Dynamics av fluorescens Live-Cell mikroskopi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Seriell blokk-ansiktsskanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) av biologiske vevsprøver

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Avbildning av mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrielt peroksid, i levende gjærceller

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Strømlinjeformet intravital bildebehandlingstilnærming for langsiktig overvåking av epitelvevsdynamikk på et invertert konfokalmikroskop

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Biologiske prøver forberedelse for konfokal mikroskopi, bildeinnsamlingsoppsett og konfokalmikroskopiavbildning