Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

O trabalho apresentado neste estudo foi apoiado financeiramente pela Agência de Pesquisa eslovena (núcleo de pesquisa nos. P3-0396 e I0-0029, bem como projetos de pesquisa nos. J3-9289, N3-0048 e N3-0133) e pelo Fundo austríaco de Ciência / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (bolsas bilaterais I3562-B27 e I4319-B30). Agradecemos a Maruša Rošer, Maša Čater e Rudi Mlakar pela excelente assistência técnica.

Os autores declaram que a pesquisa foi realizada na ausência de qualquer interesse comercial ou financeiro.

O pâncreas mamífero é uma grande glândula exócrina e endócrina. A parte exócrina representa 96-99% do volume total do pâncreas e consiste em acini e dutos. A parte endócrina é composta por um grande número de ilhotas de Langerhans representando os 1-4% restantes do volume total do pâncreas1. A parte exócrina secreta grandes enzimas digestivas que quebram polímeros ricos em energia na comida, bem como um fluido rico em bicarbonato, que combina com outras secreções gastrointestinais para fornecer um ambiente adequado para a ação de enzimas. A parte endócrina secreta hormônios que regulam a distribuição pós-preria, o armazenamento e a liberação interprandial de nutrientes ricos em energia. Embora o tecido exocrino seja relativamente subdesenvolvido e o endócrino relativamente bem desenvolvido ao nascer, o primeiro rapidamente supera o último após o desmamar 2,3,4. Estudos iniciais da função pancreática marcaram o nascimento da fisiologia moderna, e os principais avanços metodológicos no campo têm sido seguidos por grandes quebra-panorticas científicas5. Trabalhar com pâncreas é tecnicamente desafiador devido à estrutura intrincada da glândula, mas também é uma grande motivação por causa de doenças como câncer de pâncreas, pancreatite e diabetes que apresentam grandes ameaças à saúde pública, e para as quais novas abordagens terapêuticas são necessárias.
Ilhotas isoladas6, acini 7,8 e fragmentos ductais foram desenvolvidos e utilizados por décadas como métodos padrão-ouro devido às suas vantagens em comparação com linhas celulares e células endócrinas, acinar e ductal 9,10 dispersas primárias. Apesar da função marcadamente melhorada dos coletivos celulares isolados, esses métodos ainda envolvem considerável estresse mecânico e enzimático, isolam as células do tecido circundante e, portanto, carecem de interações paracrinas e suporte mecânico, e o mais importante, são acompanhados por mudanças significativas na fisiologia normal 11,12,13 . A fatia aguda de tecido pancreático do camundongo foi desenvolvida em 2001 a partir de uma necessidade percebida de desenvolver uma plataforma experimental semelhante ao cérebro, pituitária e fatias suprarrenais com contatos intercelulares preservados, interações paracrinas, mesenquime e arquitetura tecidual, bem como sem algumas das deficiências mais importantes do método padrão ouro na pesquisa de ilhotas da época- ilhotas isoladas12, 14 anos. Entre essas deficiências estão danos nas camadas mais externas, falta de acessibilidade das áreas de ilhotas do núcleo e a necessidade de cultivo com efeitos possivelmente importantes na identidade celular e fisiologia 12,15. Além disso, o método de fatia de tecido permite estudos sobre modelos animais com arquitetura de ilhotas grosseiramente desordenada, onde é impossível isolar ilhotas, ou quando o rendimento da ilhota é extremamente baixo pelo isolamento tradicional 16,17,18,19,20,21.
Além disso, a fatia é mais adequada para estudar alterações morfológicas durante o desenvolvimento de diabetes e pancreatite, por exemplo, pois permite uma melhor visão geral de todo o tecido e também é compatível com o estudo de diferenças regionais. É importante ressaltar que, apesar do foco inicial na parte endócrina, o método de fatia de tecido permite inerentemente o estudo dos componentes exócrinos 9,22,23. Durante a primeira década após sua introdução, o método foi empregado para estudos eletrofisiológicos de células beta 14,24,25,26,27,28,29 e alfa 30,31, bem como para examinar a funcionalidade morfológica e maturada do pâncreas 2,3 . Uma década depois, em 2013, o método foi adaptado com sucesso para imagens de cálcio de células vivas de células ilhotas usando CLSM para caracterizar suas respostas à glicose32, seus padrões de conectividade funcional33, e a relação entre potencial de membrana e cálcio intracelular, combinando um corante de cálcio fluorescente com um corante potencial de membrana34. Mais tarde, no mesmo ano, o método também foi utilizado para avaliar a dinâmica do cálcio em células acinar22,35. Nos anos seguintes, as fatias de tecido pancreático têm sido utilizadas em diversos estudos e adaptadas com sucesso ao tecido suíno e humano 9,36,37,38,39,40,41. No entanto, juntos, as fatias de tecido pancreático de imagem de cálcio em geral e em ilhotas em particular - ainda é realizada principalmente por esse grupo. Uma das principais razões para isso pode estar na combinação de uma preparação tecnicamente desafiadora de fatias teciduais, a necessidade de um microscópio confocal e uma análise de dados bastante complexa. O principal objetivo do presente artigo é tornar esse método poderoso mais acessível a outros usuários em potencial.
Já existem alguns excelentes artigos metodológicos que tratam em detalhes com a preparação de fatias teciduais e o uso de fatias para estudos estruturais e de secreção, mas não para imagens de cálcio confocal 9,42,43. Portanto, este artigo foca em algumas dicas e truques adicionais durante a preparação de fatias, em etapas críticas para o sucesso do carregamento de tingimento, aquisição de imagem, bem como nos principais passos da análise básica de dados de cálcio. Portanto, essa contribuição deve ser vista como complementar e não como alternativa para o método acima mencionado. Da mesma forma, a imagem de cálcio em fatias de tecido pancreático de camundongos deve ser vista como uma abordagem experimental a ser usada para responder a perguntas específicas e, portanto, é complementar ao invés de uma alternativa absoluta para outras abordagens de imagem de cálcio na fisiologia pancreática, como dutos isolados ou acini, ilhotas isoladas, organoides, ilhotas transplantadas na câmara anterior do olho, e gravações in vivo 11,44,45,46,47,48. A promessa de imagem de cálcio em fatias de tecido pancreático de camundongos é provavelmente melhor ilustrada por gravações recentes bem sucedidas de dinâmica de cálcio em células mesenquimais de ilhotas, como pericítes49 e macrófagos50, bem como em células ductais23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

A fatia aguda de tecido pancreático do rato é uma preparação única in situ com comunicação intercelular preservada e arquitetura tecidual que implica significativamente menos alterações induzidas pela preparação do que ilhotas isoladas, acini, dutos ou células dispersas descritas em estudos in vitro típicos. Combinando a fatia aguda de tecido pancreático com imagens de cálcio de células vivas na microscopia de varredura a laser confocal (CLSM), os sinais de cálcio podem ser estudados em um grande número de células endócrinas e extrinas simultaneamente, com uma resolução única ou mesmo subcelular. A sensibilidade permite a detecção de alterações e permite o estudo de ondas intercelulares e conectividade funcional, bem como o estudo da dependência das respostas fisiológicas das células em sua localização dentro da ilhota e relação paracrina com outras células. Finalmente, do ponto de vista do bem-estar animal, o registro de sinais de um grande número de células em um momento reduz o número de animais necessários em experimentos, contribuindo para a substituição, redução e princípio de refinamento 3R.

A injeção da solução agarose no ducto pancreático é o passo mais crítico na preparação da fatia de tecido do pâncreas. Uma injeção bem sucedida pode ser reconhecida por um clareamento do tecido do pâncreas, como visto no lado esquerdo da Figura 3A, enquanto uma parte incompletamente injetada do pâncreas é apresentada no lado direito da Figura 3A. As ilhotas de Langerhans podem ser reconhecidas a olho nu ou sob um estereótipo, e isso ajuda a cortar as partes apropriadas do pâncreas para posterior incorporação em blocos de ágarose (Figura 3B). Em uma fatia de tecido pancreático de rato recém-cortada, as ilhotas de Langerhans podem ser facilmente distinguidas do tecido excerrino circundante e mesenchyme como manchas brancas sob o estereoscópio (Figura 3C) ou como estruturas acastanhadas sob o microscópio de luz (Figura 3D). As fatias de tecido pancreático podem ser usadas para tipos distintos de experimentos por pelo menos 12 h após o corte. Além da avaliação morfológica bruta sob o estereóscópio, o microscópio leve e as respostas funcionais das células durante a imagem de cálcio, a viabilidade das fatias de tecido pancreático pode ser avaliada (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Figura 4: Viabilidade das células dentro da fatia de tecido. A viabilidade das células foi determinada com o ensaio Live/Dead. As células vivas são manchadas por Calcein AM (mostrado em verde), enquanto as células mortas são manchadas com ethidium homodimer-1 (mostrado em vermelho). As linhas amarelas denotam a posição da seção transversal X-Y da pilha Z exibida na parte inferior e direita. A profundidade total da pilha Z é de 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Para experimentos de imagem de cálcio, o indicador de cálcio fluorescente precisa penetrar através de algumas camadas de células. A Figura 5A apresenta o carregamento bem sucedido do corante indicador Ca2+ permeável celular na fatia de tecido pancreático na qual as células individuais de ilhotas e acinar podem ser reconhecidas. Em contraste, as fatias na Figura 5B-D não são ótimas devido à penetração mal sucedida do corante (Figura 5B), falta de células de ilhotas (Figura 5C) e muito tecido necrosado na superfície (Figura 5D). Essas fatias podem ser descartadas, verificadas para a presença de ilhotas adicionais que são cortadas ou manchadas melhor (ver Tabela 1 para solução de problemas) ou usadas para registrar as respostas de células exócrinas.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Figura 5: Exemplos de preparações utilizáveis e inutilizáveis. (A) Um exemplo de uma preparação bem sucedida da fatia de tecido do pâncreas com células bem manchadas nas ilhotas de Langerhans, bem como células ductais e tecido acinar circundante. (B) Um exemplo de uma fatia de tecido mal manchada. (C) Exemplo de uma ilhota de Langerhans com descontinuações estruturais. (D) Um exemplo de uma ilhota de Langerhans contendo muitas células mortas e muitos detritos. A tabela de procura "glow-over, glow-under" à direita exibe 0 intensidade em verde e saturação em azul. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Os resultados representativos da imagem de cálcio utilizando o corante indicador Ca2+ permeável celular são mostrados na Figura 6. Na Figura 6A, é apresentada uma imagem de alta resolução de uma fatia de tecido pancreático, contendo uma ilhota de Langerhans, tecido acinar e um ducto pancreático. Para melhor distinção, a parte endócrina, exócrina e ductal da fatia de tecido pancreático apresentada na Figura 6A são coloridas na Figura 6B. O uso de estímulos apropriados pode discriminar funcionalmente entre diferentes células ilhotas, ou células ilhotas e não ilhotas51. As células beta normalmente responderão a uma estimulação de pulso quadrado por glicose com um aumento transitório no IC [Ca2+]seguido de oscilações rápidas de cálcio em um platô sustentado (Figura 6C, painel superior).
Como todas as células beta são acopladas a um único, grande e funcional síntio, essas oscilações também são muito bem sincronizadas entre diferentes células por meio da propagação [Ca2+]ONDAS IC 32,34,52,53,54 (Figura 7C). Oscilações mais lentas [Ca2+]IC com um período de 5-15 minutos podem estar por trás das oscilações rápidas ou mesmo ser o tipo predominante de reponse55,56. O mesmo protocolo simples pode revelar outros tipos de respostas, especialmente na periferia das ilhotas (Figura 6C, painel inferior). Como essas células não são sincronizadas com células beta e respondem com oscilações mais rápidas e irregulares que já estão presentes em baixas condições de glicose ou com uma diminuição da atividade, tais respostas são altamente sugestivas de células não beta 21,32,57,58. No entanto, sua caracterização funcional definitiva requer protocolos mais complexos com etapas adicionais de estimulação ou abordagens alternativas, que são discutidas abaixo. As respostas típicas das células acinar e ductal são apresentadas na Figura 6D e Figura 6E, respectivamente. Consulte a literatura para obter mais detalhes sobre as células acinar e ductal 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Figura 6: Resultados representativos da dinâmica do cálcio em tipos distintos de células pancreáticas. (A) Uma imagem de alta resolução de uma ilhota de Langerhans com tecido circundante. Barra de escala = 100 μm. (B) Delineamento de partes distintas do tecido pancreático com tecido acinar mostrado em amarelo, uma ilhota de Langerhans mostrada em vermelho, e um segmento da árvore ductal em azul. Barra de escala = 100 μm. (C) Traços típicos da dinâmica do cálcio em células beta e putativa não beta durante a estimulação com glicose de 12 mM; A glicose de 3 mM foi utilizada para condições não estimulantes. Protocolos que podem ser usados para discriminação mais específica de células não beta são descritos na seção de discussão. (D) Um traço típico da dinâmica do cálcio das células acinar estimulada por acetilcolina de 25 nM. (E) Um traço típico da dinâmica do cálcio das células ductais estimulada por ácido chenodeoxíclico de 1 mM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Após o sucesso da imagem de cálcio, os dados são primeiro exportados e corrigidos para branqueamento por uma combinação de um ajuste exponencial e linear, conforme descrito na seção de protocolo. Uma série temporal antes e depois da correção do branqueamento é apresentada na Figura 7A. A partir daí, podem ser analisados vários parâmetros na fase de ativação e desativação da resposta, bem como a fase do planalto. Um atraso no início do aumento do IC [Ca2+]após a estimulação pode ser medido como representado pelo atrasoA na Figura 7B e pela heterogeneidade em atrasos entre células individuais (atrasoA1). Os mesmos parâmetros (atrasoD e atrasoD1) podem ser usados para descrever a fase de desativação. Após o aumento transitório inicial [Ca2+]IC, a fase do planalto na maioria das células beta pancreáticas em uma ilhota é caracterizada por oscilações relativamente regulares de alta frequência [Ca2+]IC. A fase do planalto pode ser descrita analisando os parâmetros funcionais clássicos. A apresentação esquemática das oscilações de IC [Ca2+]duração, frequência e percentual de tempo ativo são apresentadas na Figura 7C. Na imagem de cálcio com taxas de aquisição superiores a 10 Hz, ondas de cálcio que se espalham repetidamente pela ilhota também podem ser reconhecidas claramente (Figura 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Figura 7: Análise dos dados da série temporal. (A) Correção dos dados da série temporal para fotobleaching. (B) Análise dos atrasos na ativação após a estimulação e à desativação após a cessação da estimulação com glicose de 12 mM. A duração da estimulação é denotada pela barra cinza clara e sombreada na imagem. (C) Análise de vários parâmetros da fase do planalto: I) Duração da oscilação determinada a meia altura, II) frequência de oscilações determinadas por intervalos inter-oscilação. III) tempo ativo como produto de frequência e duração das oscilações. I-IV) Atrasos entre oscilações em qualquer determinada onda de oscilações que se espalham pela ilhota de Langerhans determinada pelos atrasos (Δt) no tempo em que uma única célula atinge meia altura da oscilação. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Mesa 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar esta tabela.</a>

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Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Apresentamos a preparação de fatias agudas de tecido pancreático e seu uso em microscopia de escaneamento a laser confocal para estudar a dinâmica do cálcio simultaneamente em um grande número de células vivas, durante longos períodos de tempo, e com alta resolução espástica.

Microscopia confocal de varredura a laser da dinâmica do cálcio em fatias agudas de tecido pancreático do rato

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Em combinação com imagens de cálcio de células vivas, a técnica aguda de fatia de tecido pancreas permite o estudo de ondas intercelulares e conectividade funcional multicelular com alta resolução por longos períodos de tempo. As principais vantagens dessa técnica são que ela é rápida, preserva a arquitetura tecidual e reduz o estresse enzimático e mecânico limitado, mantendo um alto rendimento de tecido. Ao detectar alterações funcionais e morfológicas durante a progressão da doença, essa técnica ajuda a entender as doenças relacionadas ao pâncreas, como o diabetes.Essa técnica de fatia de tecido pode ser aplicada aos tecidos cerebrais, pituitários e adrenal com ênfase na preservação do contato intercelular, interações paracrinas e arquitetura tecidual. Para se preparar para a injeção de agarose no pâncreas do rato, encha uma seringa de cinco mililitros com 40 graus Celsius de líquido agarose e equipe a seringa com uma agulha calibre 30. Depois de cobrir cuidadosamente a agulha com uma tampa, coloque a agulha da seringa para baixo, com todo o volume de agarose abaixo da superfície da água, em um banho de água de 40 graus Celsius.Bubble uma garrafa de solução extracelular com carbogênio, continuamente no gelo, a 1,5 mililitros por minuto a pressão barométrica e temperatura ambiente para garantir a oxigenação e um pH de 7,4. Para realizar a injeção de agarose coloque um rato adulto eutanizado sob um microscópio estéreo e acesse o abdômen do rato através da laparotomia. Mova suavemente o intestino para o lado esquerdo para expor o ducto biliar comum e use fórceps para levantar ligeiramente a extremidade duodenal do duto para localizar a papila de Vater.Use um hemostat para fixar o ducto biliar na papila duodenal para evitar o vazamento da agarose do duto no duodeno e use um pequeno fórceps afiados para alcançar sob o ducto biliar comum para quebrar a membrana que liga o ducto ao tecido pancreático. Depois de limpar o máximo de gordura e tecido conjuntivo possível do duto, coloque o duto perpendicularmente sobre as pontas de um par de fórceps maiores, e pressionando firmemente sobre o êmbolo da seringa, injete a agarose líquida viscosa na extremidade proximal do ducto biliar comum por 20 a 30 segundos. Quando o tecido ficar esbranquiçado e ligeiramente distendido remova a seringa e despeje lentamente 20 mililitros da solução extracelular gelada borbulhante no pâncreas para resfriar o tecido e endurecer a agarose.Para adquirir fatias de tecido pancreático use fórceps e tesouras finas e duras para transferir suavemente o pâncreas injetado agarose em uma placa de Petri de 100 milímetros contendo 40 mililitros de solução extracelular gelada. Gire o prato para enxaguar o tecido e transfira o pâncreas para um segundo prato de solução extracelular gelada. Use as fórceps e a tesoura para cortar a seção de pâncreas esbranquiçado e bem injetado em até seis pedaços de 0,1 a 0,2 centímetros cúbicos e remova qualquer tecido conjuntivo e gorduroso restante dos pedaços de tecido.Coloque os blocos limpos em uma placa de Petri de fundo não pegajoso de 35 milímetros contendo aproximadamente cinco mililitros de 40 graus Celsius de líquido surgido e coloque imediatamente a placa de Petri no gelo. Quando a agarose endurecer, segure a placa de Petri de cabeça para baixo sobre a tampa de uma placa de Petri de 100 milímetros e use metade de uma lâmina de barbear para cortar cuidadosamente a margem entre a parede lateral da placa de Petri e a agarose para remover a agarose da placa. Use a lâmina de barbear para cortar cubos individuais, cada um contendo um bloco de tecido de agarose, da agarose livre e use cola cianoacrilato para anexar os blocos à placa de amostra de um vibratome.Encha a câmara de corte do vibratome com 150 mililitros de solução extracelular gelada continuamente borbulhada com carbogen. Fixar a placa de amostra no vibratome e montar uma nova lâmina de barbear. Cerque a câmara com gelo e adicione dois cubos de gelo de volume de 10 mililitros feitos com solução extracelular suplementada com seis milimões de glicose.Coloque o cortador em 0,05 a 1 milímetro por segundo e 70 hertz, depois comece a cortar para adquirir 140 mícrons de fatias de agarose de espessura com uma área de superfície de 20 a 100 milímetros quadrados. Use uma escova de tinta fina para transferir cuidadosamente cada fatia em uma placa de Petri de 100 milímetros recheada com 40 milímetros de tampão HEPES suplementado com glicose de seis milímetros. Para a preparação de corante de cálcio, dissolva 50 microgramas de corante indicador de cálcio permeável celular, 7,5 microlitros de DMSO e 2,5 microlitros do poloxamer, e 6,667 mililitros de HBS em um tubo de tampa de parafuso de 15 mililitros.Use uma pipeta para misturar completamente a solução por 20 segundos antes de submergir o tubo em uma câmara de banho ultrassônico e vórtice, cada um por 30 segundos. Em seguida, alíquota de 3.333 mililitros da solução de corante indicador de cálcio resultante em uma placa de Petri de 5 mililitros por 10 fatias de tecido a serem rotuladas. Para o carregamento de corante, use um pincel fino e macio para transferir até 10 fatias de tecido para cada prato de solução de corante e coloque os pratos em um agitador orbital por 50 minutos à temperatura ambiente e 40 revoluções por minuto protegidas da luz.Ao final da incubação, transfira até 20 fatias manchadas em pratos individuais de 60 mililitros de Petri recheados com HBS sem corante. Para a imagem de cálcio por microscopia confocal selecione uma ampliação de 20 ou 25 vezes e defina o modo de aquisição para imagens de lapso de tempo, o pinhole para 100 a 200 mícrons, e a excitação e emissão para o fluorohore usado no experimento. Monte a câmara de gravação e o sistema de perfusão no estágio controlado pela temperatura do microscópio e posicione a entrada e a saída nas bordas distantes da câmara de gravação.Defina as taxas de entrada e saída para um a dois mililitros por minuto. Coloque a temperatura do sistema de profusão a 37 graus Celsius e inicie a profusão com a solução não estimulante. Para registrar a dinâmica do cálcio do tecido coloque uma única fatia de tecido na câmara de gravação e imobilize o tecido com um peso de platina em forma de U com uma malha de nylon tenso.Use a opção de campo brilhante para localizar a estrutura de interesse e usar imagens vivas para posicionar as estruturas estudadas no campo de visão. Para otimizar a relação sinal-ruído, ajuste a potência do laser, a amplificação do detector e a média de binning de linha, mantendo a potência do laser mínima. Ajuste o plano focal para 15 mícrons abaixo da superfície de corte para evitar o registro de células potencialmente danificadas e adquirir as imagens.Definir a frequência de amostragem para um a dois hertz para permitir a detecção inicial de oscilações individuais e registrar uma imagem de alta resolução. Se disponível, use um gráfico on-line para obter feedback instantâneo sobre a resposta de preparação, sobre iluminação, fotobleaching e deriva mecânica. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, salve os dados para análise posterior.Aqui, um exemplo de uma fatia de tecido ideal pode ser observado no qual o corante indicador de cálcio permeável celular foi carregado com sucesso na fatia de tecido pancreático. Em contraste, essas fatias de tecido não são ideais para imagens devido a uma penetração de corante mal sucedida, falta de células de ilhotas ou uma abundância de tecido necrosado na superfície das amostras. Imagens de alta resolução de uma fatia de tecido pancreático podem ser usadas para delinear regiões distintas do tecido pancreático, como as ilhotas de Langerhans, tecido acinar ou o ducto pancreático.Estímulos podem ser usados para discriminar funcionalmente entre diferentes células ilhotas ou entre células ilhotas e não-ilhotas. Por exemplo, as células beta normalmente respondem a uma estimulação de glicose de pulso quadrado, exibindo um aumento transitório no cálcio intracelular seguido por uma oscilação rápida de cálcio em um platô sustentado. Em contraste, as células não beta respondem com oscilações mais rápidas e irregulares.Um atraso no aparecimento do aumento do cálcio intracelular após a estimulação, bem como a heterogeneidade e atrasos entre as células individuais também podem ser medidos. Os mesmos parâmetros podem ser usados para descrever a fase de desativação. Aqui pode ser observada uma apresentação esquemática da duração, frequência e percentual de oscilação intracelular de cálcio.Quando a imagem em taxas de aquisição superiores a 10 hertz, ondas de cálcio que se espalham repetidamente pela ilhota podem ser claramente reconhecidas. Fixar o ducto biliar comum o mais próximo possível do duodeno para evitar que acidentalmente ocluam o ramo que está entrando no pâncreas. Além disso, não pare de deprimir o êmbolo durante a injeção porque a agarose vai imediatamente endurecer na agulha.A técnica de fatia de tecido pancreático agudo do rato também pode ser usada com o método de fixação para estudar correntes de canais de íons e acessar citose, bem como estudos de imunohistoquímica e estudos de secretários.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Fluorescência baseada em Medição da loja operada entrada de cálcio em células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas em fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Biologia

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

No Vivo controle de timócitos na Câmara Anterior do olho a Laser, microscopia eletrônica de varredura em tempo real

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Dinâmica de cálcio de imagem em subpopulações de células de ilhotas pancreáticas do rato

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Microscopia eletrônica de varredura de blocos de bloco serial (SBF-SEM) de amostras de tecido biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Imagem de mtHyPer7, um biossensor ratiométrico para peróxido mitocondrial, em células vivas de levedura

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Abordagem simplificada de imagem intravital para monitoramento de longo prazo da dinâmica do tecido epitelial em um microscópio confocal invertido

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Preparação de amostras biológicas para microscopia confocal, configuração de aquisição de imagens e imagens de microscopia confocal