Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Работа, представленная в этом исследовании, была финансово поддержана Словенским исследовательским агентством (nos. П3-0396 и И0-0029, а также научно-исследовательские проекты Nos. J3-9289, N3-0048 и N3-0133) и Австрийским научным фондом / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (двусторонние гранты I3562--B27 и I4319--B30). Мы благодарим Марушу Рошер, Машу Чатер и Руди Млакара за отличную техническую помощь.

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии какого-либо коммерческого или финансового интереса.

Поджелудочная железа млекопитающих представляет собой крупную экзокринную и эндокринную железу. Экзокринная часть составляет 96-99% от общего объема поджелудочной железы и состоит из ацинушек и протоков. Эндокринная часть состоит из большого количества островков Лангерганса, составляющих оставшиеся 1-4% от общего объема поджелудочной железы1. Экзокринная часть выделяет основные пищеварительные ферменты, которые расщепляют богатые энергией полимеры в пище, а также богатую бикарбонатами жидкость, которая соединяется с другими желудочно-кишечными выделениями, чтобы обеспечить среду, подходящую для действия ферментов. Эндокринная часть выделяет гормоны, которые регулируют постпрандиальное распределение, хранение и межпрандиальное высвобождение богатых энергией питательных веществ. Хотя экзокринная ткань относительно недоразвита, а эндокринная относительно хорошо развита при рождении, первая быстро перерастает вторую при отлученииот груди 2,3,4. Ранние исследования функции поджелудочной железы ознаменовали рождение современной физиологии, и за основными методологическими достижениями в этой области последовали крупные научные прорывы5. Работа с поджелудочной железой технически сложна из-за сложной структуры железы, но также является большой мотивацией из-за таких заболеваний, как рак поджелудочной железы, панкреатит и диабет, которые представляют серьезную угрозу для общественного здравоохранения и для которых необходимы новые терапевтические подходы.
Изолированные островки6, ацины 7,8 и фрагменты протоков разрабатывались и использовались в течение десятилетий в качестве методов золотого стандарта благодаря их преимуществам по сравнению с клеточными линиями и первичными диспергированными эндокринными, ацинарными и протоковыми клетками 9,10. Несмотря на заметно улучшенную функцию изолированных клеточных коллективов, эти методы по-прежнему сопряжены со значительным механическим и ферментативным напряжением, изолируют клетки от окружающих тканей и, таким образом, не имеют паракринных взаимодействий и механической поддержки, и, самое главное, сопровождаются значительными изменениями нормальной физиологии 11,12,13 . Острый срез ткани поджелудочной железы мыши был разработан в 2001 году из предполагаемой необходимости разработки экспериментальной платформы, аналогичной срезам мозга, гипофиза и надпочечников с сохраненными межклеточными контактами, паракринными взаимодействиями, мезенхимой и тканевой архитектурой, а также без некоторых из наиболее важных недостатков метода золотого стандарта в исследовании островков того времени - изолированных островков12, 14. Среди этих недостатков - повреждение самых внешних слоев, отсутствие доступности основных островковых районов и необходимость культивирования, что, возможно, оказывает важное влияние на идентичность и физиологию клеток12,15. Кроме того, метод среза ткани позволяет проводить исследования на животных моделях с сильно нарушенной архитектурой островков, где невозможно изолировать островки или когда выход островков чрезвычайно низок при традиционной изоляции 16,17,18,19,20,21.
Кроме того, срез больше подходит для изучения морфологических изменений во время развития диабета и панкреатита, например, поскольку он позволяет лучше просматривать всю ткань, а также совместим с изучением региональных различий. Важно отметить, что, несмотря на раннюю ориентацию на эндокринную часть, метод среза ткани по своей сути позволяет изучать экзокринные компоненты 9,22,23. В течение первого десятилетия после его введения метод использовался для электрофизиологических исследований бета-14,24,25,26,27,28,29 иальфа-30,31 клеток, а также для изучения морфологического и функционального созревания поджелудочной железы 2,3 . Десять лет спустя, в 2013 году, метод был успешно адаптирован для визуализации кальция в живых клетках островковых клеток с использованием CLSM для характеристики их реакций на глюкозу32, их функциональных паттернов связности33 и взаимосвязи между мембранным потенциалом и внутриклеточным кальцием путем объединения флуоресцентного красителя кальция с мембранным потенциальным красителем34. Позже в том же году метод был также использован для оценки динамики кальция в ацинарных клетках22,35. В течение следующих лет срезы ткани поджелудочной железы использовались в ряде различных исследований и успешно адаптировались к тканям свиней и человека 9,36,37,38,39,40,41. Тем не менее, взятые вместе, визуализация кальция - в срезах ткани поджелудочной железы мыши в целом и в островках в частности - по-прежнему в основном выполняется этой группой. Одна из основных причин этого может заключаться в сочетании технически сложной подготовки среза ткани, необходимости конфокального микроскопа и довольно сложного анализа данных. Основная цель настоящего документа состоит в том, чтобы сделать этот мощный метод более доступным для других потенциальных пользователей.
Уже есть несколько отличных методологических статей, подробно посвященных подготовке срезов тканей и использованию срезов для структурных и секреционных исследований, но не для конфокальной визуализации кальция 9,42,43. Поэтому в данной работе основное внимание уделяется некоторым дополнительным советам и приемам при приготовлении срезов, этапам, критически важным для успешной загрузки красителя, получения изображения, а также основным этапам анализа базовых данных кальция. Поэтому этот вклад следует рассматривать как дополняющий, а не как альтернативу вышеупомянутому методу. Аналогичным образом, визуализация кальция в срезах ткани поджелудочной железы мыши должна рассматриваться как экспериментальный подход, который будет использоваться для ответа на конкретные вопросы, и, таким образом, является дополнением, а не абсолютной альтернативой другим подходам к визуализации кальция в физиологии поджелудочной железы, таким как изолированные протоки или ацины, изолированные островки, органоиды, островки, пересаженные в переднюю камеру глаза, и записи in vivo 11,44,45,46,47,48. Перспективность визуализации кальция в срезах ткани поджелудочной железы мыши, вероятно, лучше всего иллюстрируется недавними успешными записями динамики кальция в островковых мезенхимальных клетках, таких как перициты49 и макрофаги50, а также в клетках протоков23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

Острый срез ткани поджелудочной железы мыши представляет собой уникальный препарат in situ с сохраненной межклеточной связью и тканевой архитектурой, который влечет за собой значительно меньше изменений, вызванных препаратом, чем изолированные островки, ацинусы, протоки или дисперсные клетки, описанные в типичных исследованиях in vitro. Комбинируя острый срез ткани поджелудочной железы с визуализацией кальция живыми клетками в конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM), сигналы кальция могут быть изучены в большом количестве эндокринных и экзокринных клеток одновременно, с одноклеточным или даже субклеточным разрешением. Чувствительность позволяет обнаруживать изменения и позволяет изучать межклеточные волны и функциональную связность, а также изучать зависимость физиологических реакций клеток от их локализации в островковых и паракринных отношениях с другими клетками. Наконец, с точки зрения благополучия животных, запись сигналов от большого количества клеток одновременно снижает количество животных, необходимых в экспериментах, способствуя 3R-замене, сокращению и уточнению принципа.

Инъекция раствора агарозы в проток поджелудочной железы является наиболее важным этапом в подготовке среза ткани поджелудочной железы. Успешную инъекцию можно распознать по отбеливанию ткани поджелудочной железы, как видно на левой стороне рисунка 3А, в то время как неполностью введенная часть поджелудочной железы представлена на правой стороне рисунка 3А. Островки Лангерганса могут быть распознаны невооруженным глазом или под стереомикроскопом, и это помогает в разрезании соответствующих частей поджелудочной железы для последующего встраивания в блоки агарозы (рисунок 3B). В свежесрезанном срезе ткани поджелудочной железы мыши островки Лангерганса можно легко отличить от окружающей экзокринной ткани и мезенхимы в виде белых пятен под стереомикроскопом (рисунок 3C) или в виде коричневатых структур под световым микроскопом (рисунок 3D). Срезы ткани поджелудочной железы могут быть использованы для различных типов экспериментов в течение, по крайней мере, 12 ч после нарезки. В дополнение к грубой морфологической оценке под стереомикроскопом, световым микроскопом и функциональными реакциями клеток во время визуализации кальция может быть оценена жизнеспособность срезов ткани поджелудочной железы (рисунок 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Рисунок 4: Жизнеспособность клеток внутри среза ткани. Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа Live/Dead. Живые клетки окрашиваются Calcein AM (показаны зеленым цветом), в то время как мертвые клетки окрашиваются гомодимером этидия-1 (показан красным цветом). Желтые линии обозначают положение поперечного сечения X-Y Z-стека, отображаемого внизу и справа. Полная глубина Z-стека составляет 88 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Для экспериментов с визуализацией кальция флуоресцентный индикатор кальция должен проникать через несколько слоев клеток. На рисунке 5А показана успешная загрузка клеточно-проницаемого индикаторного красителя Ca2+ в срез ткани поджелудочной железы, в котором могут быть распознаны отдельные островковые и ацинарные клетки. Напротив, срезы на рисунке 5B-D не являются оптимальными из-за неудачного проникновения красителя (рисунок 5B), отсутствия островковых клеток (рисунок 5C) и большого количества некротической ткани на поверхности (рисунок 5D). Такие срезы могут быть выброшены, проверены на наличие дополнительных островков, которые лучше разрезаны или окрашены (см. Таблицу 1 для устранения неполадок), или использованы для записи реакций экзокринных клеток.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Рисунок 5: Примеры пригодных и непригодных для использования препаратов. (А) Пример успешного приготовления среза ткани поджелудочной железы с хорошо окрашенными клетками в островках Лангерганса, а также клетками протоков и окружающей ацинарной тканью. (B) Пример плохо окрашенного среза ткани. (C) Пример островка Лангерганса со структурными разрывами. (D) Пример островка Лангерганса, содержащего много мертвых клеток и много мусора. Таблица подстановки «свечение, свечение» справа отображает интенсивность 0 зеленым цветом и насыщенность синим. Шкала = 100 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Репрезентативные результаты визуализации кальция с использованием клеточно-проницаемого индикаторного красителя Ca2+ показаны на рисунке 6. На фиг.6А представлено изображение среза ткани поджелудочной железы с высоким разрешением, содержащее островок Лангерганса, ацинарную ткань и проток поджелудочной железы. Для лучшего различения эндокринная, экзокринная и протоковая часть среза ткани поджелудочной железы, представленная на рисунке 6А , окрашена на рисунке 6B. Использование соответствующих стимулов может функционально различать различные островковые клетки или островковые и неостровные клетки51. Бета-клетки обычно реагируют на стимуляцию квадратного импульса глюкозой с переходным увеличением [Ca2+]IC с последующими быстрыми колебаниями кальция на устойчивом плато (рисунок 6C, верхняя панель).
Поскольку все бета-клетки соединены в один большой функциональный синцитий, эти колебания также очень хорошо синхронизированы между различными клетками посредством распространения волн [Ca2+]IC 32,34,52,53,54 (Рисунок 7C). Более медленные [Ca2+]IC колебания с периодом 5-15 минут могут лежать в основе быстрых колебаний или даже быть преобладающим типом ответа55,56. Тот же простой протокол может выявить другие типы ответов, особенно на периферии островков (рисунок 6C, нижняя панель). Поскольку эти клетки не синхронизированы с бета-клетками и реагируют более быстрыми и нерегулярными колебаниями, которые уже присутствуют в условиях низкого уровня глюкозы или со снижением активности, такие ответы очень наводят на мысль о небета-клетках 21,32,57,58. Однако их окончательная функциональная характеристика требует более сложных протоколов с дополнительными шагами стимуляции или альтернативными подходами, которые обсуждаются ниже. Типичные ответы ацинарных и проточных клеток представлены на рисунке 6D и рисунке 6E соответственно. Обратитесь к литературе для получения более подробной информации об ацинарных и протоковых клетках 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Рисунок 6: Репрезентативные результаты динамики кальция в различных типах клеток поджелудочной железы. (A) Изображение островка Лангерганса с высоким разрешением с окружающими тканями. Шкала = 100 мкм. (B) Разграничение отдельных частей ткани поджелудочной железы с ацинарной тканью, показанной желтым цветом, островком Лангерганса, показанным красным, и сегментом протокового дерева синим. Шкала bar = 100 мкм. (C) Типичные следы динамики кальция в бета- и предполагаемых небета-клетках при стимуляции глюкозой 12 мМ; 3 мМ глюкозы использовали для нестимулирующих состояний. Протоколы, которые могут быть использованы для более конкретной дискриминации небета-клеток, описаны в разделе обсуждения. (D) Типичный след кальциевой динамики ацинарных клеток, стимулируемых 25 нМ ацетилхолина. (E) Типичный след динамики кальция проточных клеток, стимулируемых 1 мМ хенодезоксихолевой кислоты. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
После успешной визуализации кальция данные сначала экспортируются и корректируются для отбеливания комбинацией экспоненциального и линейного соответствия, как описано в разделе протокола. Временные ряды до и после коррекции отбеливания представлены на рисунке 7А. После этого можно проанализировать несколько параметров в фазе активации и деактивации ответа, а также фазе плато. Задержка начала повышения [Ca2+]IC после стимуляции может быть измерена как представленная задержкойA на фиг.7B и неоднородностью задержек между отдельными клетками (задержкаA1). Те же параметры (задержкаD и задержкаD1) могут быть использованы для описания фазы деактивации. После начального переходного [Ca2+]IC повышения фаза плато в большинстве бета-клеток поджелудочной железы в островке характеризуется относительно регулярными высокочастотными [Ca2+]IC колебаниями. Фазу плато можно описать, проанализировав классические функциональные параметры. Схематическое представление длительности колебаний [Ca2+]IC , частоты и процента активного времени представлено на рисунке 7C. В кальциевой визуализации со скоростью захвата выше 10 Гц кальциевые волны, многократно распространяющиеся по островку, также могут быть четко распознаны (рисунок 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Рисунок 7: Анализ данных временных рядов. (A) Коррекция данных временных рядов для фотоотбеливания. (B) Анализ задержек активации после стимуляции и деактивации после прекращения стимуляции 12 мМ глюкозы. Длительность стимуляции обозначается светло-серой, затененной полосой на изображении. (C) Анализ нескольких параметров фазы плато: I) Длительность колебаний, определяемая на половинной высоте, II) частота колебаний, определяемая межколебательными интервалами. III) активное время как произведение частоты и длительности колебаний. I-IV) Задержки между колебаниями в любой данной волне колебаний, которые распространяются по островку Лангерганса, определяются задержками (Δt) во времени, при которых одна клетка достигает половинной высоты колебания. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
Таблица 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Представлены препараты острых срезов ткани поджелудочной железы и их использование в конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для изучения динамики кальция одновременно в большом количестве живых клеток, в течение длительных периодов времени и с высоким пространственно-временным разрешением.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия динамики кальция в острых срезах ткани поджелудочной железы мыши

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

В сочетании с визуализацией кальция живыми клетками метод острого среза ткани поджелудочной железы позволяет изучать межклеточные волны и многоклеточную функциональную связь с высоким разрешением в течение длительных периодов времени. Основными преимуществами этой методики является то, что она быстрая, сохраняет тканевую архитектуру и уменьшает ограниченное ферментативное и механическое напряжение при сохранении высокого выхода ткани. Обнаруживая функциональные и морфологические изменения во время прогрессирования заболевания, этот метод помогает нам понять заболевания, связанные с поджелудочной железой, такие как диабет.Этот метод среза ткани может быть применен к тканям мозга, гипофиза и надпочечников с акцентом на сохранение межклеточного контакта, паракринных взаимодействий и тканевой архитектуры. Чтобы подготовиться к инъекции агарозы в поджелудочную железу мыши, заполните пятимиллилитровой шприц жидкой агарозой 40 градусов Цельсия и оснастите шприц иглой 30 калибра. После тщательного покрытия иглы колпачком поместите конец иглы шприца вниз, со всем объемом агарозы ниже поверхности воды, на водяную баню с температурой 40 градусов Цельсия.Пузырьк с внеклеточным раствором с карбогеном, непрерывно на льду, со скоростью 1,5 миллилитра в минуту при барометрическом давлении и комнатной температуре, чтобы обеспечить оксигенацию и рН 7,4. Для выполнения инъекции агарозы поместите усыпленную взрослую мышь под стереомикроскоп и получите доступ к брюшной полости мыши через лапаротомию. Осторожно переместите кишечник в левую сторону, чтобы обнажить общий желчный проток, и используйте щипцы, чтобы слегка приподнять дуоденальный конец протока, чтобы найти сосочек Фатера.Используйте гемостат для зажима желчного протока в дуоденальном сосочке, чтобы предотвратить утечку агарозы из протока в двенадцатиперстную кишку, и используйте небольшие острые щипцы, чтобы добраться под общим желчным протоком, чтобы разорвать мембрану, которая прикрепляет проток к ткани поджелудочной железы. После очистки протока от как можно большего количества жира и соединительной ткани поместите проток перпендикулярно на кончики пары более крупных щипцов и, крепко надавливая на шприцевой поршень, вводят вязкую жидкую агарозу в проксимальный конец общего желчного протока в течение 20-30 секунд. Когда ткань станет беловатой и слегка растянутой, снимите шприц и медленно вылейте 20 миллилитров пузырькового ледяного внеклеточного раствора на поджелудочную железу, чтобы охладить ткань и затвердеть агарозу.Для приобретения срезов ткани поджелудочной железы используют щипцы и тонкие жесткие ножницы, чтобы аккуратно перенести введенную агарозу поджелудочной железы в 100-миллиметровую чашку Петри, содержащую 40 миллилитров ледяного внеклеточного раствора. Закрутите блюдо, чтобы промыть ткани и перенести поджелудочную железу во вторую посуду из ледяного внеклеточного раствора. Используйте щипцы и ножницы, чтобы разрезать беловатый, хорошо введенный участок поджелудочной железы на шесть кусочков от 0,1 до 0,2 кубического сантиметра и удалить оставшуюся соединительную и жировую ткань из кусочков ткани.Поместите очищенные блоки в 35-миллиметровую нелипкую нижнюю чашку Петри, содержащую примерно пять миллилитров жидкой агарозы 40 градусов Цельсия, и немедленно поместите чашку Петри на лед. Когда агароза затвердеет, держите чашку Петри вверх ногами над крышкой 100-миллиметровой чашки Петри и используйте половину лезвия бритвы, чтобы аккуратно разрезать край между боковой стенкой чашки Петри и агарозой, чтобы удалить агарозу из чашки. Используйте лезвие бритвы, чтобы вырезать отдельные кубики, каждый из которых содержит один тканевый блок агарозы, из освобожденной агарозы и используйте цианоакрилатный клей для прикрепления блоков к пластине образца вибратома.Заполните режущую камеру вибратома 150 миллилитрами ледяного внеклеточного раствора, непрерывно пузырящегося карбогеном. Прикрутите пластину образца на вибратоме и установите новое лезвие бритвы. Окружите камеру льдом и добавьте два кубика льда объемом 10 миллилитров, приготовленных внеклеточным раствором, дополненным шестью миллимолярами глюкозы.Установите слайсер на 0,05-1 миллиметр в секунду и 70 герц, затем начните нарезку, чтобы получить кусочки агарозы толщиной 140 микрон с площадью поверхности от 20 до 100 квадратных миллиметров. Используйте тонкую кисть, чтобы аккуратно перенести каждый кусочек в 100-миллиметровую чашку Петри, заполненную 40-миллиметровым буфером HEPES, дополненным шестью миллимолярами глюкозы. Для приготовления кальциевого красителя растворите 50 мкг клеточного проницаемого кальциевого индикаторного красителя, 7,5 микролитра ДМСО и 2,5 микролитра полоксамера и 6,667 миллилитров HBS в 15-миллилитровой шнековой колпачковой трубке.Используйте пипетку, чтобы тщательно перемешать раствор в течение 20 секунд, прежде чем погрузить трубку в ультразвуковую камеру ванны и вихрь, каждый в течение 30 секунд. Затем аликвота 3,333 миллилитров полученного раствора кальциевого индикаторного красителя в одну чашку Петри объемом 5 миллилитров на 10 ломтиков ткани, подлежащих маркировке. Для загрузки красителем используйте тонкую мягкую кисть, чтобы перенести до 10 ломтиков ткани в каждое блюдо с раствором красителя и поместить посуду на орбитальный шейкер на 50 минут при комнатной температуре и 40 оборотов в минуту, защищенных от света.В конце инкубации переложите до 20 окрашенных ломтиков в отдельные 60-миллилитровые чашки Петри, наполненные HBS без красителя. Для визуализации кальция с помощью конфокальной микроскопии выберите 20 или 25-кратное увеличение и установите режим сбора на покадровую визуализацию, точечное отверстие от 100 до 200 микрон, а также возбуждение и излучение для флуорофора, используемого в эксперименте. Установите камеру записи и перфузионную систему на ступень микроскопа с контролируемой температурой и расположите входное и выходное отверстие на дальних краях записывающей камеры.Установите скорость притока и оттока на один-два миллилитра в минуту. Установите температуру обильной системы на 37 градусов цельсия и инициируйте обилие с помощью нестимулирующего раствора. Для записи кальциевой динамики ткани поместите один срез ткани в записывающую камеру и обездвижите ткань U-образной платиновой массой с подтянутой нейлоновой сеткой.Используйте опцию яркого поля, чтобы найти интересующую структуру и использовать живую визуализацию для позиционирования исследуемых структур в поле зрения. Чтобы оптимизировать отношение сигнал/шум, отрегулируйте мощность лазера, усиление детектора и усреднение линии, сохраняя при этом минимальную мощность лазера. Отрегулируйте фокальную плоскость до 15 микрон ниже поверхности разреза, чтобы избежать записи из потенциально поврежденных клеток и получения изображений.Установка частоты дискретизации от одного до двух герц для первоначального обнаружения отдельных колебаний и записи изображения с высоким разрешением. Если доступно, используйте онлайн-диаграмму, чтобы получить мгновенную обратную связь о реакции подготовки, переосвещении, фотоотбеливании и механическом дрейфе. Когда все изображения будут получены, сохраните данные для последующего анализа.Здесь можно наблюдать пример оптимального среза ткани, при котором клеточный проницаемый кальциевый индикаторный краситель был успешно загружен в срез ткани поджелудочной железы. Напротив, эти срезы тканей не являются оптимальными для визуализации из-за неудачного проникновения красителя, отсутствия островковых клеток или обилия некротической ткани на поверхности образцов. Изображения с высоким разрешением среза ткани поджелудочной железы могут быть использованы для очерчивания отдельных областей ткани поджелудочной железы, таких как островки Лангерганса, ацинарная ткань или проток поджелудочной железы.Стимулы могут быть использованы для функциональной дифференциации между различными островковыми клетками или между островковыми и неостровными клетками. Например, бета-клетки обычно реагируют на квадратную импульсную стимуляцию глюкозой, демонстрируя преходящее увеличение внутриклеточного кальция с последующим быстрым колебанием кальция на устойчивом плато. Напротив, небета-клетки реагируют более быстрыми и нерегулярными колебаниями.Также может быть измерена задержка начала внутриклеточного увеличения кальция после стимуляции, а также гетерогенность и задержки среди отдельных клеток. Эти же параметры могут быть использованы для описания фазы деактивации. Здесь можно наблюдать схематическое представление продолжительности внутриклеточного колебания кальция, частоты и процента активного времени.При визуализации со скоростью захвата более 10 герц волны кальция, которые многократно распространяются по островку, могут быть четко распознаны. Зажмите общий желчный проток как можно ближе к двенадцатиперстной кишке, чтобы предотвратить случайное закупорку ветви, которая попадает в поджелудочную железу. Кроме того, не прекращайте нажимать на поршень во время инъекции, потому что агароза сразу затвердеет в игле.Метод острого среза ткани поджелудочной железы мыши также может быть использован с методом зажима пластыря для изучения токов ионных каналов и цитоза доступа, а также иммуногистохимических исследований и исследований секретаря.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Сканирующая электронная микроскопия из размоченной ткани для визуализации внеклеточный матрикс

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

В режиме реального времени в Vivo отслеживания тимоцитов в передней камере глаза лазерная сканирующая микроскопия

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Изображение динамики кальция в субпопуляциях мышей поджелудочной железы клеток на икры

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Изучение митотической и меиотической разложения дрожжей ядерной динамики флуоресценции Live-клеток Микроскопии

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Последовательная блочно-лицевая сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) образцов биологических тканей

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Визуализация mtHyPer7, ратиометрического биосенсора для митохондриальной перекиси, в живых клетках дрожжей

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Оптимизированный подход к прижизненной визуализации для долгосрочного мониторинга динамики эпителиальных тканей на инвертированном конфокальном микроскопе

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Подготовка биологических образцов для конфокальной микроскопии, настройка получения изображений и визуализация конфокальной микроскопии