Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

El trabajo presentado en este estudio fue financiado por la Agencia Eslovena de Investigación (fondos básicos de investigación nos. P3-0396 e I0-0029, así como proyectos de investigación nos. J3-9289, N3-0048 y N3-0133) y por el Fondo Austriaco para la Ciencia / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (subvenciones bilaterales I3562--B27 e I4319--B30). Agradecemos a Maruša Rošer, Maša Čater y Rudi Mlakar por su excelente asistencia técnica.

Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier interés comercial o financiero.

El páncreas de los mamíferos es una gran glándula exocrina y endocrina. La parte exocrina constituye el 96-99% del volumen total del páncreas y consiste en acinos y conductos. La parte endocrina está formada por un gran número de islotes de Langerhans que representan el 1-4% restante del volumen total del páncreas1. La parte exocrina secreta enzimas digestivas importantes que descomponen los polímeros ricos en energía en los alimentos, así como un líquido rico en bicarbonato, que se combina con otras secreciones gastrointestinales para proporcionar un ambiente adecuado para la acción de las enzimas. La parte endocrina secreta hormonas que regulan la distribución postprandial, el almacenamiento y la liberación interprandial de nutrientes ricos en energía. Aunque el tejido exocrino está relativamente subdesarrollado y el endocrino relativamente bien desarrollado al nacer, el primero crece rápidamente en exceso el segundo al destetar 2,3,4. Los primeros estudios de la función pancreática marcaron el nacimiento de la fisiología moderna, y los principales avances metodológicos en el campo han sido seguidos por importantes rupturas científicas5. Trabajar con el páncreas es técnicamente un desafío debido a la intrincada estructura de la glándula, pero también es una gran motivación debido a enfermedades como el cáncer de páncreas, la pancreatitis y la diabetes que presentan grandes amenazas para la salud pública, y para las cuales se necesitan nuevos enfoques terapéuticos.
Los islotes aislados6,acini 7,8 y fragmentos ductales se habían desarrollado y utilizado durante décadas como métodos estándar de oro debido a sus ventajas en comparación con las líneas celulares y las células endocrinas, acinares y ductales dispersas primarias 9,10. A pesar de la función notablemente mejorada de los colectivos celulares aislados, estos métodos todavía implican un estrés mecánico y enzimático considerable, aíslan las células del tejido circundante y, por lo tanto, carecen de interacciones paracrinas y soporte mecánico, y lo más importante, se acompañan de cambios significativos en la fisiología normal 11,12,13 . La rebanada aguda de tejido pancreático de ratón se desarrolló en 2001 a partir de una necesidad percibida de desarrollar una plataforma experimental similar al cerebro, la hipófisis y las rebanadas suprarrenales con contactos intercelulares preservados, interacciones paracrinas, mesénquima y arquitectura tisular, así como sin algunas de las deficiencias más importantes del método estándar de oro en la investigación de islotes de ese momento: los islotes aislados12, 14. Entre estas deficiencias se encuentran el daño a las capas más externas, la falta de accesibilidad de las áreas de los islotes centrales y la necesidad de cultivo con efectos posiblemente importantes sobre la identidad celular y la fisiología12,15. Además, el método de corte de tejido permite estudios en modelos animales con una arquitectura de islotes extremadamente desquiciada donde es imposible aislar islotes, o cuando el rendimiento de los islotes es extremadamente bajo por el aislamiento tradicional 16,17,18,19,20,21.
Además, la rebanada es más adecuada para estudiar los cambios morfológicos durante el desarrollo de la diabetes y la pancreatitis, por ejemplo, ya que permite una mejor visión general de todo el tejido y también es compatible con el estudio de las diferencias regionales. Es importante destacar que, a pesar del enfoque temprano en la parte endocrina, el método de corte de tejido permite inherentemente el estudio de los componentes exocrinos 9,22,23. Durante la primera década después de su introducción, el método se empleó para estudios electrofisiológicos de células beta 14,24,25,26,27,28,29 y alfa 30,31, así como para examinar la maduración morfológica y funcional del páncreas 2,3 . Una década más tarde, en 2013, el método se adaptó con éxito para la obtención de imágenes de calcio de células vivas de células de islotes utilizando CLSM para caracterizar sus respuestas a la glucosa32, sus patrones de conectividad funcional33 y la relación entre el potencial de membrana y el calcio intracelular mediante la combinación de un colorante de calcio fluorescente con un colorante de potencial de membrana34. Más tarde en el mismo año, el método también se utilizó para evaluar la dinámica del calcio en las células acinares22,35. En los años siguientes, las rodajas de tejido pancreático se han utilizado en una serie de estudios diferentes y se han adaptado con éxito al tejido de cerdo y humano 9,36,37,38,39,40,41. Sin embargo, en conjunto, las imágenes de calcio, en cortes de tejido pancreático de ratón en general y en islotes en particular, todavía se realizan principalmente por este grupo. Una de las principales razones de esto puede estar en la combinación de una preparación de corte de tejido técnicamente desafiante, la necesidad de un microscopio confocal y un análisis de datos bastante complejo. El objetivo principal del presente documento es hacer que este poderoso método sea más accesible para otros usuarios potenciales.
Ya existen algunos excelentes artículos metodológicos que tratan en detalle la preparación de rodajas de tejido y el uso de rodajas para estudios estructurales y de secreción, pero no para imágenes de calcio confocal 9,42,43. Por lo tanto, este documento se centra en algunos consejos y trucos adicionales durante la preparación de rebanadas, en los pasos críticos para la carga exitosa del tinte, la adquisición de imágenes, así como en los pasos principales del análisis básico de datos de calcio. Por lo tanto, esta contribución debe considerarse complementaria y no como una alternativa al método antes mencionado. Del mismo modo, las imágenes de calcio en rodajas de tejido pancreático de ratón se considerarán un enfoque experimental que se utilizará para responder a preguntas específicas y, por lo tanto, es complementario en lugar de una alternativa absoluta para otros enfoques de imágenes de calcio en fisiología pancreática, como conductos aislados o acini, islotes aislados, organoides, islotes trasplantados en la cámara anterior del ojo, y grabaciones in vivo 11,44,45,46,47,48. La promesa de las imágenes de calcio en cortes de tejido pancreático de ratón probablemente se ilustra mejor con registros exitosos recientes de la dinámica del calcio en células mesenquimales de islotes como pericitos49 y macrófagos50, así como en células ductales23.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

La rebanada aguda de tejido pancreático de ratón es una preparación in situ única con comunicación intercelular preservada y arquitectura tisular que implica significativamente menos cambios inducidos por la preparación que los islotes aislados, acinos, conductos o células dispersas descritas en estudios in vitro típicos. Al combinar la rebanada de tejido pancreático agudo con imágenes de calcio de células vivas en microscopía de barrido láser confocal (CLSM), las señales de calcio se pueden estudiar en un gran número de células endocrinas y exocrinas simultáneamente, con una resolución unicelular o incluso subcelular. La sensibilidad permite la detección de cambios y permite el estudio de las ondas intercelulares y la conectividad funcional, así como el estudio de la dependencia de las respuestas fisiológicas de las células en su localización dentro de los islotes y la relación paracrina con otras células. Finalmente, desde la perspectiva del bienestar animal, el registro de señales de un gran número de células a la vez reduce el número de animales requeridos en los experimentos, lo que contribuye al principio de reemplazo, reducción y refinamiento de las 3R.

La inyección de la solución de agarosa en el conducto pancreático es el paso más crítico en la preparación de la rebanada de tejido del páncreas. Una inyección exitosa puede ser reconocida por un blanqueamiento del tejido del páncreas, como se ve en el lado izquierdo de la Figura 3A, mientras que una parte incompletamente inyectada del páncreas se presenta en el lado derecho de la Figura 3A. Los islotes de Langerhans se pueden reconocer a simple vista o bajo un estereomicroscopio, y esto ayuda a cortar las partes apropiadas del páncreas para su posterior incrustación en bloques de agarosa (Figura 3B). En una rebanada de tejido pancreático de ratón recién cortada, los islotes de Langerhans se pueden distinguir fácilmente del tejido exocrino circundante y el mesénquima como manchas blancas debajo del estereomicroscopio (Figura 3C) o como estructuras parduscas bajo el microscopio de luz (Figura 3D). Las rodajas de tejido pancreático se pueden usar para distintos tipos de experimentos durante al menos 12 h después del corte. Además de la evaluación morfológica macroscópica bajo el estereomicroscopio, el microscopio de luz y las respuestas funcionales de las células durante las imágenes de calcio, se puede evaluar la viabilidad de las rodajas de tejido pancreático (Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Figura 4: Viabilidad de las células dentro de la rebanada de tejido. La viabilidad de las células se determinó con el ensayo Live/Dead. Las células vivas son teñidas por Calcein AM (que se muestra en verde), mientras que las células muertas se tiñen con homodímero de etidio-1 (se muestra en rojo). Las líneas amarillas denotan la posición de la sección transversal X-Y de la pila Z que se muestra en la parte inferior y derecha. La profundidad total de la pila Z es de 88 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Para los experimentos de imágenes de calcio, el indicador de calcio fluorescente necesita penetrar a través de unas pocas capas de células. La Figura 5A presenta la carga exitosa del colorante indicador de Ca2+ permeable a las células en la rebanada de tejido pancreático en la que se pueden reconocer las células individuales de los islotes y acinares. En contraste, las rodajas en la Figura 5B-D no son óptimas debido a la penetración fallida del tinte (Figura 5B), la falta de células de los islotes (Figura 5C) y una gran cantidad de tejido necrótico en la superficie (Figura 5D). Tales rebanadas pueden desecharse, verificarse para detectar la presencia de islotes adicionales que se cortan o tiñen mejor (consulte la Tabla 1 para la solución de problemas) o usarse para registrar las respuestas de las células exocrinas.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Figura 5: Ejemplos de preparaciones utilizables e inutilizables. (A) Un ejemplo de una preparación exitosa de la rebanada de tejido del páncreas con células bien teñidas en los islotes de Langerhans, así como células ductales y tejido acinar circundante. (B) Un ejemplo de una rebanada de tejido mal teñida. (C) Ejemplo de un islote de Langerhans con discontinuaciones estructurales. (D) Un ejemplo de un islote de Langerhans que contiene muchas células muertas y muchos escombros. La tabla de búsqueda "glow-over, glow-under" a la derecha muestra la intensidad 0 en verde y la saturación en azul. Barra de escala = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Los resultados representativos de las imágenes de calcio utilizando el tinte indicador Ca2+ permeable a las células se muestran en la Figura 6. En la Figura 6A, se presenta una imagen de alta resolución de una rebanada de tejido pancreático, que contiene un islote de Langerhans, tejido acinar y un conducto pancreático. Para una mejor distinción, la parte endocrina, exocrina y ductal de la rebanada de tejido pancreático presentada en la Figura 6A se colorea en la Figura 6B. El uso de estímulos apropiados puede discriminar funcionalmente entre diferentes células de los islotes, o células de los islotes y no islotes51. Las células beta generalmente responderán a una estimulación de pulso cuadrado por glucosa con un aumento transitorio en [Ca2+]IC seguido de oscilaciones rápidas de calcio en una meseta sostenida (Figura 6C, panel superior).
Como todas las células beta están acopladas en un solo sincitio funcional, grande y funcional, estas oscilaciones también están muy bien sincronizadas entre diferentes células mediante la propagación de ondas IC [Ca2+]32,34,52,53,54 (Figura 7C). Las oscilaciones IC más lentas [Ca2+]con un período de 5-15 minutos pueden ser la base de las oscilaciones rápidas o incluso ser el tipo predominante de respuesta55,56. El mismo protocolo simple puede revelar otros tipos de respuestas, especialmente en la periferia de los islotes (Figura 6C, panel inferior). Como estas células no están sincronizadas con las células beta y responden con oscilaciones más rápidas e irregulares que ya están presentes en condiciones de baja glucosa o con una disminución de la actividad, tales respuestas son altamente sugestivas de células no beta 21,32,57,58. Sin embargo, su caracterización funcional definitiva requiere protocolos más complejos con pasos de estimulación adicionales o enfoques alternativos, que se discuten a continuación. Las respuestas típicas de las células acinares y ductales se presentan en la Figura 6D y la Figura 6E, respectivamente. Consulte la literatura para obtener más detalles sobre las células acinares y ductales 22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Figura 6: Resultados representativos de la dinámica del calcio en distintos tipos de células pancreáticas. (A) Imagen de alta resolución de un islote de Langerhans con tejido circundante. Barra de escala = 100 μm. (B) Delineación de distintas partes del tejido pancreático con tejido acinar mostrado en amarillo, un islote de Langerhans mostrado en rojo y un segmento del árbol ductal en azul. Barra de escala = 100 μm. (C) Trazas típicas de la dinámica del calcio en células beta y supuestamente no beta durante la estimulación con glucosa de 12 mM; Se utilizó glucosa de 3 mM para condiciones no estimulantes. Los protocolos que se pueden utilizar para una discriminación más específica de las células no beta se describen en la sección de discusión. (D) Un rastro típico de la dinámica del calcio de las células acinares estimuladas por 25 nM de acetilcolina. (E) Un rastro típico de la dinámica del calcio de las células ductales estimuladas por 1 mM de ácido quenodesoxicólico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Después de obtener imágenes de calcio exitosas, los datos se exportan primero y se corrigen para el blanqueo mediante una combinación de un ajuste exponencial y lineal, como se describe en la sección de protocolo. En la Figura 7A se presenta una serie temporal antes y después de la corrección del blanqueo. A partir de entonces, se pueden analizar varios parámetros en la fase de activación y desactivación de la respuesta, así como en la fase de meseta. Un retraso en el inicio del aumento de [Ca2+]IC después de la estimulación se puede medir como lo representa el retrasoA en la Figura 7B y la heterogeneidad en los retrasos entre las células individuales (retrasoA1). Los mismos parámetros (retardo D yretardo D1) se pueden utilizar para describir la fase de desactivación. Después del aumento transitorio inicial de [Ca2+]IC , la fase de meseta en la mayoría de las células beta pancreáticas en un islote se caracteriza por oscilaciones de alta frecuencia [Ca2+]IC relativamente regulares. La fase de meseta se puede describir analizando los parámetros funcionales clásicos. La presentación esquemática de la duración, frecuencia y porcentaje de tiempo activo de las oscilaciones [Ca2+]IC se presenta en la Figura 7C. En las imágenes de calcio con tasas de adquisición superiores a 10 Hz, las ondas de calcio que se propagan repetidamente a través del islote también se pueden reconocer claramente (Figura 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Figura 7: Análisis de datos de series temporales. (A) Corrección de datos de series temporales para fotoblanqueo. (B) Análisis de los retrasos en la activación después de la estimulación y en la desactivación después del cese de la estimulación con glucosa de 12 mM. La duración de la estimulación se denota por la barra sombreada de color gris claro en la imagen. (C) Análisis de varios parámetros de la fase de meseta: I) Duración de la oscilación determinada a media altura, II) frecuencia de oscilaciones determinada por intervalos de oscilación. III) el tiempo activo como producto de la frecuencia y duración de las oscilaciones. I-IV) Retrasos entre oscilaciones en cualquier onda dada de oscilaciones que se extienden a través del islote de Langerhans determinados por los retrasos (Δt) en el tiempo en que una sola célula alcanza la mitad de la altura de la oscilación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Tabla 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>

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Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Presentamos la preparación de lonchas de tejido pancreático agudo y su uso en microscopía de barrido láser confocal para estudiar la dinámica del calcio simultáneamente en un gran número de células vivas, durante largos períodos de tiempo, y con alta resolución espaciotemporal.

Microscopía de barrido con láser confocal de la dinámica del calcio en rodajas agudas de tejido pancreático de ratón

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

En combinación con imágenes de calcio de células vivas, la técnica de corte de tejido de páncreas agudo permite el estudio de ondas intercelulares y conectividad funcional multicelular con una alta resolución durante largos períodos de tiempo. Las principales ventajas de esta técnica son que es rápida, preserva la arquitectura del tejido y reduce el estrés enzimático y mecánico limitado, manteniendo un alto rendimiento de tejido. Al detectar cambios funcionales y morfológicos durante la progresión de la enfermedad, esta técnica ayuda a nuestra comprensión de las enfermedades relacionadas con el páncreas, como la diabetes.Esta técnica de corte de tejido se puede aplicar a los tejidos cerebrales, pituitarios y suprarrenales con énfasis en la preservación del contacto intercelular, las interacciones paracrinas y la arquitectura del tejido. Para prepararse para la inyección de agarosa en el páncreas del ratón, llene una jeringa de cinco mililitros con agarosa líquida de 40 grados Celsius y equipe la jeringa con una aguja de calibre 30. Después de cubrir cuidadosamente la aguja con una tapa, coloque el extremo de la aguja de la jeringa hacia abajo, con todo el volumen de agarosa debajo de la superficie del agua, en un baño de agua de 40 grados centígrados.Burbujear una botella de solución extracelular con carbógeno, continuamente sobre hielo, a 1,5 mililitros por minuto a presión barométrica y temperatura ambiente para asegurar la oxigenación y un pH de 7,4. Para realizar la inyección de agarosa, coloque un ratón adulto sacrificado bajo un microscopio estereoscópico y acceda al abdomen del ratón a través de la laparotomía. Mueva suavemente el intestino hacia el lado izquierdo para exponer el conducto biliar común y use fórceps para levantar ligeramente el extremo duodenal del conducto para localizar la papila de Vater.Use un hemostático para sujetar el conducto biliar en la papila duodenal para evitar la fuga de la agarosa del conducto al duodeno y use unas pequeñas pinzas afiladas para alcanzar debajo del conducto biliar común para romper la membrana que une el conducto al tejido pancreático. Después de limpiar la mayor cantidad de grasa y tejido conectivo del conducto como sea posible, coloque el conducto perpendicularmente en las puntas de un par de pinzas más grandes y, presionando firmemente el émbolo de la jeringa, inyecte la agarosa líquida viscosa en el extremo proximal del conducto biliar común durante 20 a 30 segundos. Cuando el tejido se vuelva blanquecino y ligeramente distendido, retire la jeringa y vierta lentamente 20 mililitros de la solución extracelular helada burbujeada sobre el páncreas para enfriar el tejido y endurecer la agarosa.Para adquirir rebanadas de tejido pancreático, use fórceps y tijeras finas y de corte duro para transferir suavemente el páncreas inyectado de agarosa a una placa de Petri de 100 milímetros que contiene 40 mililitros de solución extracelular helada. Gire el plato para enjuagar el tejido y transfiera el páncreas a un segundo plato de solución extracelular helada. Use las pinzas y las tijeras para cortar la sección blanquecina del páncreas bien inyectada en hasta seis piezas de 0,1 a 0,2 centímetros cúbicos y elimine cualquier tejido conectivo y graso restante de las piezas de tejido.Coloque los bloques limpios en una placa de Petri inferior no pegajosa de 35 milímetros que contenga aproximadamente cinco mililitros de agarosa líquida de 40 grados centígrados e inmediatamente coloque la placa de Petri sobre hielo. Cuando la agarosa se haya endurecido, sostenga la placa de Petri boca abajo sobre la tapa de una placa de Petri de 100 milímetros y use la mitad de una hoja de afeitar para cortar cuidadosamente el margen entre la pared lateral de la placa de Petri y la agarosa para eliminar la agarosa del plato. Use la cuchilla de afeitar para cortar cubos individuales, cada uno con un bloque de tejido de agarosa, de la agarosa liberada y use pegamento de cianoacrilato para unir los bloques a la placa de muestra de un vibratomo.Llene la cámara de corte del vibratomo con 150 mililitros de solución extracelular helada continuamente burbujeada con carbógeno. Enrosque la placa de muestra en el vibratomo y monte una nueva cuchilla de afeitar. Rodear la cámara con hielo y añadir dos cubitos de hielo de 10 mililitros de volumen hechos con solución extracelular suplementada con glucosa de seis milimolares.Ajuste la cortadora a 0.05 a 1 milímetro por segundo y 70 hercios, luego comience a cortar para adquirir rodajas de agarosa de 140 micras de espesor con un área de superficie de 20 a 100 milímetros cuadrados. Use un pincel fino para transferir cuidadosamente cada rebanada a una placa de Petri de 100 milímetros llena de 40 milímetros de tampón HEPES complementado con glucosa de seis milimolares. Para la preparación de colorantes de calcio, disuelva 50 microgramos de colorante indicador de calcio permeable a las células, 7,5 microlitros de DMSO y 2,5 microlitros del poloxámero y 6,667 mililitros de HBS en un tubo de tapón de rosca de 15 mililitros.Use una pipeta para mezclar bien la solución durante 20 segundos antes de sumergir el tubo en una cámara de baño ultrasónica y el vórtice, cada uno durante 30 segundos. A continuación, alícuota 3.333 mililitros de la solución de colorante indicador de calcio resultante en una placa de Petri de 5 mililitros por cada 10 rebanadas de tejido que se etiquetarán. Para la carga de tinte, use un pincel suave y delgado para transferir hasta 10 rodajas de tejido a cada plato de solución de tinte y coloque los platos en un agitador orbital durante 50 minutos a temperatura ambiente y 40 revoluciones por minuto protegidos de la luz.Al final de la incubación, transfiera hasta 20 rodajas teñidas a placas de Petri individuales de 60 mililitros llenas de HBS sin colorantes. Para las imágenes de calcio por microscopía confocal, seleccione un aumento de 20 o 25 veces y establezca el modo de adquisición en imágenes de lapso de tiempo, el agujero de alfiler de 100 a 200 micras y la excitación y emisión del fluoróforo utilizado en el experimento. Monte la cámara de grabación y el sistema de perfusión en la etapa de temperatura controlada del microscopio y coloque la entrada y la salida en los bordes lejanos de la cámara de grabación.Establezca las tasas de entrada y salida a uno o dos mililitros por minuto. Ajuste la temperatura del sistema de profusión a 37 grados centígrados e inicie la profusión con la solución no estimulante. Para registrar la dinámica del calcio del tejido, coloque una sola rebanada de tejido en la cámara de grabación e inmovilice el tejido con un peso de platino en forma de U con una malla de nylon tensa.Utilice la opción de campo brillante para localizar la estructura de interés y utilice imágenes en vivo para posicionar las estructuras estudiadas en el campo de visión. Para optimizar la relación señal-ruido, ajuste la potencia del láser, la amplificación del detector y el binning de promedio de línea mientras mantiene la potencia del láser mínima. Ajuste el plano focal a 15 micras por debajo de la superficie cortada para evitar la grabación de células potencialmente dañadas y adquirir las imágenes.Ajuste de la frecuencia de muestreo a uno o dos hercios para permitir la detección inicial de oscilaciones individuales y grabar una imagen de alta resolución. Si está disponible, use un gráfico en línea para obtener retroalimentación instantánea sobre la respuesta de preparación, sobre la iluminación, el fotoblanqueo y la deriva mecánica. Cuando se hayan adquirido todas las imágenes, guarde los datos para su posterior análisis.Aquí se puede observar un ejemplo de una rebanada de tejido óptima en la que el tinte indicador de calcio permeable a la célula se cargó con éxito en la rebanada de tejido pancreático. En contraste, estas rodajas de tejido no son óptimas para la obtención de imágenes debido a una penetración fallida del tinte, la falta de células de los islotes o una abundancia de tejido necrótico en la superficie de las muestras. Las imágenes de alta resolución de una rebanada de tejido pancreático se pueden usar para delinear distintas regiones del tejido pancreático, como los islotes de Langerhans, el tejido acinar o el conducto pancreático.Los estímulos se pueden utilizar para discriminar funcionalmente entre diferentes células de los islotes o entre las células de los islotes y las células no islotes. Por ejemplo, las células beta generalmente responden a una estimulación de glucosa de pulso cuadrado exhibiendo un aumento transitorio en el calcio intracelular seguido de una rápida oscilación del calcio en una meseta sostenida. En contraste, las células no beta responden con oscilaciones más rápidas e irregulares.También se puede medir un retraso en el inicio del aumento de calcio intracelular después de la estimulación, así como la heterogeneidad y los retrasos entre las células individuales. Los mismos parámetros se pueden utilizar para describir la fase de desactivación. Aquí se puede observar una presentación esquemática de la duración, frecuencia y porcentaje de la oscilación del calcio intracelular del tiempo activo.Cuando se toman imágenes a tasas de adquisición superiores a 10 hercios, se pueden reconocer claramente las ondas de calcio que se propagan repetidamente a través del islote. Pinte el conducto biliar común lo más cerca posible del duodeno para evitar ocluir accidentalmente la rama que ingresa al páncreas. Además, no deje de deprimir el émbolo durante la inyección porque la agarosa se endurecerá inmediatamente en la aguja.La técnica de corte agudo de tejido pancreático de ratón también se puede utilizar con el método de pinza de parche para estudiar las corrientes de los canales iónicos y la citosis de acceso, así como los estudios de inmunohistoquímica y los estudios de secretaría.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Basado en la fluorescencia de medición de la entrada de calcio de la tienda que funciona en las células vivas: a partir de células cancerosas cultivadas de fibra muscular esquelética

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Investigación

Biología

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

En Tracking Clonal vivo de madre hematopoyéticas y células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes utilizando confocal y Microscopía Multifotónica

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Microscopía Electrónica de Barrido de tejido macerado para visualizar la matriz extracelular

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Seguimiento en Vivo de los timocitos en el compartimiento Anterior del ojo mediante láser, microscopía en tiempo real

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Imagen de la dinámica del calcio en subpoblaciones de células de islotes pancreáticos de ratón

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Examen de la dinámica nuclear de levadura de ficción mitotica y meiótica por microscopía de células vivas de fluorescencia

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Microscopía Electrónica De Barrido Bloque-Cara Serial (SBF-SEM) De Muestras De Tejido Biológico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Obtención de imágenes de mtHyPer7, un biosensor radiométrico para el peróxido mitocondrial, en células vivas de levadura

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Enfoque simplificado de imágenes intravitales para la monitorización a largo plazo de la dinámica del tejido epitelial en un microscopio confocal invertido

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Preparación de muestras biológicas para microscopía confocal, configuración de adquisición de imágenes e imágenes de microscopía confocal