Name: confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices
Uploaded: 2021-04-13T13:30:00
Duration: 10 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Bu çalışmada sunulan çalışma, Slovenya Araştırma Ajansı tarafından finansal olarak desteklenmiştir (araştırma çekirdek finansman no. P3-0396 ve I0-0029'un yanı sıra araştırma projeleri no. J3-9289, N3-0048 ve N3-0133) ve Avusturya Bilim Fonu / Fonds zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (ikili hibeler I3562--B27 ve I4319--B30) tarafından. Mükemmel teknik yardım için Maruša Rošer, Maša Čater ve Rudi Mlakar'a teşekkür ederiz.

Yazarlar, araştırmanın herhangi bir ticari veya finansal çıkar olmaksızın yürütüldüğünü beyan ederler.

Memeli pankreası büyük bir ekzokrin ve endokrin bezdir. Ekzokrin kısım toplam pankreas hacminin% 96-99'unu oluşturur ve acini ve kanallardan oluşur. Endokrin kısım, toplam pankreas hacmi1'in kalan% 1-4'ünü oluşturan çok sayıda Langerhans adacığından oluşur. Ekzokrin kısım, gıdalardaki enerji bakımından zengin polimerleri parçalayan başlıca sindirim enzimlerini ve ayrıca enzimlerin etkisine uygun bir ortam sağlamak için diğer gastrointestinal sekresyonlarla birleşen bikarbonat bakımından zengin bir sıvı salgılar. Endokrin kısım, enerji açısından zengin besinlerin postprandiyal dağılımını, depolanmasını ve interprandiyal salınımını düzenleyen hormonları salgılar. Ekzokrin doku nispeten az gelişmiş ve endokrin doğumda nispeten iyi gelişmiş olmasına rağmen, birincisi 2,3,4 sütten kesildikten sonra ikincisini hızla büyütür. Pankreas fonksiyonunun erken çalışmaları modern fizyolojinin doğuşuna işaret etmiştir ve alandaki başlıca metodolojik ilerlemeleri büyük bilimsel kırılma alanları izlemiştir5. Pankreasla çalışmak, bezin karmaşık yapısı nedeniyle teknik olarak zordur, ancak halk sağlığı için büyük tehditler oluşturan ve yeni terapötik yaklaşımlara ihtiyaç duyulan pankreas kanseri, pankreatit ve diyabet gibi hastalıklar nedeniyle de büyük bir motivasyondur.
İzole adacıklar6, acini7,8 ve duktal fragmanlar, hücre hatları ve primer dağılmış endokrin, asinar ve duktal hücreler 9,10 ile karşılaştırıldığında avantajları nedeniyle on yıllardır altın standart yöntemler olarak geliştirilmiş ve kullanılmıştır. İzole hücre kolektiflerinin belirgin şekilde geliştirilmiş fonksiyonuna rağmen, bu yöntemler hala önemli mekanik ve enzimatik stres içerir, hücreleri çevreleyen dokudan izole eder ve bu nedenle parakrin etkileşimlerinden ve mekanik destekten yoksundur ve en önemlisi, normal fizyolojide önemli değişiklikler eşlik eder11,12,13 . Akut fare pankreas doku dilimi, 2001 yılında, korunmuş hücreler arası temaslar, parakrin etkileşimleri, mezenkim ve doku mimarisi ile beyin, hipofiz ve adrenal dilimlere benzer deneysel bir platform geliştirme ihtiyacından ve aynı zamanda o zamanın adacık araştırmalarında altın standart yöntemin en önemli eksikliklerinden bazıları olmadan geliştirilmiştir - izole adacıklar12, 14. Bu eksiklikler arasında en dış katmanların zarar görmesi, çekirdek adacık alanlarının erişilememesi ve hücre kimliği ve fizyolojisi üzerinde muhtemelen önemli etkileri olan yetiştirme ihtiyacıbulunmaktadır 12,15. Ayrıca, doku dilimi yöntemi, adacıkları izole etmenin imkansız olduğu veya adacık veriminin geleneksel izolasyon 16,17,18,19,20,21 ile son derece düşük olduğu durumlarda, büyük ölçüde dengesiz adacık mimarisine sahip hayvan modelleri üzerinde çalışmalara olanak tanır.
Ek olarak, dilim, örneğin diyabet ve pankreatit gelişimi sırasında morfolojik değişiklikleri incelemek için daha uygundur, çünkü tüm dokuya daha iyi bir genel bakış sağlar ve ayrıca bölgesel farklılıkları incelemekle de uyumludur. Önemli olarak, endokrin kısma erken odaklanılmasına rağmen, doku dilimleme yöntemi doğal olarak ekzokrin bileşenlerin incelenmesini sağlar 9,22,23. Kullanılmaya başlanmasından sonraki ilk on yıl boyunca, yöntem beta 14,24,25,26,27,27,28,29 ve alfa 30,31 hücrelerinin elektrofizyolojik çalışmaları ve pankreasın morfolojik ve fonksiyonel olgunlaşmasını incelemek için kullanılmıştır 2,3 . On yıl sonra 2013 yılında, yöntem, glikoz32'ye yanıtlarını, fonksiyonelbağlantı modellerini 33 ve bir floresan kalsiyum boyasını membran potansiyel boya34 ile birleştirerek membran potansiyeli ile hücre içi kalsiyum arasındaki ilişkiyi karakterize etmek için CLSM kullanarak adacık hücrelerinin canlı hücre kalsiyum görüntülemesi için başarıyla uyarlanmıştır. Aynı yılın ilerleyen zamanlarında, yöntem22,35 asinar hücrelerinde kalsiyum dinamiklerini değerlendirmek için de kullanıldı. Takip eden yıllarda, pankreas dokusu dilimleri bir dizi farklı çalışmada kullanılmış ve domuz ve insan dokusuna başarıyla adapte edilmiştir 9,36,37,38,39,40,41. Bununla birlikte, birlikte ele alındığında, genel olarak fare pankreas dokusu dilimlerinde ve özellikle adacıklarda kalsiyum görüntüleme hala çoğunlukla bu grup tarafından gerçekleştirilmektedir. Bunun ana nedenlerinden biri, teknik olarak zorlu bir doku dilimi preparatının, konfokal mikroskop ihtiyacının ve oldukça karmaşık veri analizinin kombinasyonunda yatıyor olabilir. Bu makalenin temel amacı, bu güçlü yöntemi diğer potansiyel kullanıcılar için daha erişilebilir hale getirmektir.
Doku dilimi hazırlama ve yapısal ve sekresyon çalışmaları için dilimlerin kullanımı ile ilgili bazı mükemmel metodolojik makaleler zaten vardır, ancak konfokal kalsiyum görüntüleme 9,42,43 için değil. Bu nedenle, bu makale dilimlerin hazırlanması sırasında bazı ek ipuçları ve püf noktalarına, başarılı boya yüklemesi için kritik adımlara, görüntü elde etmeye ve ayrıca temel kalsiyum veri analizinin ana adımlarına odaklanmaktadır. Bu nedenle, bu katkı yukarıda belirtilen yönteme bir alternatif olarak değil, tamamlayıcı olarak görülmelidir. Benzer şekilde, fare pankreas dokusu dilimlerinde kalsiyum görüntüleme, belirli soruları cevaplamak için kullanılacak deneysel bir yaklaşım olarak görülmelidir ve bu nedenle pankreas fizyolojisindeki izole kanallar veya acini, izole adacıklar, organoidler, gözün ön odasına nakledilen adacıklar gibi diğer kalsiyum görüntüleme yaklaşımları için mutlak bir alternatif olmaktan ziyade tamamlayıcı niteliktedir. ve in vivo kayıtlar 11,44,45,46,47,48. Fare pankreas dokusu dilimlerinde kalsiyum görüntülemenin vaadi muhtemelen en iyi şekilde, perisitler49 ve makrofajlar50 gibi adacık mezenkimal hücrelerinde ve ayrıca duktal hücrelerde kalsiyum dinamiklerinin son zamanlarda başarılı bir şekilde kaydedilmesiyle gösterilmektedir23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analytical balance KERN ALJ 120-4</td>
			<td>KERN &#38; SOHN GmbH</td>
			<td>ALJ 160-4A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 II Upright setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td>5100001578</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope Leica TCS SP5 AOBS Tandem II setup</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork pad 15 cm x 15 cm</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;15 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>CLS430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;Round Ice Bucket with Lid, 4 L</td>
			<td>Fischer Scientific, Leicestershire, UK</td>
			<td>432124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Double edge razor blade</td>
			<td>Personna, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 - Fine Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Safe-Lock Tubes 0.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Erlenmeyer flask 200 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.01.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flat orbital shaker&#160; IKA KS 260 basic</td>
			<td>IKA</td>
			<td>Ident. No.: 0002980200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass lab bottle 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>091.01.901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hartman Hemostat, curved</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>13003-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HCX APO L 20x/1.00 W HCX APO L (water immersion objective, 20x, NA 1.0)</td>
			<td>Leica</td>
			<td>15507701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Measuring cylinder 25 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>015.01.025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator Control box SM-7, Keypad SM-7</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>&#160;200-100 900 7311, 200-100 900 9050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave owen</td>
			<td>Gorenje, Slovenia</td>
			<td>MO20MW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmometer Gonotec 010</td>
			<td>Gonotec, Berlin, Germany</td>
			<td>OSMOMAT 010 Nr. 01-02-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paint brush</td>
			<td>Faber-Castell, No.2</td>
			<td></td>
			<td>Any thin soft round paint brush No.2, preferably black</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paper towels</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perifusion pumps</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>ISM 827</td>
			<td>Reglo Analog MS - 4/8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 100/20 mm</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35/10 mm</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>627102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish 35 x 10 mm Nunclon Delta</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>153066</td>
			<td>NON-STICKY for agarose blocks</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH meter inoLab pH Level 1</td>
			<td>WTW, Weilheim, Germany</td>
			<td>E163694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1000 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 50 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>3121 000.066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Push pins 23 mm</td>
			<td>Deli, Ningbo, China</td>
			<td>E0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Semken Forceps</td>
			<td>FST, Germany</td>
			<td>11008-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stabilizing ring for Erlenmeyer flask</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>027.11.048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Nikon SMZ 745</td>
			<td>Nikon, Melville, NY USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Injekt Solo 5 mL</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4606051V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe needle 0.30 x 12 mm (30 G x 1/2&#34;)</td>
			<td>Braun, Melsungen, Germany</td>
			<td>4656300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Luigs &#38; Neumann</td>
			<td>200-100 500 0150, 200-150-500-145</td>
			<td>Slice mini chamber, Temperature controller TC 07</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubings for perifusion system</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>SC0310</td>
			<td>Ismatec Pharmed 1.14 mm(ID) + silicone tubing 1.0 (ID) x 1.8 mm(OD)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic bath Studio GT-7810A</td>
			<td>Globaltronics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrotome Leica VT 1000 S</td>
			<td>Leica, Nussloch, Germany</td>
			<td>14047235613</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Volumetric flask 1000 mL</td>
			<td>IsoLab, Germany</td>
			<td>013.01.910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer Neolab 7-2020</td>
			<td>Neolab</td>
			<td>&#160;7-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath Thermo Haake open-bath circulator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Z527912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Material/Reagent</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate - CaCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>C5080-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-glucose</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>G8270-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D4540-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DL-lactic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>L1250-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas mixture containing 95% O2 and 5% CO2 at barometric pressure</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue Wekem sekundenkleber WK-110</td>
			<td>Wekem GmbH, Bergkamen, Germany</td>
			<td>WK 110-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(+)-ascorbic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>A9,290-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate - MgCl2.2H2O</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>M2670-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>I5125-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oregon Green 488 BAPTA-1, AM</td>
			<td>Invitrogen (Thermo FisherScientific)</td>
			<td>O6807</td>
			<td>cell-permeable Ca2+ indicator (excitation/emission: 495/523 nm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO)</td>
			<td>Invitrogen (Thermo Fisher Scientific)</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>polaxamer: nonionic triblock copolymer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride - KCl</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SeaPlaque GTG agarose</td>
			<td>Lonza, Rockland, USA</td>
			<td>50111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate - NaHCO3</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31437-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride - NaCl</td>
			<td>Honeywell, Germany</td>
			<td>31434-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide - NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>30620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic- NaH2PO4</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>S0751-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma Aldrich, Germany</td>
			<td>15990-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIJI</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>FIJI is an open source project</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LASAF</td>
			<td>Leica microsystems, Inc.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Python</td>
			<td>Python Software Foundation</td>
			<td></td>
			<td>Python is an open source project</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

confocal laser scanning microscopy of calcium dynamics in acute mouse pancreatic tissue slices

Akut fare pankreas doku dilimi, tipik in vitro çalışmalarda tarif edilen izole adacıklardan, acini, kanallardan veya dağınık hücrelerden önemli ölçüde daha az preparat kaynaklı değişiklik gerektiren, korunmuş hücreler arası iletişim ve doku mimarisi ile benzersiz bir in situ preparattır. Konfokal lazer tarama mikroskobunda (CLSM) akut pankreas doku dilimini canlı hücreli kalsiyum görüntüleme ile birleştirerek, kalsiyum sinyalleri aynı anda çok sayıda endokrin ve ekzokrin hücrede, tek hücreli veya hatta hücre altı çözünürlükte incelenebilir. Duyarlılık, değişikliklerin tespitine izin verir ve hücreler arası dalgaların ve fonksiyonel bağlantının incelenmesinin yanı sıra, hücrelerin fizyolojik tepkilerinin adacık içindeki lokalizasyonlarına ve diğer hücrelerle parakrin ilişkilerine bağımlılığının incelenmesini sağlar. Son olarak, hayvan refahı perspektifinden, bir seferde çok sayıda hücreden gelen sinyallerin kaydedilmesi, deneylerde gerekli olan hayvan sayısını azaltarak 3R-değiştirme, azaltma ve arıtma ilkesine katkıda bulunur.

Agaroz çözeltisinin pankreas kanalına enjeksiyonu, pankreas dokusu dilimi hazırlığında en kritik adımdır. Başarılı bir enjeksiyon, Şekil 3A'nın sol tarafında görüldüğü gibi pankreas dokusunun beyazlatılmasıyla tanınabilirken, pankreasın eksik enjekte edilmiş bir kısmı Şekil 3A'nın sağ tarafında sunulmaktadır. Langerhans adacıkları çıplak gözle veya stereomikroskop altında tanınabilir ve bu, agaroz bloklarına daha sonra gömülmek üzere pankreasın uygun kısımlarının kesilmesine yardımcı olur (Şekil 3B). Taze kesilmiş bir fare pankreas dokusu diliminde, Langerhans adacıkları çevredeki ekzokrin doku ve mezenkimden stereomikroskop altında beyaz lekeler (Şekil 3C) veya ışık mikroskobu altında kahverengimsi yapılar olarak kolayca ayırt edilebilir (Şekil 3D). Pankreas dokusu dilimleri, dilimlemeden sonra en az 12 saat boyunca farklı deney türleri için kullanılabilir. Stereomikroskop, ışık mikroskobu ve kalsiyum görüntüleme sırasında hücrelerin fonksiyonel yanıtları altında yapılan brüt morfolojik değerlendirmeye ek olarak, pankreas dokusu dilimlerinin canlılığı da değerlendirilebilir (Şekil 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig04.jpg"> Şekil 4: Doku dilimi içindeki hücrelerin yaşayabilirliği. Canlı/Ölü testi ile hücrelerin canlılığı belirlendi. Canlı hücreler Calcein (yeşil renkle gösterilmiştir) tarafından boyanırken, ölü hücreler ethidium homodimer-1 (kırmızı ile gösterilmiştir) ile boyanır. Sarı çizgiler, altta ve sağda görüntülenen Z yığınının X-Y kesitinin konumunu gösterir. Z-yığınının tam derinliği 88 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Kalsiyum görüntüleme deneyleri için, floresan kalsiyum göstergesinin birkaç hücre katmanından geçmesi gerekir. Şekil 5A, hücre geçirgen Ca2+ gösterge boyasının, bireysel adacık ve asinar hücrelerin tanınabileceği pankreas doku dilimine başarılı bir şekilde yüklenmesini göstermektedir. Buna karşılık, Şekil 5B-D'deki dilimler, boyanın başarısız penetrasyonu (Şekil 5B), adacık hücrelerinin eksikliği (Şekil 5C) ve yüzeydeki çok sayıda nekrotik doku (Şekil 5D) nedeniyle optimal değildir. Bu tür dilimler atılabilir, daha iyi kesilmiş veya lekelenmiş ek adacıkların varlığı kontrol edilebilir (sorun giderme için Tablo 1'e bakınız) veya ekzokrin hücrelerin yanıtlarını kaydetmek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig05.jpg"> Şekil 5: Kullanılabilir ve kullanılamaz preparatlara örnekler . (A) Langerhans adacıklarında iyi boyanmış hücrelerle pankreas dokusu diliminin yanı sıra duktal hücreler ve çevresindeki asinar doku ile başarılı bir şekilde hazırlanmasına bir örnek. (B) Kötü lekelenmiş bir doku dilimi örneği. (C) Yapısal olarak durdurulan Langerhans adacığı örneği. (D) Birçok ölü hücre ve çok fazla enkaz içeren Langerhans adacığına bir örnek. Sağdaki "parıltılı, altta parıldayan" arama tablosu yeşilde 0 yoğunluk ve mavi renkte doygunluk gösterir. Ölçek çubuğu = 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Hücre geçirgen Ca2+ indikatör boyası kullanılarak kalsiyum görüntülemeden elde edilen temsili sonuçlar Şekil 6'da gösterilmiştir. Şekil 6A'da, Langerhans adacığı, asinar doku ve pankreas kanalı içeren bir pankreas dokusu diliminin yüksek çözünürlüklü bir görüntüsü sunulmuştur. Daha iyi bir ayrım için, Şekil 6A'da sunulan pankreas dokusu diliminin endokrin, ekzokrin ve duktal kısmı Şekil 6B'de renklendirilmiştir. Uygun uyaranların kullanılması, farklı adacık hücreleri veya adacık ve adacık olmayan hücreler arasında işlevsel olarak ayrım yapabilir51. Beta hücreleri tipik olarak [Ca2+] IC'de geçici bir artış ile glikoz tarafından kare darbeli bir stimülasyona cevap verecektir ve bunu sürekli bir plato üzerinde hızlı kalsiyum salınımları izleyecektir (Şekil 6C, üst panel).
Tüm beta hücreleri tek, büyük, fonksiyonel bir sinsityuma bağlandığından, bu salınımlar aynı zamanda [Ca 2+]IC dalgaları 32,34,52,53,54 yayılarak farklı hücreler arasında çok iyi senkronize edilir (Şekil 7C). 5-15 dakikalık bir periyotla daha yavaş [Ca2+] IC salınımları, hızlı salınımların altında yatabilir veya hatta 55,56'nın baskın tepki tipi olabilir. Aynı basit protokol, özellikle adacıkların çevresinde başka tepki türlerini de ortaya çıkarabilir (Şekil 6C, alt panel). Bu hücreler beta hücrelerle senkronize edilmediğinden ve düşük glikoz koşullarında zaten mevcut olan daha hızlı ve daha düzensiz salınımlarla veya aktivitede bir azalma ile yanıt verdiğinden, bu tür tepkiler beta olmayan hücreler 21,32,57,58'i oldukça düşündürmektedir. Bununla birlikte, kesin fonksiyonel karakterizasyonları, aşağıda tartışılan ek stimülasyon adımları veya alternatif yaklaşımlarla daha karmaşık protokoller gerektirir. Asinar ve duktal hücrelerin tipik yanıtları sırasıyla Şekil 6D ve Şekil 6E'de sunulmuştur. Asinar ve duktal hücreler hakkında daha fazla bilgi için literatüre bakınız22,23,35.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig06.jpg"> Şekil 6: Farklı pankreas hücresi tiplerinde kalsiyum dinamiğinin temsili sonuçları . (A) Langerhans adacığının çevreleyen dokuya sahip yüksek çözünürlüklü bir görüntüsü. Ölçek çubuğu = 100 μm. (B) Pankreas dokusunun farklı kısımlarının sarı renkte gösterilen asinar doku, kırmızı ile gösterilen Langerhans adacığı ve mavi renkte duktal ağacın bir segmenti ile tanımlanması. Ölçek çubuğu = 100 μm. (C) 12 mM glikoz ile stimülasyon sırasında beta ve varsayılan beta olmayan hücrelerdeki kalsiyum dinamiğinin tipik izleri; Uyarıcı olmayan durumlar için 3 mM glukoz kullanıldı. Beta olmayan hücrelerin daha spesifik ayrımcılığı için kullanılabilecek protokoller tartışma bölümünde açıklanmıştır. (D) 25 nM asetilkolin tarafından uyarılan asinar hücrelerin kalsiyum dinamiklerinin tipik bir izi. (E) 1 mM kenodeoksikolik asit tarafından uyarılan duktal hücrelerin kalsiyum dinamiklerinin tipik bir izi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig06large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Başarılı kalsiyum görüntülemeden sonra, veriler ilk önce protokol bölümünde açıklandığı gibi üstel ve doğrusal bir uyumun bir kombinasyonu ile beyazlatma için dışa aktarılır ve düzeltilir. Beyazlatma düzeltmesinden önce ve sonra bir zaman serisi Şekil 7A'da sunulmuştur. Bundan sonra, yanıtın aktivasyon ve deaktivasyon fazındaki ve plato fazındaki çeşitli parametreler analiz edilebilir. Stimülasyondan sonra [Ca2+]IC artışının başlangıcındaki gecikme, Şekil 7B'deki gecikmeA ve bireysel hücreler arasındaki gecikmelerdeki heterojenite (gecikmeA1) ile temsil edildiği gibi ölçülebilir. Aynı parametreler (gecikmeD ve gecikmeD1) devre dışı bırakma aşamasını tanımlamak için kullanılabilir. İlk geçici [Ca 2+]IC artışını takiben, bir adacıktaki çoğu pankreas beta hücresindeki plato fazı, nispeten düzenli yüksek frekanslı [Ca2+] IC salınımları ile karakterizedir. Plato evresi klasik fonksiyonel parametreler analiz edilerek tanımlanabilir. [Ca2+]IC salınımlarının süresi, sıklığı ve aktif zaman yüzdesinin şematik sunumu Şekil 7C'de sunulmuştur. Kazanım oranları 10 Hz'den yüksek olan kalsiyum görüntülemede, adacık boyunca tekrar tekrar yayılan kalsiyum dalgaları da net bir şekilde tanınabilir (Şekil 7C).
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62293/62293fig07.jpg"> Şekil 7: Zaman serisi verilerinin analizi. (A) Fotobeyazlatma için zaman serisi verilerinin düzeltilmesi. (B) Stimülasyondan sonra aktivasyon ve 12 mM glikoz ile stimülasyonun kesilmesinden sonra deaktivasyon gecikmelerinin analizi. Stimülasyon süresi, görüntüdeki açık gri, gölgeli çubukla gösterilir. (C) Plato fazının çeşitli parametrelerinin analizi: I) Yarı yükseklikte belirlenen salınımın süresi, II) Salınımlar arası aralıklarla belirlenen salınımların sıklığı. III) frekansın bir ürünü olarak aktif zaman ve salınımların süresi. I-IV) Langerhans adacığı boyunca yayılan herhangi bir salınım dalgasındaki salınımlar arasındaki gecikmeler, tek bir hücrenin salınımın yarı yüksekliğine ulaştığı zamandaki gecikmeler (Δt) tarafından belirlenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/62293fig07large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Tablo 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62293/Table%201%20(3).xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices at JoVE.com

Confocal Laser Scanning Microscopy of Calcium Dynamics in Acute Mouse Pancreatic Tissue Slices

Akut pankreas doku dilimlerinin hazırlanmasını ve konfokal lazer tarama mikroskobunda kullanımını, kalsiyum dinamiklerini aynı anda çok sayıda canlı hücrede, uzun zaman periyotlarında ve yüksek uzaysal zamansal çözünürlükte incelemek için sunuyoruz.

Akut Fare Pankreas Doku Dilimlerinde Kalsiyum Dinamiğinin Konfokal Lazer Tarama Mikroskopisi

The acute mouse pancreatic tissue slice is a unique in situ preparation with preserved intercellular communication and tissue architecture that entails ...

Canlı hücre kalsiyum görüntüleme ile kombinasyon halinde, akut pankreas dokusu dilimleme tekniği, hücreler arası dalgaların ve çok hücreli fonksiyonel bağlantının uzun süreler boyunca yüksek çözünürlükte incelenmesini sağlar. Bu tekniğin temel avantajları, hızlı olması, doku mimarisini koruması ve yüksek doku verimini korurken sınırlı enzimatik ve mekanik stresi azaltmasıdır. Hastalığın ilerlemesi sırasında fonksiyonel ve morfolojik değişiklikleri tespit ederek, bu teknik diyabet gibi pankreasla ilgili hastalıkları anlamamıza yardımcı olur.Bu doku dilimleme tekniği, hücreler arası temas, parakrin etkileşimler ve doku mimarisinin korunmasına vurgu yaparak beyin, hipofiz ve adrenal dokulara uygulanabilir. Agarozun fare pankreasına enjekte edilmesine hazırlanmak için, beş mililitrelik bir şırıngayı 40 santigrat derece sıvı agaroz ile doldurun ve şırıngayı 30 gauge iğne ile donatın. İğneyi dikkatlice bir kapakla kapattıktan sonra, şırınga iğnesinin ucunu, tüm agaroz hacmi su yüzeyinin altında, 40 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin.Oksijenasyon ve 7.4 pH sağlamak için bir şişe hücre dışı çözeltiyi karbonhidrat ile, sürekli olarak buz üzerinde, barometrik basınçta ve oda sıcaklığında dakikada 1.5 mililitrede kabarcıklayın. Agaroz enjeksiyonunu gerçekleştirmek için stereo mikroskop altında ötenazi yetişkin bir fare yerleştirin ve laparotomi yoluyla fare karnına erişin. Ortak safra kanalını ortaya çıkarmak için bağırsağı yavaşça sol tarafa hareket ettirin ve Vater'in papillasını bulmak için kanalın duodenal ucunu hafifçe kaldırmak için forseps kullanın.Agarozun kanaldan duodenuma sızmasını önlemek için duodenal papilladaki safra kanalını sıkıştırmak için bir hemostat kullanın ve kanalı pankreas dokusuna bağlayan zarı kırmak için ortak safra kanalının altına ulaşmak için küçük keskin bir forseps kullanın. Kanaldan mümkün olduğunca fazla yağ ve bağ dokusunu temizledikten sonra, kanalı dik olarak bir çift daha büyük forsederin uçlarına yerleştirin ve şırınga pistonuna sıkıca bastırın, viskoz sıvı agarozu ortak safra kanalının proksimal ucuna 20 ila 30 saniye boyunca enjekte edin. Doku beyazımsı hale geldiğinde ve hafifçe şiştiğinde, şırıngayı çıkarın ve dokuyu soğutmak ve agarozu sertleştirmek için pankreas üzerine kabarcıklı buz gibi soğuk hücre dışı çözeltinin 20 mililitresini yavaşça dökün.Pankreas dokusu dilimleri elde etmek için, agaroz enjekte edilen pankreası 40 mililitre buz gibi soğuk hücre dışı çözelti içeren 100 milimetrelik bir Petri kabına nazikçe aktarmak için forseps ve ince sert kesilmiş makas kullanın. Dokuyu durulamak için çanağı döndürün ve pankreası ikinci bir buz gibi soğuk hücre dışı çözelti kabına aktarın. Forseps ve makası kullanarak beyazımsı, iyi enjekte edilmiş pankreas bölümünü altı adet 0,1 ila 0,2 santimetreküp parçaya kadar kesin ve kalan bağ ve yağ dokusunu doku parçalarından çıkarın.Temizlenmiş blokları, yaklaşık beş mililitre 40 santigrat derece sıvı agaroz içeren 35 milimetre yapışkan olmayan bir alt Petri kabına yerleştirin ve Petri kabını hemen buzun üzerine yerleştirin. Agaroz sertleştiğinde, Petri kabını 100 milimetrelik bir Petri kabının kapağı üzerinde baş aşağı tutun ve agarozu tabaktan çıkarmak için Petri kabının yanal duvarı ile agaroz arasındaki kenar boşluğuna dikkatlice kesmek için bir tıraş bıçağının yarısını kullanın. Her biri bir doku bloğu agaroz içeren tek tek küpleri serbest bırakılmış agarozdan kesmek için tıraş bıçağını kullanın ve blokları bir vibratomun numune plakasına bağlamak için siyanoakrilat yapıştırıcı kullanın.Vibratomun kesme odasını, sürekli olarak karbojenle kabarcıklanmış 150 mililitre buz gibi soğuk hücre dışı çözelti ile doldurun. Numune plakasını vibratomun üzerine vidalayın ve yeni bir tıraş bıçağı takın. Odayı buzla çevreleyin ve altı milimolar glikoz ile desteklenmiş hücre dışı çözelti ile yapılmış iki adet 10 mililitre hacimli buz küpü ekleyin.Dilimleyiciyi saniyede 0,05 ila 1 milimetre ve 70 hertz'e ayarlayın, ardından 20 ila 100 milimetre kare yüzey alanına sahip 140 mikron kalınlığında agaroz dilimleri elde etmek için dilimlemeye başlayın. Her dilimi, altı milimolar glikozla desteklenmiş 40 milimetre HEPES tamponu ile doldurulmuş 100 milimetrelik bir Petri kabına dikkatlice aktarmak için ince bir boya fırçası kullanın. Kalsiyum boya hazırlığı için, 50 mikrogram hücre geçirgen kalsiyum gösterge boyası, 7.5 mikrolitre DMSO ve 2.5 mikrolitre poloksamer ve 6.667 mililitre HBS'yi 15 mililitrelik bir vidalı kapak tüpünde çözün.Tüpü ultrasonik bir banyo odasına batırmadan ve her biri 30 saniye boyunca girdaba batırmadan önce çözeltiyi 20 saniye boyunca iyice karıştırmak için bir pipet kullanın. Daha sonra elde edilen kalsiyum indikatör boya çözeltisinin 3.333 mililitrelik aliquot'u, etiketlenecek 10 dilim doku başına bir 5 mililitre Petri kabına dönüştürür. Boya yüklemesi için, her bir boya çözeltisi kabına 10 adede kadar doku dilimi aktarmak için ince yumuşak bir boya fırçası kullanın ve bulaşıkları oda sıcaklığında 50 dakika ve ışıktan korunan dakikada 40 devir boyunca yörüngesel bir çalkalayıcıya yerleştirin.Kuluçkanın sonunda, boyasız HBS ile doldurulmuş bireysel 60 mililitrelik Petri kaplarına 20 adede kadar lekeli dilim aktarın. Konfokal mikroskopi ile kalsiyum görüntüleme için 20 veya 25 kat büyütme seçin ve edinme modunu hızlandırılmış görüntülemeye, iğne deliğini 100 ila 200 mikrona ve deneyde kullanılan florofor için uyarma ve emisyona ayarlayın. Kayıt odasını ve perfüzyon sistemini mikroskobun sıcaklık kontrollü aşamasına monte edin ve giriş ve çıkışı kayıt odasının uzak kenarlarına yerleştirin.Giriş ve çıkış hızlarını dakikada bir ila iki mililitreye ayarlayın. Profüzyon sisteminin sıcaklığını 37 santigrat dereceye ayarlayın ve uyarıcı olmayan çözelti ile bolluğu başlatın. Dokunun kalsiyum dinamiklerini kaydetmek için kayıt odasına tek bir doku dilimi yerleştirin ve dokuyu gergin bir naylon ağ ile U şeklinde bir platin ağırlığı ile hareketsiz hale getirin.İlgilenilen yapıyı bulmak için parlak alan seçeneğini kullanın ve incelenen yapıları görüş alanına konumlandırmak için canlı görüntülemeyi kullanın. Sinyal-gürültü oranını optimize etmek için, lazer gücünü, dedektör amplifikasyonunu ve çizgi ortalaması bağlamayı ayarlayarak lazer gücünü minimumda tutun. Potansiyel olarak hasar görmüş hücrelerden kayıt yapılmasını önlemek ve görüntüleri elde etmek için odak düzlemini kesme yüzeyinin 15 mikron altına ayarlayın.Tek tek salınımların ilk algılanmasına izin vermek ve yüksek çözünürlüklü bir görüntü kaydetmek için örnekleme frekansını bir ila iki hertz'e ayarlamak. Varsa, hazırlık yanıtı, aşırı aydınlatma, fotobeyazlatma ve mekanik sapma hakkında anında geri bildirim almak için çevrimiçi bir grafik kullanın. Tüm görüntüler elde edildiğinde, verileri daha sonra analiz etmek üzere kaydedin.Burada, hücre geçirgen kalsiyum gösterge boyasının pankreas dokusu dilimine başarıyla yüklendiği optimal bir doku dilimi örneği gözlemlenebilir. Buna karşılık, bu doku dilimleri, başarısız bir boya penetrasyonu, adacık hücrelerinin eksikliği veya numune yüzeyinde bol miktarda nekrotik doku nedeniyle görüntüleme için en uygun değildir. Bir pankreas dokusu diliminin yüksek çözünürlüklü görüntüleri, Langerhans adacıkları, asinar doku veya pankreas kanalı gibi pankreas dokusunun farklı bölgelerini tanımlamak için kullanılabilir.Uyaranlar, farklı adacık hücreleri arasında veya adacık ve adacık olmayan hücreler arasında işlevsel olarak ayrım yapmak için kullanılabilir. Örneğin, beta hücreleri tipik olarak hücre içi kalsiyumda geçici bir artış göstererek kare darbeli glikoz stimülasyonuna yanıt verir ve ardından sürekli bir plato üzerinde hızlı bir kalsiyum salınımı gösterir. Buna karşılık, beta olmayan hücreler daha hızlı ve daha düzensiz salınımlarla yanıt verir.Stimülasyondan sonra hücre içi kalsiyum artışının başlangıcındaki gecikmenin yanı sıra bireysel hücreler arasındaki heterojenlik ve gecikmeler de ölçülebilir. Aynı parametreler devre dışı bırakma aşamasını tanımlamak için de kullanılabilir. Burada hücre içi kalsiyum salınım süresinin, sıklığının ve aktif zaman yüzdesinin şematik bir sunumu gözlemlenebilir.10 hertz'den daha yüksek edinme hızlarında görüntüleme yapıldığında, adacık boyunca tekrar tekrar yayılan kalsiyum dalgaları açıkça tanınabilir. Pankreasa giren dalın yanlışlıkla tıkanmasını önlemek için ortak safra kanalını duodenuma mümkün olduğunca yakın kelepçeleyin. Ayrıca, enjeksiyon sırasında pistonu bastırmayı bırakmayın, çünkü agaroz iğnede hemen sertleşir.Akut fare pankreas dokusu dilimleme tekniği, iyon kanalı akımlarını incelemek ve sitoza erişmek için yama kelepçesi yöntemi ile immünohistokimya çalışmaları ve sekreter çalışmaları ile birlikte de kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Eşodaklı ve multiphoton Mikroskopi kullanarak beş Floresan Proteinleri ile işaretlenmiş Hematopoetik kök hücrelerin in vivo klonal Takip

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Scanning Electron Microscopy of Macerated Tissue to Visualize the Extracellular Matrix

Macerated Tissue taramalı elektron mikroskobu Ekstraselüler Matrix Visualize&#39;a

Fibrosis is a component of all forms of heart disease regardless of etiology, and while much progress has been made in the field of cardiac matrix ...

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Real Time In Vivo Tracking of Thymocytes in the Anterior Chamber of the Eye by Laser Scanning Microscopy

Gerçek zamanlı timositleri mikroskobu tarama lazer göz ön odasında Vivo içinde Takibi

The purpose of the method being presented is to show, for the first time, the transplant of newborn thymi into the anterior eye chamber of isogenic adult ...

Imaging Calcium Dynamics in Subpopulations of Mouse Pancreatic Islet Cells

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Pancreatic islet hormones regulate blood glucose homeostasis. Changes in blood glucose induce oscillations of cytosolic calcium in pancreatic islet cells ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Floresans canlı hücre mikroskobu ile mitotik ve meiotic Fission Maya nükleer dinamiklerinin incelenmesi

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Mitokondriyal Peroksit için Oransal Bir Biyosensör olan mtHyPer7'nin Canlı Maya Hücrelerinde Görüntülenmesi

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...

Intravital Imaging Using an Inverted Microscope to Track Skin Cell Dynamics

Streamlined Intravital Imaging Approach for Long-Term Monitoring of Epithelial Tissue Dynamics on an Inverted Confocal Microscope

Developing a Tool for Using Inverted Confocal Microscopes for In Vivo Intravital Imaging (Video) | JoVE

Epitel Doku Dinamiğinin İnverted Konfokal Mikroskopta Uzun Süreli İzlenmesi için Kolaylaştırılmış İntravital Görüntüleme Yaklaşımı

Understanding normal and aberrant in vivo cell behaviors is necessary to develop clinical interventions to thwart disease initiation and progression. It ...

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging

Biological Samples Preparation for Confocal Microscopy, Image Acquisition Setup, and Confocal Microscopy Imaging (Video) | JoVE 

Konfokal Mikroskopi, Görüntü Toplama Kurulumu ve Konfokal Mikroskopi Görüntüleme için Biyolojik Numune Hazırlama