Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

تم تمويل هذا البحث من قبل Megaproject of Infectious Disease Control من وزارة الصحة الصينية ، رقم المنحة 2017ZX10302301-005 ومركز الأبحاث الصيني الأفريقي المشترك ، رقم المنحة SAJC201605.

بيان أخلاقي معهد ووهان لعلم الفيروسات (WHIOV) هو من بين المختبرات والمعاهد المعتمدة من قبل مركز السيطرة على الأمراض الصيني في مدينة ووهان لإجراء أبحاث حول SARS-CoV-2 واكتشاف COVID-19 من العينات السريرية. كما تمت الموافقة على البحث حول تطوير تقنيات تشخيصية جديدة ل COVID-19 باستخدام العينات الس...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

تتوفر موارد قليلة حول كيفية تطوير مقايسات RT-ddPCR للكشف عن SARS-CoV-2. على الرغم من عدم استخدامها في هذه المقالة ، يمكن استخدام العينات القياسية ذات النسخ المعروفة لتطوير المقايسات وتحسينها. ومع ذلك ، في هذا العمل ، تم رفع عينات SARS-CoV-2 المزروعة في خلايا Vero-E6 في خلفية الحمض النووي الريبي الجيني البش...

شهد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) ، وهو تقنية معترف بها جيدا ، العديد من التحولات منذ ظهوره ليصبح تقنية قوية قادرة على تقديم إجابات لأبحاث الحمض النووي. كانت هذه التحولات تحسينا مستمرا للتقنية القديمة. يمكن تلخيص هذه التحولات في ثلاثة أجيال1. الجيل الأول هو تفاعل البوليميراز المتسلسل التقليدي الذي يعتمد على الرحلان الكهربائي الهلامي لتحديد الأهداف المضخمة واكتشافها. الجيل الثاني هو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي (qPCR) الذي يمكنه اكتشاف العينات في الوقت الفعلي والاعتماد على منحنى قياسي لتحديد الأهداف مباشرة في العينة. يمكن للجيل الثالث ، PCR الرقمي (dPCR) ، إجراء كل من الكشف والقياس الكمي المطلق لأهداف الحمض النووي دون الحاجة إلى منحنى قياسي. كما تم تحسين dPCR بشكل أكبر من غرف التفاعل التي يتم فصلها بواسطة آبار الجدار إلى مستحلبات من النفط والماء والمواد الكيميائية المستقرة داخل نفس البئر كما هو موضح في تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي2 القائم على القطيرات. في تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي للقطرات (ddPCR) ، يتم تقسيم العينة إلى آلاف القطرات بحجم النانو لتر التي تحتوي على أهداف فردية سيتم تحديدها لاحقا باستخدام إحصائيات بواسون2،3،4. تمنح هذه التقنية ddPCR ميزة في تحديد الأهداف الوفيرة المنخفضة عند مقارنتها بالأجيال الأخرى من تفاعل البوليميراز المتسلسل.
في الآونة الأخيرة ، أبرزت تطبيقات متعددة تفوق ddPCR على qPCR شائع الاستخدام عند اكتشاف وتحديد الأهداف منخفضة الوفرة1،5،6. SARS-CoV-2 ليس استثناء من هذه التطبيقات7،8،9،10،11،12. منذ تفشي SARS-CoV-2 ، يعمل العلماء على جميع الجبهات للتوصل إلى حلول حول كيفية تشخيص الفيروس واكتشافه بكفاءة. لا يزال المعيار الذهبي الحالي هو qPCR13. ومع ذلك ، فقد ثبت أن RT-ddPCR أكثر دقة في الكشف عن أهداف SARS-CoV-2 منخفضة الوفرة من كل من العينات البيئية والسريرية عند مقارنتها ب RT-qPCR7،8،9،10،11،12. تعتمد معظم الأعمال المنشورة ل SARS-CoV-2 ddPCR على المقايسات البسيطة مع المقايسات المتعددة اعتمادا على المقايسات التجارية. ومن ثم ، ينبغي بذل المزيد من الجهد لشرح كيفية تطوير مقايسات RT-dPCR متعددة الإرسال للكشف عن SARS-CoV-2.
في تصميم الفحص المناسب ، يمكن استخدام تعدد الإرسال لتوفير التكلفة ، وزيادة إنتاجية العينة ، وزيادة عدد الأهداف التي يمكن اكتشافها بحساسية داخل عينة صغيرة. عند تعدد الإرسال باستخدام ddPCR ، يجب على المرء أن يأخذ في الاعتبار عدد الفلوروفورات التي يمكن اكتشافها في نظام معين. يمكن لبعض منصات ddPCR دعم ما يصل إلى ثلاث قنوات بينما يدعم البعض الآخر قناتين فقط. ومن ثم ، عند تعدد الإرسال بقناتين ، يتعين على المرء استخدام أساليب مختلفة ، بما في ذلك تعدد الإرسال من أجل أعلى للكشف عن أكثر من هدفين14،15،16. في هذا العمل ، تم استخدام نظام الكشف عن ddPCR بلونين لإظهار خطوات حول كيفية تطوير فحوصات مختلفة ل SARS-CoV-2 RT-ddPCR يمكن تكييفها لتطبيقات بحثية مختلفة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

يعد تشخيص جائحة SARS-CoV-2 المستمرة أولوية لجميع البلدان في جميع أنحاء العالم. حاليا ، يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي للنسخ العكسي (RT-qPCR) هو المعيار الذهبي لتشخيص SARS-CoV-2 حيث لا يتوفر حل دائم. على الرغم من فعالية هذه التقنية ، فقد ظهرت الأبحاث التي تظهر حدودها في الكشف والتشخيص خاصة عندما يتعلق الأمر بالأهداف الوفيرة المنخفضة. في المقابل ، ثبت أن تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات (ddPCR) ، وهي تقنية ناشئة حديثة ذات مزايا فائقة على qPCR ، تتغلب على تحديات RT-qPCR في تشخيص SARS-CoV-2 من عينات مستهدفة منخفضة الوفرة. في المستقبل ، في هذه المقالة ، يتم توسيع قدرات RT-ddPCR بشكل أكبر من خلال إظهار خطوات حول كيفية تطوير مقايسات المسبار البسيط ، والمزدوج ، والثلاثي ، والرباعي باستخدام نظام الكشف بلونين. باستخدام الاشعال والمجسات التي تستهدف مواقع محددة من جينوم SARS-CoV-2 (N و ORF1ab و RPP30 و RBD2) ، تبين أن تطوير هذه المقايسات ممكن. بالإضافة إلى ذلك ، يتم توفير بروتوكولات مفصلة خطوة بخطوة وملاحظات واقتراحات حول كيفية تحسين سير عمل المقايسات وتحليل البيانات. سيضمن تكييف سير العمل هذا في الأعمال المستقبلية إمكانية اكتشاف الحد الأقصى لعدد الأهداف بحساسية في عينة صغيرة مما يحسن بشكل كبير التكلفة وإنتاجية العينة.

في دراسة إثبات المفهوم ، تم اختبار الأداء التحليلي للمقايسات المتعددة على العينات السريرية والبحثية19. كان أداء مقايسات تعدد الإرسال متفوقا على أداء RT-PCR19. نظرا لأن الأعداد المنخفضة من القطرات قد تشير إلى وجود مشكلة أثناء توليد القطيرات ، فقد تم في هذه المقالة تعي...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

يلخص هذا العمل خطوات تطوير فحوصات مختلفة للكشف عن SARS-CoV-2 باستخدام نظام ddPCR بلونين. الخطوات مفصلة وتم تضمين ملاحظات حول كيفية تحسين المقايسات وأداء التجربة. يمكن استخدام هذه المقايسات للعديد من تطبيقات SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

بروتوكولات تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمية لقطرات النسخ العكسي المكونة من خطوتين للكشف عن SARS-CoV-2 وقياسه

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

يمكن استخدام هذه البروتوكولات لتطوير مقايسات ddPCR متعددة الإرسال الداخلية للكشف عن SARS-CoV-2 باستخدام نظام ddPCR بلونين. هذا مفيد للأشخاص الذين يرغبون في تطوير مجموعاتهم الخاصة للكشف عن SARS-CoV-2 ومسببات الأمراض الأخرى. بالمقارنة مع المعيار الذهبي RT-qPCR ، يمكن استخدام RT-ddPCR لتحديد جينات SARS-CoV-2 المتعددة دون الحاجة إلى منحنى قياسي.نظرا لأن ddPCR هي تقنية ناشئة ، فإن العرض المرئي مهم لمساعدة المستخدمين الحاليين والمستقبليين على فهم وتطوير مقايسات متعددة الإرسال بسهولة للكشف عن SARS-CoV-2 ومسببات الأمراض الأخرى. لتخليق cDNA ، أضف ميكرولتر من المزيج الرئيسي للنسخ العكسي 5X ، وخمسة ميكرولترات من عينة الحمض النووي الريبي ذات الأهمية ، وثلاثة ميكرولترات من الماء المقطر المزدوج الخالي من RNase في أنبوب PCR 100 أو 200 ميكرولتر إلى حجم نهائي يبلغ 10 ميكرولتر كمحلول ، وضع الأنبوب على الجليد. عند إضافة الكواشف ، قم بتحميل العينة في دورة حرارية واضبط الأداة لتشغيل النسخ العكسي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، وتعطيل الحرارة للنسخ العكسي لمدة 5 ثوان عند 85 درجة مئوية ، وعقد نهائي لانهائي عند أربع درجات مئوية.قبل إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الرقمي بالقطرات ، أضف 19.8 ميكرولترا من المزيج الرئيسي المعد حديثا إلى العدد المناسب من الآبار للوحة PCR الرقمية الخالية من النيوكلياز المكونة من 96 بئرا. أضف 2.2 ميكرولتر من cDNA إلى كل بئر من المزيج الرئيسي إلى حجم نهائي يبلغ 22 ميكرولترا من مزيج التفاعل لكل بئر وأغلق اللوحة باستخدام مانع تسرب لوحة PCR يمكن التخلص منه. ثم ، دوامة لوحة لمدة 15 إلى 30 ثانية في أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 إلى 15 ثانية لجمع محتويات البئر في الجزء السفلي من اللوحة.لإنشاء القطرات تلقائيا على شاشة اللمس الآلية لمولد القطرات، انقر فوق تكوين لوحة العينة وحدد الأعمدة التي توجد بها العينات على لوحة العينة. انقر فوق موافق وافتح باب مولد القطيرات الآلي. قم بتحميل لوحات توليد العينات والقطرات والمواد الأخرى اللازمة للتجربة في المواقع المعنية داخل الجهاز وأغلق الباب.عندما تتحول شاشة اللمس إلى اللون الأخضر ، مما يشير إلى أن جميع المواد قد تم تحميلها في مواضعها الصحيحة ، حدد الزيت للمجسات وابدأ في توليد القطيرات. انتظر حتى يكتمل إنشاء القطرات وفقا للوقت المشار إليه على الشاشة. عندما تقول الشاشة أن القطرات جاهزة ، افتح الباب لإزالة اللوحة التي تحتوي على القطرات واستخدم سدادة اللوحة لمدة خمس ثوان عند 180 درجة مئوية لإغلاق اللوحة بختم رقائق قابل للثقب.في غضون 30 دقيقة من توليد القطيرات ، ضع لوحة القطيرات المختومة في جهاز تدوير حراري عميق للبئر 96. اضبط حجم العينة على 40 ميكرولتر ودرجة حرارة الغطاء على 105 درجة مئوية. ثم ، PCR تضخيم القطرات.لقراءة القطيرات ، بعد التضخيم ، انقل اللوحة الحرارية المدورة ذات 96 بئرا إلى قارئ قطرات وافتح البرنامج المصاحب على جهاز كمبيوتر متصل بقارئ القطيرات. من وضع الإعداد ، حدد جديد وانقر نقرا مزدوجا فوق أي بئر لفتح مربع حوار محرر البئر. حدد الآبار المراد قراءتها واضبط التجربة على القياس الكمي المطلق ، والمزج الفائق لإسقاط المزيج الرقمي PCR للمجسات.استهدف نوعا واحدا إلى القناة 1 غير معروفة واستهدف نوعين إلى القناة 2 غير معروفة. قم بتعيين أسماء العينات بناء على تخطيط اللوحة وانقر فوق تطبيق وموافق. بعد حفظ القالب، انقر فوق تشغيل.عندما يطلب منك البرنامج ، حدد لون FAM / HEX. في نهاية الحصول على البيانات ، قم بإزالة اللوحة من القارئ. قبل تحليل البيانات ، تحقق من البيانات من جميع الآبار للحصول على العدد الإجمالي للقطرات.وقم بتعيين حد فاصل لقبول الحد الأدنى لعدد القطرات ليتم احتسابها كنتائج إيجابية أو سلبية. لتحليل الفحص البسيط والمزدوج ، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف QLP ليتم تحليله وحدد تحليل. استخدم أدوات عتبة السعة 1D والسعة 2D للتمييز بين القطرات الموجبة والسالبة لكل بئر في القناة الصحيحة ، باستخدام التحكم في قالب العقدة وعينات التحكم الإيجابية كدليل.بعد ذلك، قم بتصدير النتائج كملف CSV لإجراء تحليل إضافي. لفحص مزيج المسبار الثلاثي ، افتح ملف QLP وحدد الآبار المراد تحليلها في علامة تبويب محرر اللوحة. اضبط نوع التجربة على القياس الكمي المباشر والفحص على فحص المزيج الثلاثي ، وأدخل الاسم المستهدف.ثم انقر فوق تطبيق. استخدم أدوات الرسم البياني لتعيين ألوان معينة لمجموعات مستهدفة مختلفة وفقا لتوجيهات اقتراحات نافذة الكتلة المنبثقة. عندما يتم تعيين جميع الألوان المستهدفة ، سيتم عرض بيانات القياس الكمي في نافذة بيانات البئر.تصدير البيانات كملف CSV للتحليل النهائي. بالنسبة للمقايسة الرباعية ، اضبط نوع التجربة على القياس الكمي المباشر والفحص على مضاعف السعة. أدخل اسم الهدف وانقر فوق تطبيق.استخدم أدوات الرسم البياني لتعيين ألوان معينة لمجموعات مستهدفة مختلفة وفقا لتوجيهات اقتراحات نافذة الكتلة المنبثقة. عندما يتم تعيين جميع الألوان المستهدفة ، سيتم عرض بيانات القياس الكمي في نافذة بيانات البئر. تصدير البيانات كملف CSV لإجراء تحليل إضافي.كما لوحظ في تحليل تدرج درجة الحرارة التمثيلي هذا ، لم تستطع درجات حرارة الركوع المرتفعة التمييز بوضوح بين القطرات الموجبة والقطرات السالبة عند تشغيل اختبار مزدوج. ومع ذلك ، مع انخفاض درجة حرارة الركوع ، تم تحقيق الفصل الأمثل بين القطرات الإيجابية والسلبية. باستخدام نظام الكشف عن PCR الرقمي بقطرتين RT بلونين ، من الممكن اكتشاف هدف واحد واثنين وثلاثة وأربعة أهداف SARS-CoV-2 داخل عينة واحدة.يمكن استخدام عينة تحكم بدون قالب لتحديد موقع القطرات السالبة للمساعدة في تعيين العتبة السالبة في المقايسات البسيطة. في المقايسات المزدوجة ، يمكن إجراء التحليل في قنوات فردية أو في سعة 2D. على الرغم من أن تحليل بيانات المقايسات المتعددة ذات الترتيب الأعلى ليس سهلا ، إلا أن هذه المقايسات مفيدة ، لأنها تسمح بتقييم ما يصل إلى ثماني مجموعات قطرات في مقايسات مزيج المسبار الثلاثي وما يصل إلى 16 مجموعة قطرات للمقايسات القائمة على السعة الرباعية.اعتمادا على الفحص المراد تطويره ، تأكد من إضافة تركيزات التمهيدي والمسبار المستهدفة الصحيحة إلى المزيج الرئيسي. باستخدام هذا الإجراء ، يمكن للمرء تبديل الأهداف لتطوير مقايسات RT-ddPCR جديدة. يمكن استخدام هذه المقايسات لأغراض بحثية مختلفة أو لتشخيص الأمراض المعدية الناشئة.منذ تطويرها ، تم استخدام هذه التقنية لتحديد دقيق لنسخ الحمض النووي الفيروسي في معايير مختلفة ، وجسم الإنسان ، والعينات البيئية.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

PCR متعددة وعكس الخط الفحص لطخة تهجين (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

PCR الأمثل القائم على الكشف عن المفطورة

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

عزل خلايا الكبد البشرية من قبل خطوتين كولاجيناز الإرواء الداخلي

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

توظيف الرقمية القطرة PCR لكشف الطفرات BRAF V600E في البارافين جزءا لا يتجزأ من خطوط الخلايا المعيار المرجعي الفورمالين الثابتة

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

القياس الكمي المطلق من مستويات البلازما MicroRNA في القرود سينومولوغوس، استخدام النسخ العكسي في الوقت الحقيقي الكمي PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

تحليل الكائنات المجهرية باستخدام ثنائي الخطوة PCR والجيل التالي من 16S rRNA التسلسل الجيني

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

استراتيجية من خطوتين تجمع بين التعديل اللاجيني والإشارات الميكانيكية الحيوية لتوليد خلايا الثدييات متعددة القدرات

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

مسح البيئة الحضرية - خط أنابيب لأخذ عينات من السارس -CoV-2 والكشف عنه من الخزانات البيئية

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

تصوير بؤري عالي الإنتاجية لمشمشات سبايك SARS-CoV-2 ذات النقاط الكمومية لتتبع الارتباط وكثرة الخلايا الداخلية في خلايا HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

القياس الكمي للحمض النووي الريبي الدائري باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل بالقطرات الرقمية

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...