Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
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本研究由中国卫生部传染病控制特大项目资助，批准号为2017ZX10302301-005，中非联合研究中心，批准号SAJC201605。

道德声明 武汉病毒研究所（WHIOV）是武汉市中国疾病预防控制中心批准的实验室和研究所之一，可以进行SARS-CoV-2研究并从临床样本中检测COVID-19。利用临床样本开发COVID-19新诊断技术的研究也已获得武汉病毒研究所伦理委员会（2020FCA001）的批准。
1. 样品处理工作流程（图1A）
注意：在整个方案中，重要的是使用带有专?...

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	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

关于如何开发用于SARS-CoV-2检测的RT-ddPCR检测方法的资源很少。虽然本文未使用，但具有已知拷贝的标准样品可用于开发和优化测定。然而，在这项工作中，在Vero-E6细胞中生长的SARS-CoV-2样品在人类基因组RNA的背景中加标，并用作开发测定的标准样品。在开发检测方法时，正确的引物和探针序列至关重要。由于SARS-CoV-2 RT-ddPCR的大多数初步工作都使用了中国CDC的引物和靶向ORF1ab和N基因的探针，因此他...

聚合酶链反应（PCR）是一种公认的技术，自问世以来经历了几次转变，成为一种能够为核酸研究提供答案的强大技术。这些转变是对旧技术的不断改进。这些转变可以概括为三代1。第一代是传统的PCR，依靠凝胶电泳来定量和检测扩增的靶标。第二代是实时定量PCR（qPCR），可以实时检测样品，并依靠标准曲线直接量化样品中的靶标。第三代数字PCR（dPCR）可以同时进行核酸靶标的检测和绝对定量，而无需标准曲线。dPCR也得到了进一步改进，从反应室被壁孔分离成油，水和稳定化学品的乳液，在同一孔内看到的，如基于液滴的数字PCR2所示。在液滴数字PCR（ddPCR）中，样品被分成数千个纳升大小的液滴，其中包含单个靶标，稍后将使用泊松统计量2，3，4进行定量。与其他几代PCR相比，该技术使ddPCR在定量低丰度靶标方面具有优势。
最近，多项应用强调了ddPCR在检测和定量低丰度靶标1，5，6时优于常用的qPCR。SARS-CoV-2也不例外7，8，9，10，11，12。自SARS-CoV-2爆发以来，科学家们一直在各个方面开展工作，以提出如何诊断病毒并有效检测病毒的解决方案。目前的黄金标准仍然是qPCR13。然而，与RT-qPCR 7、8、9、10、11、12 相比，RT-ddPCR 在检测环境和临床样本中的低丰度 SARS-CoV-2 靶标方面被证明更准确。大多数SARS-CoV-2 ddPCR发表的工作都依赖于单纯形检测，多重检测则取决于商业检测。因此，应该做更多的工作来解释如何开发用于SARS-CoV-2检测的多重RT-dPCR检测。
在适当的检测设计中，多重检测可用于节省成本，提高样品通量，并最大限度地增加小样品中可灵敏检测的靶标数量。使用ddPCR进行多重检测时，必须考虑在特定系统中可以检测到多少荧光团。一些 ddPCR 平台最多可以支持三个通道，而其他平台仅支持两个通道。因此，当使用两个通道进行多路复用时，必须使用不同的方法，包括高阶多路复用来检测两个以上的目标14，15，16。在这项工作中，使用双色ddPCR检测系统来展示如何开发不同的SARS-CoV-2 RT-ddPCR检测的步骤，这些检测方法可以适应不同的研究应用。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

诊断正在进行的SARS-CoV-2大流行是全球所有国家的优先事项。目前，逆转录定量PCR（RT-qPCR）是SARS-CoV-2诊断的金标准，因为没有永久的解决方案可用。无论这种技术多么有效，研究表明其在检测和诊断方面的局限性，特别是在涉及低丰度靶标时。相比之下，微滴数字PCR（ddPCR）是一种与qPCR相比具有优越优势的最新新兴技术，已被证明可以克服RT-qPCR在诊断低丰度目标样本SARS-CoV-2方面的挑战。展望未来，在本文中，RT-ddPCR的功能通过展示如何使用双色检测系统开发单工、双链、三链探针混合物和四链体测定的步骤来进一步扩展。使用靶向SARS-CoV-2基因组特定位点（N、ORF1ab、RPP30和RBD2）的引物和探针，这些测定的开发被证明是可能的。此外，还提供了有关如何改进检测工作流程和分析数据的分步详细方案、注释和建议。在未来的工作中调整该工作流程将确保在小样品中灵敏地检测到最大数量的靶标，从而显著降低成本和样品通量。

在一项概念验证研究中，对临床和研究样品进行了多重分析分析性能测试19。多重检测的性能优于RT-PCR19。由于液滴数量少可能表明液滴生成过程中存在问题，因此在本文中，根据经验数据设定了每孔10，000个液滴的截止值。
正负液滴之间的良好分离以及最小的雨水干扰有助于数据分析。因此，在一个好的实验中，分析优化是关键<sup class="xr...

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Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

这项工作总结了使用双色ddPCR系统开发SARS-CoV-2检测的不同检测方法的步骤。这些步骤很详细，并且已经包括有关如何改进测定和实验性能的说明。这些检测可用于多种SARS-CoV-2 RT-ddPCR应用。

用于SARS-CoV-2检测和定量的两步逆转录液滴数字PCR方案

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

这些协议可用于开发内部多重 ddPCR 检测，用于使用双色 ddPCR 系统检测 SARS-CoV-2。这对于想要开发自己的试剂盒来检测SARS-CoV-2和其他病原体的人来说很有用。与金标准 RT-qPCR 相比，RT-ddPCR 可用于定量多个 SARS-CoV-2 基因，而无需标准曲线。由于 ddPCR 是一种新兴技术，因此视觉演示对于帮助当前和未来的用户了解和轻松开发用于 SARS-CoV-2 检测和其他病原体的多重检测非常重要。对于cDNA合成，将两微升5X逆转录预混液，5微升目标RNA样品和3微升无RNase双蒸水中加入100或200微升PCR管中至最终体积为10微升作为溶液，并将管放在冰上。添加试剂后，将样品加载到热循环仪中，并将仪器设置为在 37 摄氏度下运行逆转录 15 分钟，在 85 摄氏度下对逆转录进行 5 秒的热灭活，并在 4 摄氏度下最终无限保持。在进行液滴数字PCR之前，将19.8微升新鲜制备的预混液加入到无核酸酶96孔液滴数字PCR板的适当孔数中。向预混液的每个孔中加入2.2微升cDNA，每孔的最终体积为22微升反应混合物，并用一次性PCR板密封机密封板。然后，在离心机中将板涡旋15至30秒10至15秒，以收集板底部的孔内容物。要在自动液滴发生器触摸屏上自动生成液滴，请单击配置样品板并选择样品位于样品板上的色谱柱。单击确定并打开自动液滴发生器门。将样品和液滴发生板以及实验所需的其他材料装入仪器内的相应位置并关闭门。当触摸屏变为绿色时，表示所有材料都已加载到正确的位置，为探头选择油并开始产生液滴。等待液滴生成根据屏幕上指示的时间运行完成。当屏幕显示液滴准备就绪时，打开门以取出包含液滴的板，并在 180 摄氏度下使用板封口机五秒钟，用可刺穿的箔密封密封板。在液滴产生后 30 分钟内，将密封的液滴板放入 96 深孔热循环仪中。将样品体积设置为 40 微升，将盖子温度设置为 105 摄氏度。然后，PCR扩增液滴。对于液滴读数，扩增后，将热循环的96孔板转移到液滴读数器中，并在连接到液滴读取器的计算机上打开随附的软件。在设置模式下，选择新建并双击任何孔以打开井编辑器对话框。选择要读取的孔并将实验设置为绝对定量，超混料到液滴数字PCR超混料，用于探针。将一种类型定位到通道 1 未知，将两种类型定位到通道 2 未知。根据板布局分配样品名称，然后单击应用并确定。保存模板后，单击运行。当软件提示时，选择 FAM/HEX 颜色。在数据采集结束时，从阅读器上取下板。在分析数据之前，检查所有孔的数据以获得液滴总数。并设置一个截止值，以接受最小数量的液滴计为阳性或阴性结果。对于单纯和双链分析，请双击要分析的 QLP 文件，然后选择分析。使用1D振幅和2D振幅阈值工具区分正确通道中每个孔的正液滴和负液滴，使用节点模板对照和阳性对照样品作为指导。然后，将结果导出为 CSV 文件以进行其他分析。对于三重探针混合测定，打开QLP文件并在板编辑器选项卡中选择要分析的孔。将实验类型设置为直接定量，将测定设置为探针混合三重，然后输入目标名称。然后单击应用。使用图形工具将特定颜色分配给不同的目标聚类，按照选择分配聚类窗口弹出窗口建议的指示。分配所有目标颜色后，定量数据将显示在孔数据窗口中。将数据导出为 CSV 文件以进行下游分析。对于四链体测定，将实验类型设置为直接定量，将测定设置为幅度多重。输入目标名称，然后单击应用。使用图形工具将特定颜色分配给不同的目标聚类，按照选择分配聚类窗口弹出窗口建议的指示。分配所有目标颜色后，定量数据将显示在孔数据窗口中。将数据导出为 CSV 文件以进行其他分析。正如在这种代表性的温度梯度分析中观察到的那样，当进行双链测定时，较高的跪姿温度无法清楚地区分阳性液滴和阴性液滴。然而，随着跪姿温度的降低，正负液滴之间的最佳分离实现了。使用双色RT液滴数字PCR检测系统，可以在单个样本中检测一个，两个，三个和四个SARS-CoV-2靶标。无模板对照样品可用于定位阴性液滴，以帮助设置单纯形测定中的阴性阈值。在双链分析中，可以在单个通道或 2D 振幅下进行分析。虽然高阶多重检测数据分析并不简单，但这些检测是有用的，因为它们允许在三重探针混合物测定中评估多达 8 个液滴簇，在基于四链体振幅的测定中评估多达 16 个液滴簇。根据要开发的检测方法，确保将正确的靶标引物和探针浓度添加到预混液中。使用该程序，可以交替靶标以开发新的RT-ddPCR测定。该测定可用于不同的研究目的或诊断新出现的传染病。自开发以来，该技术已用于准确测定不同标准品、人体和环境样品中的病毒核酸拷贝。

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

多重PCR和反向线杂交检测（MPCR / RLB）

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

科研

生物学

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

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The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

人肝细胞通过一个两步胶原酶灌注过程隔离

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

采用数字液滴PCR技术检测BRAF V600E突变的福尔马林固定石蜡包埋的参考标准细胞系

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

定量实时反转录 PCR 技术对猕猴猴血浆 MicroRNA 水平的绝对量化

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

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使用两步PCR和下一代16S rRNA基因测序进行微生物群分析

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