Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Denne forskning blev finansieret af Megaproject of Infectious Disease Control fra Kinas sundhedsministerium, bevillingsnummer 2017ZX10302301-005 og Sino-Africa Joint Research Center, bevillingsnummer SAJC201605.

Etisk erklæring Wuhan Institute of Virology (WHIOV) er blandt de laboratorier og institutter, der er godkendt af China CDC i Wuhan by til at forske i SARS-CoV-2 og opdage COVID-19 fra kliniske prøver. Forskning i udvikling af nye diagnostiske teknikker til COVID-19 ved hjælp af kliniske prøver er også blevet godkendt af det etiske udvalg for Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).
1. Arbejdsproces for prøvebehandling (figur 1A)
<p cla...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Der er få ressourcer til rådighed om, hvordan man udvikler RT-ddPCR-assays til SARS-CoV-2-detektion. Selvom de ikke bruges i denne artikel, kan standardprøver med kendte kopier bruges til at udvikle og optimere assays. I dette arbejde blev SARS-CoV-2-prøver dyrket i Vero-E6-celler imidlertid spiket i en baggrund af humant genomisk RNA og brugt som standardprøver til at udvikle analyserne. Korrekte primer- og sondesekvenser er afgørende, når der udvikles assays. Da det meste indledende arbejde med SARS-CoV-2 RT-ddP...

Polymerasekædereaktion (PCR), en velkendt teknik, har gennemgået flere transformationer siden dens fremkomst for at blive en kraftfuld teknik, der er i stand til at give svar på nukleinsyreforskning. Disse transformationer har været en konstant forbedring af den gamle teknik. Disse transformationer kan opsummeres i tre generationer1. Den første generation er konventionel PCR, der er afhængig af gelelektroforese til at kvantificere og detektere forstærkede mål. Anden generation er kvantitativ realtids PCR (qPCR), der kan detektere prøver i realtid og stole på en standardkurve til direkte kvantificering af mål i en prøve. Den tredje generation, digital PCR (dPCR), kan udføre både detektion og absolut kvantificering af nukleinsyremål uden behov for en standardkurve. dPCR er også blevet forbedret yderligere fra reaktionskamre, der adskilles af brøndene i en væg til emulsioner af olie, vand og stabiliserende kemikalier inden for samme brønd som set i dråbebaseret digital PCR2. I dråbe digital PCR (ddPCR) opdeles en prøve i tusindvis af nanoliter-store dråber, der indeholder individuelle mål, som senere vil blive kvantificeret ved hjælp af Poisson-statistik 2,3,4. Denne teknik giver ddPCR en fordel ved kvantificering af mål med lav overflod sammenlignet med de andre generationer af PCR.
For nylig har flere applikationer fremhævet overlegenheden af ddPCR i forhold til den almindeligt anvendte qPCR ved påvisning og kvantificering af målmed lavt rigelige mål 1,5,6. SARS-CoV-2 er ingen undtagelse fra disse applikationer 7,8,9,10,11,12. Siden udbruddet af SARS-CoV-2 har forskere arbejdet på alle fronter for at komme med løsninger på, hvordan man diagnosticerer virussen og opdager den effektivt. Den nuværende guldstandard mangler stadig at være qPCR13. RT-ddPCR har imidlertid vist sig at være mere nøjagtig til at detektere lave rigelige SARS-CoV-2-mål fra både miljømæssige og kliniske prøver sammenlignet med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De fleste af de SARS-CoV-2 ddPCR-offentliggjorte værker afhænger af simpleksassays med multiplexerne afhængigt af kommercielle assays. Derfor bør der gøres mere for at forklare, hvordan man udvikler multiplex RT-dPCR-assays til SARS-CoV-2-detektion.
I et korrekt analysedesign kan multiplexing bruges til at spare på omkostningerne, øge prøvegennemstrømningen og maksimere antallet af mål, der følsomt kan detekteres inden for en lille prøve. Ved multiplexing med ddPCR skal man tage højde for, hvor mange fluoroforer der kan detekteres i et bestemt system. Nogle ddPCR-platforme kan understøtte op til tre kanaler, mens andre kun understøtter to kanaler. Derfor, når multiplexing med to kanaler, skal man bruge forskellige tilgange, herunder multiplexing af højere orden for at detektere mere end to mål14,15,16. I dette arbejde bruges et tofarvet ddPCR-detektionssystem til at vise trin til, hvordan man udvikler forskellige SARS-CoV-2 RT-ddPCR-assays, der kan tilpasses til forskellige forskningsapplikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

Diagnose af den igangværende SARS-CoV-2-pandemi er en prioritet for alle lande over hele kloden. I øjeblikket er omvendt transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) guldstandarden for SARS-CoV-2-diagnose, da der ikke findes nogen permanent løsning. Uanset hvor effektiv denne teknik kan være, er der opstået forskning, der viser dens begrænsninger i detektion og diagnose, især når det kommer til lave rigelige mål. I modsætning hertil har dråbedigital PCR (ddPCR), en nylig ny teknologi med overlegne fordele i forhold til qPCR, vist sig at overvinde udfordringerne ved RT-qPCR ved diagnosticering af SARS-CoV-2 fra lave rigelige målprøver. Fremadrettet udvides mulighederne i RT-ddPCR i denne artikel yderligere ved at vise trin til, hvordan man udvikler simplex-, duplex-, triplex-sondemix og quadruplex-assays ved hjælp af et tofarvet detektionssystem. Ved hjælp af primere og sonder rettet mod specifikke steder i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 og RBD2) er udviklingen af disse assays vist at være mulig. Derudover leveres trin for trin detaljerede protokoller, noter og forslag til, hvordan du forbedrer analysearbejdsgangen og analyserer data. Tilpasning af denne arbejdsgang i fremtidige arbejder vil sikre, at det maksimale antal mål kan detekteres følsomt i en lille stikprøve, hvilket forbedrer omkostningerne og prøvegennemløbet betydeligt.

I en proof-of-concept-undersøgelse blev multiplexassays analytiske ydeevne testet på kliniske prøver og forskningsprøver19. Udførelsen af multiplexanalyserne var bedre end en RT-PCR19. Da et lavt antal dråber kan indikere et problem under dråbegenerering, blev der i denne artikel fastsat en afskæring på 10.000 dråber pr. Brønd baseret på empiriske data.
En god adskillelse mellem positive og negative dråber med minimal regninterferens...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Dette arbejde opsummerer trin til udvikling af forskellige assays til SARS-CoV-2-detektion ved hjælp af et tofarvet ddPCR-system. Trinene er detaljerede, og der er inkluderet noter om, hvordan man forbedrer assays og eksperimentets ydeevne. Disse assays kan bruges til flere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikationer.

To-trins omvendt transkriptionsdråbe digitale PCR-protokoller til SARS-CoV-2-detektion og kvantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Disse protokoller kan bruges til at udvikle interne multiplex ddPCR-assays til påvisning af SARS-CoV-2 ved hjælp af et tofarvet ddPCR-system. Dette er nyttigt for folk, der ønsker at udvikle deres egne kits til påvisning af SARS-CoV-2 og andre patogener. Sammenlignet med guldstandarden RT-qPCR kan RT-ddPCR bruges til at kvantificere flere SARS-CoV-2-gener uden behov for en standardkurve.Da ddPCR er en ny teknik, er visuel demonstration vigtig for at hjælpe nuværende og fremtidige brugere med at forstå og let udvikle multiplexanalyser til SARS-CoV-2-detektion og andre patogener. Til cDNA-syntese tilsættes to mikroliter 5X revers transkriptionsmasterblanding, fem mikroliter RNA-prøve af interesse og tre mikroliter RNasefrit dobbeltdestilleret vand i et 100 eller 200 mikroliter PCR-rør til et slutvolumen på 10 mikroliter som opløsning, og læg røret på is. Når reagenserne er tilsat, lægges prøven i en termisk cyklist og indstilles instrumentet til at køre en omvendt transkription ved 37 grader Celsius i 15 minutter, en varmeinaktivering af den omvendte transkription i 5 sekunder ved 85 grader Celsius og et sidste uendeligt hold ved fire grader Celsius.Før du udfører dråbe digital PCR, tilsættes 19,8 mikroliter frisklavet masterblanding til det passende antal brønde i en nukleasefri 96-brønds dråbe digital PCR-plade. Tilsæt 2,2 mikroliter cDNA til hver brønd med masterblanding til et slutvolumen på 22 mikroliter reaktionsblanding pr. brønd og forsegl pladen med en engangs PCR-pladeforsegler. Derefter hvirvel pladen i 15 til 30 sekunder i centrifuge i 10 til 15 sekunder for at samle brøndindholdet i bunden af pladen.For automatisk dråbegenerering på berøringsskærmen for den automatiske dråbegenerator skal du klikke på Konfigurer prøveplade og vælge de kolonner, hvor prøverne er placeret på prøvepladen. Klik på okay, og åbn døren til den automatiske dråbegenerator. Læg prøve- og dråbegenereringspladerne og de andre materialer, der er nødvendige for eksperimentet, på de respektive steder i instrumentet, og luk døren.Når berøringsskærmen bliver grøn, hvilket indikerer, at alle materialerne er blevet indlæst i deres korrekte positioner, skal du vælge olie til sonder og starte dråbegenerering. Vent på, at dråbegenereringen kører til færdiggørelse i henhold til den tid, der er angivet på skærmen. Når skærmen siger Dråber klar, skal du åbne døren for at fjerne pladen, der indeholder dråberne, og bruge en pladeforsegler i fem sekunder ved 180 grader Celsius til at forsegle pladen med en gennemborbar folieforsegling.Inden for 30 minutter efter dråbegenereringen placeres den forseglede dråbeplade i en 96 dyb brøndtermisk cyklist. Indstil prøvevolumenet til 40 mikroliter og lågtemperaturen til 105 grader Celsius. Derefter forstærker PCR dråberne.Til dråbeaflæsning overføres den termiske cyklede 96-brøndplade efter forstærkningen til en dråbelæser og åbner den medfølgende software på en computer, der er tilsluttet dråbelæseren. Fra opsætningstilstand skal du vælge Ny og dobbeltklikke på en hvilken som helst brønd for at åbne dialogboksen Brøndeditor. Vælg de brønde, der skal læses, og indstil eksperimentet til absolut kvantificering, supermix til dråbe digital PCR-superblanding til sonder.Målret én type mod kanal 1 ukendt og målret to typer mod kanal 2 ukendt. Tildel eksempelnavnene baseret på pladelayoutet, og klik på anvend og okay. Når du har gemt skabelonen, skal du klikke på Kør.Når du bliver bedt om det af softwaren, skal du vælge FAM/HEX-farven. I slutningen af dataindsamlingen skal du fjerne pladen fra læseren. Før du analyserer dataene, skal du kontrollere dataene fra alle brøndene for at opnå det samlede antal dråber.Og indstil en cutoff for at acceptere et minimum antal dråber, der skal tælles som positive eller negative resultater. For simpleks- og duplex-analyseanalyse skal du dobbeltklikke på QLP-filen, der skal analyseres, og vælge Analyser. Brug værktøjerne 1D-amplitude og 2D-amplitudetærskel til at skelne mellem de positive og negative dråber for hver brønd i den korrekte kanal ved hjælp af nodeskabelonkontrolelementet og positive kontrolprøver som vejledning.Eksporter derefter resultaterne som en CSV-fil til yderligere analyse. For et triplex-sondeblandingsassay skal du åbne QLP-filen og vælge de brønde, der skal analyseres i fanen pladeeditor. Indstil eksperimenttypen til direkte kvantificering og assayet til sondeblanding triplex, og indtast målnavnet.Klik derefter på Anvend. Brug grafværktøjerne til at tildele bestemte farver til forskellige målklynger som anvist af pop op-forslagene til vinduet Vælg for at tildele klynge. Når alle målfarverne er tildelt, vises kvantificeringsdataene i brønddatavinduet.Eksportér dataene som en CSV-fil til downstreamanalyse. For et quadruplex-assay skal du indstille eksperimenttypen til direkte kvantificering og assayet til amplitudemultiplex. Indtast målnavnet, og klik på Anvend.Brug grafværktøjerne til at tildele bestemte farver til forskellige målklynger som anvist af pop op-forslagene til vinduet Vælg for at tildele klynge. Når alle målfarverne er tildelt, vises kvantificeringsdataene i brønddatavinduet. Eksportér dataene som en CSV-fil til yderligere analyse.Som observeret i denne repræsentative temperaturgradientanalyse kunne højere knælende temperaturer ikke klart skelne positive dråber fra negative dråber, når der blev kørt et duplex-assay. Med et fald i en knælende temperatur blev der imidlertid opnået en optimal adskillelse mellem positive og negative dråber. Ved hjælp af et tofarvet RT-dråbe digitalt PCR-detektionssystem er det muligt at detektere et, to, tre og fire SARS-CoV-2-mål inden for en enkelt prøve.En kontrolprøve uden skabelon kan bruges til at lokalisere negative dråber for at hjælpe med at indstille den negative tærskel i simpleksanalyser. I duplex-assays kan analysen udføres i individuelle kanaler eller i 2D-amplituden. Selvom dataanalyse af multiplexanalyser med højere orden ikke er ligetil, er disse analyser nyttige, fordi de gør det muligt at vurdere op til otte dråbeklynger i triplex probe mix assays og op til 16 dråbeklynger til quadruplex amplitudebaserede assays.Afhængigt af det assay, der skal udvikles, skal du sørge for, at de korrekte målprimer- og sondekoncentrationer tilsættes masterblandingen. Ved hjælp af denne procedure kan man skifte målene for at udvikle nye RT-ddPCR-assays. Disse analyser kan anvendes til forskellige forskningsformål eller til diagnosticering af nye infektionssygdomme.Siden udviklingen er denne teknik blevet anvendt til nøjagtig bestemmelse af virale nukleinsyrekopier i forskellige standarder, menneskekroppen og miljøprøver.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering af humane hepatocytter ved en to-trins collagenaseperfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Anvender digitale Droplet PCR til Detect BRAF V600E Mutationer i formalinfikserede paraffinindlejrede Reference Standard cellelinier

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolut kvantificering af mikroRNA plasmaniveauer i Cynomolgus aber, ved hjælp af kvantitative Real-time Reverse transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Mikrobiota-analyse ved hjælp af to-trins PCR og næste generations 16S rRNA-Gensekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

En to-trins strategi, der kombinerer epigenetisk modifikation og biomekaniske signaler til at generere pattedyrs pluripotente celler

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing bymiljøet - En rørledning til prøveudtagning og påvisning af SARS-CoV-2 fra miljøreservoirer

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Konfokal billeddannelse med høj gennemstrømning af kvantepunkt-konjugerede SARS-CoV-2 spike-trimmere til at spore binding og endocytose i HEK293T-celler

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Kvantificering af cirkulære RNA'er ved hjælp af digital dråbe-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...