Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Dit onderzoek werd gefinancierd door Megaproject of Infectious Disease Control van het Ministerie van Volksgezondheid van China, subsidienummer 2017ZX10302301-005 en Sino-Africa Joint Research Center, subsidienummer SAJC201605.

Ethische verklaring Wuhan Institute of Virology (WHIOV) is een van de laboratoria en instituten die zijn goedgekeurd door China CDC van de stad Wuhan om onderzoek te doen naar SARS-CoV-2 en COVID-19 te detecteren uit klinische monsters. Onderzoek naar de ontwikkeling van nieuwe diagnostische technieken voor COVID-19 met behulp van klinische monsters is ook goedgekeurd door de ethische commissie van het Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).
1. Workflow voor monsterverwerki...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Er zijn weinig bronnen beschikbaar over het ontwikkelen van RT-ddPCR-assays voor SARS-CoV-2-detectie. Hoewel niet gebruikt in dit artikel, kunnen standaardmonsters met bekende kopieën worden gebruikt om assays te ontwikkelen en te optimaliseren. In dit werk werden SARS-CoV-2-monsters gekweekt in Vero-E6-cellen echter geprikt in een achtergrond van menselijk genomisch RNA en gebruikt als standaardmonsters om de assays te ontwikkelen. Goede primer- en sondesequenties zijn essentieel bij het ontwikkelen van assays. Aangezi...

Polymerasekettingreactie (PCR), een algemeen erkende techniek, heeft sinds zijn komst verschillende transformaties ondergaan om een krachtige techniek te worden die antwoorden kan bieden op nucleïnezuuronderzoek. Deze transformaties zijn een constante verbetering van de oude techniek. Deze transformaties zijn samen te vatten in drie generaties1. De eerste generatie is conventionele PCR die afhankelijk is van gel-elektroforese om versterkte doelen te kwantificeren en te detecteren. De tweede generatie is kwantitatieve real-time PCR (qPCR) die monsters in realtime kan detecteren en vertrouwt op een standaardcurve om doelen in een monster direct te kwantificeren. De derde generatie, digitale PCR (dPCR), kan zowel detectie als absolute kwantificering van nucleïnezuurdoelen uitvoeren zonder dat een standaardcurve nodig is. dPCR is ook verder verbeterd van reactiekamers die worden gescheiden door de putten van een muur in emulsies van olie, water en stabiliserende chemicaliën in dezelfde put als te zien in op druppels gebaseerde digitale PCR2. In droplet digital PCR (ddPCR) wordt een monster verdeeld in duizenden druppels ter grootte van nanoliter met individuele doelen die later zullen worden gekwantificeerd met behulp van Poisson-statistieken 2,3,4. Deze techniek geeft ddPCR een voorsprong bij het kwantificeren van lage abundante doelen in vergelijking met de andere generaties PCR.
Onlangs hebben meerdere toepassingen de superioriteit van ddPCR ten opzichte van de veelgebruikte qPCR benadrukt bij het detecteren en kwantificeren van lage overvloedige doelen 1,5,6. SARS-CoV-2 is geen uitzondering op deze toepassingen 7,8,9,10,11,12. Sinds de uitbraak van SARS-CoV-2 werken wetenschappers op alle fronten aan oplossingen om het virus te diagnosticeren en efficiënt op te sporen. De huidige gouden standaard moet nog steeds qPCR13 zijn. Van RT-ddPCR is echter aangetoond dat het nauwkeuriger is in het detecteren van lage overvloedige SARS-CoV-2-doelen uit zowel omgevings- als klinische monsters in vergelijking met RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De meeste van de SARS-CoV-2 ddPCR gepubliceerde werken zijn afhankelijk van simplex assays met de multiplex assays afhankelijk van commerciële assays. Daarom moet er meer worden gedaan om uit te leggen hoe multiplex RT-dPCR-assays voor SARS-CoV-2-detectie kunnen worden ontwikkeld.
In een goed testontwerp kan multiplexing worden gebruikt om kosten te besparen, de monsterdoorvoer te verhogen en het aantal doelen te maximaliseren dat gevoelig kan worden gedetecteerd in een klein monster. Bij multiplexing met ddPCR moet men rekening houden met het aantal fluoroforen dat in een bepaald systeem kan worden gedetecteerd. Sommige ddPCR-platforms kunnen maximaal drie kanalen ondersteunen, terwijl andere slechts twee kanalen ondersteunen. Daarom moet men bij multiplexing met twee kanalen verschillende benaderingen gebruiken, waaronder multiplexing van hogere orde om meer dan twee doelente detecteren 14,15,16. In dit werk wordt een tweekleurig ddPCR-detectiesysteem gebruikt om stappen te laten zien voor het ontwikkelen van verschillende SARS-CoV-2 RT-ddPCR-assays die kunnen worden aangepast voor verschillende onderzoekstoepassingen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

Diagnose van de aanhoudende SARS-CoV-2-pandemie is een prioriteit voor alle landen over de hele wereld. Momenteel is reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) de gouden standaard voor SARS-CoV-2-diagnose omdat er geen permanente oplossing beschikbaar is. Hoe effectief deze techniek ook is, er is onderzoek naar voren gekomen dat de beperkingen ervan in detectie en diagnose aantoont, vooral als het gaat om lage overvloedige doelen. Daarentegen is aangetoond dat droplet digital PCR (ddPCR), een recente opkomende technologie met superieure voordelen ten opzichte van qPCR, de uitdagingen van RT-qPCR bij de diagnose van SARS-CoV-2 uit laagovervloedige doelmonsters overwint. In dit artikel worden de mogelijkheden van RT-ddPCR verder uitgebreid door stappen te laten zien voor het ontwikkelen van simplex-, duplex-, triplex-sondemix- en quadruplex-assays met behulp van een tweekleurendetectiesysteem. Met behulp van primers en probes gericht op specifieke locaties van het SARS-CoV-2-genoom (N, ORF1ab, RPP30 en RBD2), wordt aangetoond dat de ontwikkeling van deze testen mogelijk is. Daarnaast worden stap voor stap gedetailleerde protocollen, notities en suggesties gegeven over hoe de testworkflow te verbeteren en gegevens te analyseren. Door deze workflow in toekomstige werkzaamheden aan te passen, wordt ervoor gezorgd dat het maximale aantal doelen gevoelig kan worden gedetecteerd in een kleine steekproef, waardoor de kosten en de monsterdoorvoer aanzienlijk worden verbeterd.

In een proof-of-concept studie werden de analytische prestaties van de multiplex assays getest op klinische en onderzoeksmonsters19. De prestaties van de multiplex assays waren superieur aan die van een RT-PCR19. Omdat lage aantallen druppels kunnen wijzen op een probleem tijdens het genereren van druppels, is in dit artikel een cutoff van 10.000 druppels per put ingesteld op basis van empirische gegevens.
Een goede scheiding tussen positieve en ...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Dit werk vat stappen samen voor het ontwikkelen van verschillende testen voor SARS-CoV-2-detectie met behulp van een tweekleurig ddPCR-systeem. De stappen zijn uitgebreid en er zijn opmerkingen opgenomen over hoe de assays en experimentprestaties kunnen worden verbeterd. Deze testen kunnen worden gebruikt voor meerdere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-toepassingen.

Tweestaps omgekeerde transcriptiedruppel digitale PCR-protocollen voor SARS-CoV-2-detectie en kwantificering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Deze protocollen kunnen worden gebruikt om interne multiplex ddPCR-assays te ontwikkelen voor detectie van SARS-CoV-2 met behulp van een tweekleurig ddPCR-systeem. Dit is handig voor mensen die hun eigen kits willen ontwikkelen voor de detectie van SARS-CoV-2 en andere ziekteverwekkers. Vergeleken met de gouden standaard RT-qPCR kan RT-ddPCR worden gebruikt om meerdere SARS-CoV-2-genen te kwantificeren zonder dat er een standaardcurve nodig is.Aangezien ddPCR een opkomende techniek is, is visuele demonstratie belangrijk om huidige en toekomstige gebruikers te helpen multiplex-assays voor SARS-CoV-2-detectie en andere pathogenen te begrijpen en gemakkelijk te ontwikkelen. Voeg voor cDNA-synthese twee microliters 5X reverse transcriptie mastermix, vijf microliter van het RNA-monster van belang en drie microliter RNase-vrij dubbel gedestilleerd water toe aan een PCR-buis van 100 of 200 microliter tot een eindvolume van 10 microliter als oplossing en plaats de buis op ijs. Wanneer de reagentia zijn toegevoegd, laadt u het monster in een thermische cycler en stelt u het instrument in om gedurende 15 minuten een omgekeerde transcriptie uit te voeren bij 37 graden Celsius, een warmte-inactivatie van de omgekeerde transcriptie gedurende 5 seconden bij 85 graden Celsius en een laatste oneindige hold bij vier graden Celsius.Voordat u druppel digitale PCR uitvoert, voegt u 19,8 microliter vers bereide mastermix toe aan het juiste aantal putjes van een nucleasevrije 96-well druppel digitale PCR-plaat. Voeg 2,2 microliter cDNA toe aan elke put van het mastermengsel tot een eindvolume van 22 microliter reactiemengsel per put en sluit de plaat af met een wegwerp-PCR-plaatafdichting. Draai de plaat vervolgens gedurende 15 tot 30 seconden in centrifuge gedurende 10 tot 15 seconden om de putinhoud aan de onderkant van de plaat te verzamelen.Voor geautomatiseerde druppelgeneratie op het touchscreen van de geautomatiseerde druppelgenerator klikt u op monsterplaat configureren en selecteert u de kolommen waarin de monsters zich op de monsterplaat bevinden. Klik op OK en open de deur van de automatische druppelgenerator. Laad de monster- en druppelgeneratieplaten en de andere materialen die nodig zijn voor het experiment op de respectieve locaties in het instrument en sluit de deur.Wanneer het touchscreen groen wordt, wat aangeeft dat alle materialen in de juiste positie zijn geladen, selecteert u olie voor sondes en start u met het genereren van druppels. Wacht tot de druppelgeneratie is voltooid volgens de tijd die op het scherm wordt aangegeven. Wanneer het scherm Droplets ready zegt, opent u de deur om de plaat met de druppels te verwijderen en gebruikt u een plaatsealer gedurende vijf seconden bij 180 graden Celsius om de plaat af te sluiten met een doorboorbare folieafdichting.Binnen 30 minuten na het genereren van de druppel, plaatst u de verzegelde druppelplaat in een 96 diepe put thermische cycler. Stel het monstervolume in op 40 microliter en de temperatuur van het deksel op 105 graden Celsius. Vervolgens versterkt PCR de druppels.Voor druppellezing, na de versterking, brengt u de thermisch gefietste 96-well-plaat over in een druppellezer en opent u de bijbehorende software op een computer die is aangesloten op de druppellezer. Selecteer in de instellingsmodus Nieuw en dubbelklik op een put om het dialoogvenster van de broneditor te openen. Selecteer de te lezen putjes en stel het experiment in op absolute kwantificering, supermix op druppel digitale PCR supermix voor sondes.Target één type op kanaal 1 onbekend en target twee type op kanaal 2 onbekend. Wijs de voorbeeldnamen toe op basis van de plaatindeling en klik op Toepassen en OK. Nadat u de sjabloon hebt opgeslagen, klikt u op Uitvoeren.Wanneer de software daarom vraagt, selecteert u de FAM/HEX-kleur. Verwijder aan het einde van de gegevensverzameling de plaat uit de lezer. Voordat u de gegevens analyseert, controleert u de gegevens van alle putten om het totale aantal druppels te verkrijgen.En stel een cutoff in om een minimum aantal druppels te accepteren dat als positieve of negatieve resultaten moet worden geteld. Voor simplex- en duplex-assayanalyse dubbelklikt u op het QLP-bestand dat u wilt analyseren en selecteert u Analyseren. Gebruik de 1D-amplitude- en 2D-amplitudedrempelgereedschappen om onderscheid te maken tussen de positieve en negatieve druppels voor elke put in het juiste kanaal, met behulp van de knooppuntsjabloonbesturing en positieve controlemonsters als leidraad.Exporteer de resultaten vervolgens als een CSV-bestand voor aanvullende analyse. Voor een triplex probe mix assay opent u het QLP-bestand en selecteert u de putten die moeten worden geanalyseerd op het tabblad plaateditor. Stel het experimenttype in op directe kwantificering en de test op het testen van mix triplex en voer de doelnaam in.Klik vervolgens op Toepassen. Gebruik de grafiekgereedschappen om specifieke kleuren toe te wijzen aan verschillende doelclusters, zoals aangegeven door de pop-upsuggesties voor het selecteren om clustervenster toe te wijzen. Wanneer alle doelkleuren zijn toegewezen, worden de kwantificeringsgegevens weergegeven in het venster met putgegevens.Exporteer de gegevens als een CSV-bestand voor downstream-analyse. Stel voor een quadruplex-test het experimenttype in op directe kwantificering en de test op amplitudemultiplex. Voer de doelnaam in en klik op Toepassen.Gebruik de grafiekgereedschappen om specifieke kleuren toe te wijzen aan verschillende doelclusters, zoals aangegeven door de pop-upsuggesties voor het selecteren om clustervenster toe te wijzen. Wanneer alle doelkleuren zijn toegewezen, worden de kwantificeringsgegevens weergegeven in het venster met putgegevens. Exporteer de gegevens als een CSV-bestand voor aanvullende analyse.Zoals waargenomen in deze representatieve temperatuurgradiëntanalyse, konden hogere knielende temperaturen positieve druppels niet duidelijk onderscheiden van negatieve druppels wanneer een duplextest werd uitgevoerd. Met een afname van een knielende temperatuur werd echter een optimale scheiding tussen positieve en negatieve druppels bereikt. Met behulp van een tweekleurig RT-druppel digitaal PCR-detectiesysteem is het mogelijk om één, twee, drie en vier SARS-CoV-2-doelen binnen één monster te detecteren.Een no template control sample kan worden gebruikt om negatieve druppels te lokaliseren om de negatieve drempel in simplex assays te helpen instellen. In duplex assays kan de analyse worden uitgevoerd in individuele kanalen of in de 2D-amplitude. Hoewel data-analyse van multiplextests van hogere orde niet eenvoudig is, zijn deze assays nuttig, omdat ze het mogelijk maken om tot acht druppelclusters te beoordelen in triplex probe mix assays en tot 16 druppelclusters voor quadruplex amplitude-gebaseerde assays.Afhankelijk van de te ontwikkelen test, moet u ervoor zorgen dat de juiste doelprimer- en sondeconcentraties aan de mastermix worden toegevoegd. Met behulp van deze procedure kan men de doelen afwisselen om nieuwe RT-ddPCR-assays te ontwikkelen. Deze testen kunnen worden gebruikt voor verschillende onderzoeksdoeleinden of voor de diagnose van opkomende infectieziekten.Sinds de ontwikkeling is deze techniek gebruikt voor de nauwkeurige bepaling van virale nucleïnezuurkopieën in verschillende normen, het menselijk lichaam en omgevingsmonsters.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Multiplex PCR en Reverse Line Blot hybridisatie assay (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Geoptimaliseerde PCR-gebaseerde detectie van Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolatie van humane hepatocyten door een twee-stap Collagenase Perfusie Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Gebruikmakend Digital Droplet PCR om BRAF V600E Mutaties Detect in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde Reference Standard cellijnen

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolute kwantificering van Plasma MicroRNA niveaus bij Cynomolgus apen, met behulp van kwantitatieve Real-time omgekeerde transcriptie PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota-analyse met behulp van twee-stap PCR en de volgende generatie 16S rRNA Gensequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Een strategie in twee stappen die epigenetische modificatie en biomechanische signalen combineert om pluripotente cellen van zoogdieren te genereren

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing the Urban Environment - Een pijpleiding voor bemonstering en detectie van SARS-CoV-2 uit milieureservoirs

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Confocale beeldvorming met hoge doorvoer van Quantum Dot-geconjugeerde SARS-CoV-2 Spike Trimers om binding en endocytose in HEK293T-cellen te volgen

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Kwantificering van circulaire RNA's met behulp van digitale druppel-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...