Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Cette recherche a été financée par le mégaprojet de contrôle des maladies infectieuses du ministère de la Santé de Chine, numéro de subvention 2017ZX10302301-005 et le Centre conjoint de recherche sino-africain, numéro de subvention SAJC201605.

Déclaration éthique L’Institut de virologie de Wuhan (WHIOV) fait partie des laboratoires et instituts approuvés par le CDC chinois de la ville de Wuhan pour mener des recherches sur le SRAS-CoV-2 et détecter la COVID-19 à partir d’échantillons cliniques. La recherche sur le développement de nouvelles techniques de diagnostic de la COVID-19 à l’aide d’échantillons cliniques a également été approuvée par le comité d’éthique de l’Institut de virologie de Wuhan (2020FCA001).</p...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Peu de ressources sont disponibles sur la façon de développer des tests RT-ddPCR pour la détection du SRAS-CoV-2. Bien qu’ils ne soient pas utilisés dans cet article, des échantillons standard avec des copies connues peuvent être utilisés pour développer et optimiser les essais. Dans ce travail cependant, des échantillons de SARS-CoV-2 cultivés dans des cellules Vero-E6 ont été dopés dans un arrière-plan d’ARN génomique humain et utilisés comme échantillons standard pour développer les tests. Des s?...

La réaction en chaîne de la polymérase (PCR), une technique bien reconnue, a subi plusieurs transformations depuis son avènement pour devenir une technique puissante capable d’apporter des réponses à la recherche sur les acides nucléiques. Ces transformations ont été une amélioration constante de l’ancienne technique. Ces transformations peuvent se résumer en trois générations1. La première génération est la PCR conventionnelle qui repose sur l’électrophorèse sur gel pour quantifier et détecter les cibles amplifiées. La deuxième génération est la PCR quantitative en temps réel (qPCR) qui peut détecter des échantillons en temps réel et s’appuyer sur une courbe standard pour quantifier directement les cibles d’un échantillon. La troisième génération, la PCR numérique (dPCR), peut effectuer à la fois la détection et la quantification absolue de cibles d’acides nucléiques sans avoir besoin d’une courbe standard. La dPCR a également été améliorée par le fait que les chambres de réaction sont séparées par les puits d’un mur en émulsions d’huile, d’eau et de produits chimiques stabilisateurs dans le même puits, comme on le voit dans la PCR numérique2 à base de gouttelettes. Dans la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), un échantillon est divisé en milliers de gouttelettes de la taille d’un nanolitre contenant des cibles individuelles qui seront ensuite quantifiées à l’aide des statistiques de Poisson 2,3,4. Cette technique donne à la ddPCR un avantage dans la quantification des cibles peu abondantes par rapport aux autres générations de PCR.
Récemment, de multiples applications ont mis en évidence la supériorité de la ddPCR par rapport à la qPCR couramment utilisée lors de la détection et de la quantification de cibles faiblement abondantes 1,5,6. Le SARS-CoV-2 ne fait pas exception à ces applications 7,8,9,10,11,12. Depuis l’épidémie de SRAS-CoV-2, les scientifiques ont travaillé sur tous les fronts pour trouver des solutions sur la façon de diagnostiquer le virus et de le détecter efficacement. L’étalon-or actuel reste à être qPCR13. Cependant, la RT-ddPCR s’est avérée plus précise dans la détection de cibles SARS-CoV-2 peu abondantes à partir d’échantillons environnementaux et cliniques par rapport àla RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La plupart des travaux publiés sur la ddPCR du SARS-CoV-2 dépendent de tests simplex, les tests multiplex dépendant de tests commerciaux. Par conséquent, il faudrait faire davantage pour expliquer comment développer des tests RT-dPCR multiplex pour la détection du SRAS-CoV-2.
Dans une conception de test appropriée, le multiplexage peut être utilisé pour économiser sur les coûts, augmenter le débit de l’échantillon et maximiser le nombre de cibles pouvant être détectées de manière sensible dans un petit échantillon. Lors du multiplexage avec ddPCR, il faut tenir compte du nombre de fluorophores pouvant être détectés dans un système particulier. Certaines plates-formes ddPCR peuvent prendre en charge jusqu’à trois canaux tandis que d’autres ne prennent en charge que deux canaux. Par conséquent, lors du multiplexage avec deux canaux, il faut utiliser différentes approches, y compris le multiplexage d’ordre supérieur pour détecter plus de deux cibles14,15,16. Dans ce travail, un système de détection ddPCR bicolore est utilisé pour montrer les étapes à suivre pour développer différents tests SARS-CoV-2 RT-ddPCR qui peuvent être adaptés à différentes applications de recherche.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

Le diagnostic de la pandémie actuelle de SRAS-CoV-2 est une priorité pour tous les pays du monde. Actuellement, la PCR quantitative à transcription inverse (RT-qPCR) est l’étalon-or pour le diagnostic du SRAS-CoV-2 car aucune solution permanente n’est disponible. Quelle que soit l’efficacité de cette technique, des recherches ont émergé montrant ses limites dans la détection et le diagnostic, en particulier lorsqu’il s’agit de cibles peu abondantes. En revanche, il a été démontré que la PCR numérique par gouttelettes (ddPCR), une technologie émergente récente présentant des avantages supérieurs à la qPCR, permet de surmonter les défis de la RT-qPCR dans le diagnostic du SRAS-CoV-2 à partir d’échantillons cibles peu abondants. Prospectivement, dans cet article, les capacités de la RT-ddPCR sont encore étendues en montrant les étapes à suivre pour développer des tests simplex, duplex, triplex et quadruplex à l’aide d’un système de détection bicolore. En utilisant des amorces et des sondes ciblant des sites spécifiques du génome du SRAS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 et RBD2), le développement de ces tests s’avère possible. De plus, des protocoles détaillés, des notes et des suggestions étape par étape sur la façon d’améliorer le flux de travail des tests et d’analyser les données sont fournis. L’adaptation de ce flux de travail dans les travaux futurs garantira que le nombre maximal de cibles peut être détecté de manière sensible dans un petit échantillon, ce qui améliorera considérablement le coût et le débit de l’échantillon.

Dans une étude de validation de principe, la performance analytique des tests multiplex a été testée sur des échantillons cliniques et de recherche19. La performance des tests multiplex était supérieure à celle d’une RT-PCR19. Étant donné qu’un faible nombre de gouttelettes peut indiquer un problème lors de la génération de gouttelettes, dans cet article, un seuil de 10 000 gouttelettes par puits a été fixé sur la base de données empiriques.
<p clas...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Ce travail résume les étapes du développement de différents tests pour la détection du SARS-CoV-2 à l’aide d’un système ddPCR bicolore. Les étapes sont élaborées et des notes ont été incluses sur la façon d’améliorer les tests et les performances expérimentales. Ces tests peuvent être utilisés pour plusieurs applications SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Protocoles de PCR numérique en gouttelettes à transcription inverse en deux étapes pour la détection et la quantification du SRAS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Ces protocoles peuvent être utilisés pour développer en interne des tests de ddPCR multiplex pour la détection du SARS-CoV-2 à l’aide d’un système de ddPCR bicolore. Ceci est utile pour les personnes qui souhaitent développer leurs propres kits pour la détection du SARS-CoV-2 et d’autres agents pathogènes. Par rapport à la RT-qPCR de référence, la RT-ddPCR peut être utilisée pour quantifier plusieurs gènes du SRAS-CoV-2 sans avoir besoin d’une courbe standard.Étant donné que la ddPCR est une technique émergente, la démonstration visuelle est importante pour aider les utilisateurs actuels et futurs à comprendre et à développer facilement des tests multiplex pour la détection du SRAS-CoV-2 et d’autres agents pathogènes. Pour la synthèse de l’ADNc, ajoutez deux microlitres de mélange maître de transcription inverse 5X, cinq microlitres de l’échantillon d’ARN d’intérêt et trois microlitres d’eau distillée double sans RNase dans un tube PCR de 100 ou 200 microlitres à un volume final de 10 microlitres comme solution, et placez le tube sur de la glace. Lorsque les réactifs éteints ont été ajoutés, chargez l’échantillon dans un thermocycleur et réglez l’instrument pour exécuter une transcription inverse à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, une inactivation thermique de la transcription inverse pendant 5 secondes à 85 degrés Celsius et une maintien, à l’infini final, à quatre degrés Celsius.Avant d’effectuer la PCR numérique par gouttelettes, ajoutez 19,8 microlitres de mélange principal fraîchement préparé au nombre approprié de puits d’une plaque de PCR numérique à 96 puits sans nucléase de gouttelettes. Ajouter 2,2 microlitres d’ADNc à chaque puits de mélange maître à un volume final de 22 microlitres de mélange réactionnel par puits et sceller la plaque avec un scellant à plaques PCR jetable. Ensuite, vortex la plaque pendant 15 à 30 secondes dans la centrifugeuse pendant 10 à 15 secondes pour recueillir le contenu du puits au fond de la plaque.Pour la génération automatisée de gouttelettes sur l’écran tactile du générateur de gouttelettes automatisé, cliquez sur Configurer la plaque d’échantillonnage et sélectionnez les colonnes dans lesquelles les échantillons sont situés sur la plaque d’échantillonnage. Cliquez sur OK et ouvrez le couvercle du générateur de gouttelettes automatisé. Chargez les plaques de génération d’échantillons et de gouttelettes et les autres matériaux nécessaires à l’expérience aux endroits respectifs de l’instrument et fermez la porte.Lorsque l’écran tactile devient vert, indiquant que tous les matériaux ont été chargés dans leurs positions correctes, sélectionnez l’huile pour les sondes et commencez à générer des gouttelettes. Attendez que la génération de gouttelettes se termine selon l’heure indiquée à l’écran. Lorsque l’écran indique Gouttelettes prêtes, ouvrez la porte pour retirer la plaque contenant les gouttelettes et utilisez un scellant de plaque pendant cinq secondes à 180 degrés Celsius pour sceller la plaque avec un joint en aluminium perçable.Dans les 30 minutes suivant la génération de gouttelettes, placez la plaque de gouttelettes scellée dans un cycleur thermique à puits de 96 profondeurs. Réglez le volume de l’échantillon à 40 microlitres et la température du couvercle à 105 degrés Celsius. Ensuite, la PCR amplifie les gouttelettes.Pour la lecture des gouttelettes, après l’amplification, transférer la plaque de 96 puits à cycle thermique dans un lecteur de gouttelettes et ouvrir le logiciel d’accompagnement sur un ordinateur connecté au lecteur de gouttelettes. Dans le mode de configuration, sélectionnez Nouveau et double-cliquez sur n’importe quel puits pour ouvrir la boîte de dialogue de l’éditeur de puits. Sélectionnez les puits à lire et réglez l’expérience sur la quantification absolue, supermix sur la PCR numérique en gouttelettes supermix pour les sondes.Ciblez un type sur le canal 1 inconnu et ciblez deux types sur le canal 2 inconnu. Attribuez les noms d’échantillon en fonction de la disposition de la plaque et cliquez sur Appliquer et OK. Après avoir enregistré le modèle, cliquez sur Exécuter.Lorsque le logiciel vous y invite, sélectionnez la couleur FAM/HEX. À la fin de l’acquisition des données, retirez la plaque du lecteur. Avant d’analyser les données, vérifiez les données de tous les puits pour obtenir le nombre total de gouttelettes.Et définissez un seuil pour accepter un nombre minimum de gouttelettes à compter comme résultats positifs ou négatifs. Pour l’analyse des essais recto et duplex, double-cliquez sur le fichier QLP à analyser et sélectionnez Analyser. Utilisez les outils d’amplitude 1D et de seuil d’amplitude 2D pour distinguer les gouttelettes positives et négatives pour chaque puits dans le bon canal, en utilisant le contrôle de modèle de nœud et les échantillons de contrôle positif comme guide.Ensuite, exportez les résultats sous forme de fichier CSV pour une analyse supplémentaire. Pour un test de mélange de sonde triplex, ouvrez le fichier QLP et sélectionnez les puits à analyser dans l’onglet éditeur de plaques. Définissez le type d’expérience sur la quantification directe et le test sur sonde mélange triplex, puis entrez le nom de la cible.Cliquez ensuite sur Appliquer. Utilisez les outils graphiques pour attribuer des couleurs spécifiques à différents clusters cibles, comme indiqué par les suggestions contextuelles de la fenêtre Sélectionner pour affecter un cluster. Lorsque toutes les couleurs cibles ont été attribuées, les données de quantification seront affichées dans la fenêtre des données du puits.Exportez les données sous forme de fichier CSV pour une analyse en aval. Pour un test quadruplex, définissez le type d’expérience sur la quantification directe et le test sur le multiplex d’amplitude. Entrez le nom de la cible et cliquez sur Appliquer.Utilisez les outils graphiques pour attribuer des couleurs spécifiques à différents clusters cibles, comme indiqué par les suggestions contextuelles de la fenêtre Sélectionner pour affecter un cluster. Lorsque toutes les couleurs cibles ont été attribuées, les données de quantification seront affichées dans la fenêtre des données du puits. Exportez les données sous forme de fichier CSV pour une analyse supplémentaire.Comme on l’a observé dans cette analyse représentative du gradient de température, des températures d’agenouillement plus élevées n’ont pas permis de distinguer clairement les gouttelettes positives des gouttelettes négatives lorsqu’un essai duplex a été effectué. Cependant, avec une diminution de la température à genoux, une séparation optimale entre les gouttelettes positives et négatives a été obtenue. À l’aide d’un système de détection numérique par PCR de gouttelettes RT à deux couleurs, il est possible de détecter une, deux, trois et quatre cibles SARS-CoV-2 dans un seul échantillon.Un échantillon de contrôle sans gabarit peut être utilisé pour localiser les gouttelettes négatives afin d’aider à définir le seuil négatif dans les tests simplex. Dans les tests duplex, l’analyse peut être effectuée dans des canaux individuels ou dans l’amplitude 2D. Bien que l’analyse des données des essais multiplex d’ordre supérieur ne soit pas simple, ces essais sont utiles, car ils permettent d’évaluer jusqu’à huit grappes de gouttelettes dans les essais de mélange de sondes triplex et jusqu’à 16 grappes de gouttelettes pour les essais basés sur l’amplitude quadruplex.Selon le dosage à développer, assurez-vous que les concentrations correctes de l’amorce cible et de la sonde sont ajoutées au mélange principal. En utilisant cette procédure, on peut alterner les cibles pour développer de nouveaux tests RT-ddPCR. Ces tests peuvent être utilisés à différentes fins de recherche ou pour le diagnostic de maladies infectieuses émergentes.Depuis son développement, cette technique a été utilisée pour la détermination précise des copies d’acides nucléiques viraux dans différentes normes, le corps humain et les échantillons environnementaux.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

PCR multiplex et de test d&#39;hybridation inverse Ligne Blot (MPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Recherche

Biologie

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Optimisé basé sur la PCR Détection de Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Employant numérique Droplet PCR pour détecter des mutations BRAF V600E dans de paraffine standard de référence lignées cellulaires fixés au formol

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Quantification absolue des micro-ARN plasmatique chez les singes Macaques, à l’aide de la Transcription inverse en temps réel Quantitative PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Analyse du microbiote à l'aide de PCR en deux étapes et de la prochaine génération 16S rRNA Gene Sequencing

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Une stratégie en deux étapes qui combine la modification épigénétique et les indices biomécaniques pour générer des cellules pluripotentes de mammifères

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Écouvillonner l’environnement urbain - Un pipeline pour l’échantillonnage et la détection du SARS-CoV-2 dans les réservoirs environnementaux

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Imagerie confocale à haut débit des trimères de pointes SRAS-CoV-2 conjuguées aux points quantiques pour suivre la liaison et l’endocytose dans les cellules HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Quantification d’ARN circulaires par PCR numérique

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...