Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Diese Forschung wurde durch das Megaprojekt zur Kontrolle von Infektionskrankheiten des chinesischen Gesundheitsministeriums, Fördernummer 2017ZX10302301-005, und das Sino-Africa Joint Research Center, Fördernummer SAJC201605, finanziert.

Ethische Erklärung Das Wuhan Institute of Virology (WHIOV) gehört zu den Laboren und Instituten, die von der China CDC der Stadt Wuhan für die Erforschung von SARS-CoV-2 und den Nachweis von COVID-19 aus klinischen Proben zugelassen sind. Die Forschung zur Entwicklung neuer Diagnosetechniken für COVID-19 anhand klinischer Proben wurde auch von der Ethikkommission des Wuhan Institute of Virology genehmigt (2020FCA001).
1. Arbeitsablauf bei der Probenverarbeitung (<strong c...

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	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Es gibt nur wenige Ressourcen zur Entwicklung von RT-ddPCR-Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis. Obwohl in diesem Artikel nicht verwendet, können Standardproben mit bekannten Kopien zur Entwicklung und Optimierung von Assays verwendet werden. In dieser Arbeit wurden SARS-CoV-2-Proben, die in Vero-E6-Zellen gezüchtet wurden, jedoch in einen Hintergrund aus humaner genomischer RNA versetzt und als Standardproben für die Entwicklung der Assays verwendet. Die richtigen Primer- und Sondensequenzen sind bei der Entwicklung v...

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), eine anerkannte Technik, hat seit ihrem Aufkommen mehrere Transformationen durchlaufen, um zu einer leistungsstarken Technik zu werden, die Antworten auf die Nukleinsäureforschung liefern kann. Diese Transformationen waren eine ständige Verbesserung der alten Technik. Diese Transformationen lassen sich in drei Generationenzusammenfassen 1. Die erste Generation ist die konventionelle PCR, die auf der Gelelektrophorese beruht, um amplifizierte Ziele zu quantifizieren und nachzuweisen. Die zweite Generation ist die quantitative Real-Time-PCR (qPCR), die Proben in Echtzeit nachweisen kann und sich auf eine Standardkurve stützt, um Ziele in einer Probe direkt zu quantifizieren. Die dritte Generation, die digitale PCR (dPCR), kann sowohl den Nachweis als auch die absolute Quantifizierung von Nukleinsäurezielen durchführen, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist. Die dPCR wurde auch weiter verbessert, da Reaktionskammern durch die Vertiefungen einer Wand in Emulsionen aus Öl, Wasser und stabilisierenden Chemikalien innerhalb derselben Vertiefung getrennt werden, wie dies bei der tröpfchenbasierten digitalen PCR2 der Fall ist. Bei der digitalen Tröpfchen-PCR (ddPCR) wird eine Probe in Tausende von nanolitergroßen Tröpfchen aufgeteilt, die einzelne Targets enthalten, die später mit Hilfe der Poisson-Statistik 2,3,4 quantifiziert werden. Diese Technik verschafft der ddPCR im Vergleich zu den anderen PCR-Generationen einen Vorteil bei der Quantifizierung von Zielmolekülen mit geringer Abundanz.
In jüngster Zeit haben mehrere Anwendungen die Überlegenheit der ddPCR gegenüber der häufig verwendeten qPCR bei der Detektion und Quantifizierung von Zielen mit geringer Abundanz hervorgehoben 1,5,6. SARS-CoV-2 ist keine Ausnahme von diesen Anwendungen 7,8,9,10,11,12. Seit dem Ausbruch von SARS-CoV-2 arbeiten Wissenschaftlerinnen und Wissenschaftler an allen Fronten an Lösungen, wie das Virus diagnostiziert und effizient nachgewiesen werden kann. Der aktuelle Goldstandard ist nach wie vor die qPCR13. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die RT-ddPCR im Vergleich zur RT-qPCR 7,8,9,10,11,12 genauer ist, wenn es darum geht, SARS-CoV-2-Ziele mit geringer Häufigkeit sowohl aus Umwelt- als auch aus klinischen Proben nachzuweisen. Die meisten der veröffentlichten SARS-CoV-2-ddPCR-Arbeiten hängen von Simplex-Assays ab, wobei die Multiplex-Assays von kommerziellen Assays abhängen. Daher sollte mehr getan werden, um zu erklären, wie Multiplex-RT-dPCR-Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis entwickelt werden können.
In einem geeigneten Assay-Design kann Multiplexing verwendet werden, um Kosten zu sparen, den Probendurchsatz zu erhöhen und die Anzahl der Ziele zu maximieren, die innerhalb einer kleinen Probe empfindlich nachgewiesen werden können. Beim Multiplexing mit ddPCR muss berücksichtigt werden, wie viele Fluorophore in einem bestimmten System nachgewiesen werden können. Einige ddPCR-Plattformen können bis zu drei Kanäle unterstützen, während andere nur zwei Kanäle unterstützen. Daher muss man beim Multiplexing mit zwei Kanälen verschiedene Ansätze verwenden, einschließlich Multiplexing höherer Ordnung, um mehr als zwei Ziele zu erkennen14,15,16. In dieser Arbeit wird ein zweifarbiges ddPCR-Nachweissystem verwendet, um Schritte zur Entwicklung verschiedener SARS-CoV-2 RT-ddPCR-Assays zu zeigen, die für verschiedene Forschungsanwendungen angepasst werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

Die Diagnose der anhaltenden SARS-CoV-2-Pandemie hat für alle Länder auf der ganzen Welt Priorität. Derzeit ist die quantitative PCR mit reverser Transkription (RT-qPCR) der Goldstandard für die Diagnose von SARS-CoV-2, da keine dauerhafte Lösung verfügbar ist. So effektiv diese Technik auch sein mag, es gibt Forschungsergebnisse, die ihre Grenzen bei der Erkennung und Diagnose aufzeigen, insbesondere wenn es um Ziele mit geringer Häufigkeit geht. Im Gegensatz dazu hat sich gezeigt, dass die Tröpfchen-Digital-PCR (ddPCR), eine neu aufstrebende Technologie mit überlegenen Vorteilen gegenüber der qPCR, die Herausforderungen der RT-qPCR bei der Diagnose von SARS-CoV-2 aus Zielproben mit geringer Abundanz überwindet. In diesem Artikel werden die Möglichkeiten der RT-ddPCR weiter ausgebaut, indem Schritte zur Entwicklung von Simplex-, Duplex-, Triplex-Sondenmischungs- und Quadruplex-Assays unter Verwendung eines Zweifarben-Detektionssystems gezeigt werden. Mit Hilfe von Primern und Sonden, die auf bestimmte Stellen des SARS-CoV-2-Genoms (N, ORF1ab, RPP30 und RBD2) abzielen, wird gezeigt, dass die Entwicklung dieser Assays möglich ist. Darüber hinaus werden Schritt für Schritt detaillierte Protokolle, Notizen und Vorschläge zur Verbesserung des Assay-Workflows und zur Analyse der Daten bereitgestellt. Durch die Anpassung dieses Arbeitsablaufs in zukünftigen Arbeiten wird sichergestellt, dass die maximale Anzahl von Targets in einer kleinen Probe empfindlich detektiert werden kann, was die Kosten und den Probendurchsatz erheblich verbessert.

In einer Proof-of-Concept-Studie wurde die analytische Leistung der Multiplex-Assays an klinischen und Forschungsproben getestet19. Die Leistung der Multiplex-Assays war der einer RT-PCR19 überlegen. Da eine geringe Anzahl von Tröpfchen auf ein Problem bei der Tröpfchenerzeugung hindeuten kann, wurde in diesem Artikel auf der Grundlage empirischer Daten ein Grenzwert von 10.000 Tröpfchen pro Well festgelegt.
Eine gute Trennung zwischen positi...

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Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Diese Arbeit fasst Schritte zur Entwicklung verschiedener Assays für den SARS-CoV-2-Nachweis unter Verwendung eines zweifarbigen ddPCR-Systems zusammen. Die Schritte sind ausgeklügelt und es wurden Hinweise zur Verbesserung der Assays und der Versuchsleistung beigefügt. Diese Assays können für mehrere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-Anwendungen verwendet werden.

Zweistufige digitale Transkriptions-Tröpfchenprotokolle für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Diese Protokolle können verwendet werden, um hauseigene Multiplex-ddPCR-Assays für den Nachweis von SARS-CoV-2 mit einem zweifarbigen ddPCR-System zu entwickeln. Dies ist nützlich für Personen, die eigene Kits für den Nachweis von SARS-CoV-2 und anderen Krankheitserregern entwickeln möchten. Im Vergleich zum Goldstandard RT-qPCR kann die RT-ddPCR verwendet werden, um mehrere SARS-CoV-2-Gene zu quantifizieren, ohne dass eine Standardkurve erforderlich ist.Da es sich bei der ddPCR um eine aufstrebende Technik handelt, ist die visuelle Demonstration wichtig, um aktuellen und zukünftigen Anwendern zu helfen, Multiplex-Assays für den Nachweis von SARS-CoV-2 und anderen Krankheitserregern zu verstehen und einfach zu entwickeln. Für die cDNA-Synthese geben Sie zwei Mikroliter 5X Reverse Transkriptions-Mastermix, fünf Mikroliter der gewünschten RNA-Probe und drei Mikroliter RNase-freies, doppelt destilliertes Wasser in ein 100- oder 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen zu einem Endvolumen von 10 Mikrolitern als Lösung und legen Sie das Röhrchen auf Eis. Wenn die Reagenzien ausgeschaltet sind, laden Sie die Probe in einen Thermocycler und stellen Sie das Gerät so ein, dass es 15 Minuten lang eine reverse Transkription bei 37 Grad Celsius, eine Hitzeinaktivierung der reversen Transkription für 5 Sekunden bei 85 Grad Celsius und einen abschließenden unendlichen Halt bei vier Grad Celsius durchführt.Bevor Sie eine digitale Tröpfchen-PCR durchführen, geben Sie 19,8 Mikroliter frisch zubereitete Mastermischung in die entsprechende Anzahl von Vertiefungen einer nukleasefreien digitalen 96-Well-Tröpfchen-PCR-Platte. Geben Sie 2,2 Mikroliter cDNA in jede Vertiefung des Mastermixes, um ein Endvolumen von 22 Mikrolitern Reaktionsmischung pro Well zu erhalten, und versiegeln Sie die Platte mit einem Einweg-PCR-Plattenversiegeler. Wirbeln Sie die Platte dann 15 bis 30 Sekunden lang in der Zentrifuge für 10 bis 15 Sekunden, um den Wellinhalt am Boden der Platte zu sammeln.Klicken Sie für die automatische Tröpfchenerzeugung auf dem Touchscreen des automatischen Tröpfchengenerators auf Probenplatte konfigurieren und wählen Sie die Spalten aus, in denen sich die Proben auf der Probenplatte befinden. Klicken Sie auf OK und öffnen Sie die Tür des automatischen Tröpfchengenerators. Legen Sie die Proben- und Tröpfchenerzeugungsplatten und die anderen für das Experiment erforderlichen Materialien an die entsprechenden Stellen im Gerät und schließen Sie die Tür.Wenn der Touchscreen grün wird und damit anzeigt, dass alle Materialien in die richtige Position geladen wurden, wählen Sie das Öl für die Sonden aus und starten Sie die Tröpfchenerzeugung. Warten Sie, bis die Tröpfchenerzeugung gemäß der auf dem Bildschirm angezeigten Zeit abgeschlossen ist. Wenn auf dem Bildschirm "Tröpfchen bereit" angezeigt wird, öffnen Sie die Tür, um die Platte mit den Tröpfchen zu entfernen, und verwenden Sie fünf Sekunden lang bei 180 Grad Celsius eine Plattenversiegelung, um die Platte mit einer durchstechbaren Folienversiegelung zu versiegeln.Legen Sie die versiegelte Tröpfchenplatte innerhalb von 30 Minuten nach der Tröpfchenerzeugung in einen 96-Deep-Well-Thermocycler. Stellen Sie das Probenvolumen auf 40 Mikroliter und die Deckeltemperatur auf 105 Grad Celsius ein. Anschließend werden die Tröpfchen mittels PCR vervielfältigt.Übertragen Sie für die Tröpfchenlesung nach der Verstärkung die thermisch getaktete 96-Well-Platte in einen Tröpfchenleser und öffnen Sie die zugehörige Software auf einem Computer, der mit dem Tröpfchenlesegerät verbunden ist. Wählen Sie im Setup-Modus "Neu" und doppelklicken Sie auf ein beliebiges Well, um das Dialogfeld "Well-Editor" zu öffnen. Wählen Sie die zu lesenden Wells aus und stellen Sie das Experiment auf absolute Quantifizierung, Supermix auf Tröpfchen-Digital-PCR-Supermix für Sonden ein.Richten Sie einen Typ auf Kanal 1 unbekannt und zwei Typen auf Kanal 2 unbekannt aus. Weisen Sie die Probennamen basierend auf dem Plattenlayout zu, und klicken Sie auf Anwenden und OK. Klicken Sie nach dem Speichern der Vorlage auf Ausführen.Wenn Sie von der Software dazu aufgefordert werden, wählen Sie die FAM/HEX-Farbe aus. Entfernen Sie am Ende der Datenerfassung die Platte aus dem Lesegerät. Überprüfen Sie vor der Analyse der Daten die Daten aus allen Vertiefungen, um die Gesamtzahl der Tröpfchen zu ermitteln.Und legen Sie einen Grenzwert fest, um eine Mindestanzahl von Tröpfchen zu akzeptieren, die als positive oder negative Ergebnisse gezählt werden. Für die Simplex- und Duplex-Assay-Analyse doppelklicken Sie auf die zu analysierende QLP-Datei und wählen Sie Analysieren. Verwenden Sie die Werkzeuge 1D-Amplitude und 2D-Amplitudenschwellenwert, um zwischen den positiven und negativen Tröpfchen für jedes Well im richtigen Kanal zu unterscheiden, wobei Sie die Knotenvorlagensteuerung und die Positivkontrollproben als Leitfaden verwenden.Exportieren Sie dann die Ergebnisse als CSV-Datei zur weiteren Analyse. Öffnen Sie für einen Triplex-Sonden-Mix-Assay die QLP-Datei und wählen Sie die zu analysierenden Wells auf der Registerkarte des Platteneditors aus. Legen Sie den Experimenttyp auf direkte Quantifizierung und den zu untersuchenden Assay auf Triplex fest, und geben Sie den Zielnamen ein.Klicken Sie dann auf Übernehmen. Verwenden Sie die Diagrammwerkzeuge, um verschiedenen Ziel-Clustern bestimmte Farben zuzuweisen, wie in den Popup-Vorschlägen des Fensters "Cluster auswählen" angegeben. Wenn alle Zielfarben zugewiesen wurden, werden die Quantifizierungsdaten im Well-Datenfenster angezeigt.Exportieren Sie die Daten als CSV-Datei für die nachgelagerte Analyse. Stellen Sie für einen Quadruplex-Assay den Experimenttyp auf direkte Quantifizierung und den Assay auf Amplitudenmultiplex ein. Geben Sie den Zielnamen ein und klicken Sie auf Übernehmen.Verwenden Sie die Diagrammwerkzeuge, um verschiedenen Ziel-Clustern bestimmte Farben zuzuweisen, wie in den Popup-Vorschlägen des Fensters "Cluster auswählen" angegeben. Wenn alle Zielfarben zugewiesen wurden, werden die Quantifizierungsdaten im Well-Datenfenster angezeigt. Exportieren Sie die Daten als CSV-Datei für weitere Analysen.Wie in dieser repräsentativen Temperaturgradientenanalyse beobachtet wurde, konnten höhere kniende Temperaturen positive Tröpfchen nicht eindeutig von negativen Tröpfchen unterscheiden, wenn ein Duplex-Assay durchgeführt wurde. Mit einer Absenkung der Knietemperatur wurde jedoch eine optimale Trennung zwischen positiven und negativen Tröpfchen erreicht. Mit einem zweifarbigen digitalen RT-Tröpfchen-PCR-Detektionssystem ist es möglich, ein, zwei, drei und vier SARS-CoV-2-Ziele in einer einzigen Probe nachzuweisen.Eine Kontrollprobe ohne Vorlage kann verwendet werden, um negative Tröpfchen zu lokalisieren, um den negativen Schwellenwert in Simplex-Assays festzulegen. Bei Duplex-Assays kann die Analyse in einzelnen Kanälen oder in der 2D-Amplitude durchgeführt werden. Obwohl die Datenanalyse von Multiplex-Assays höherer Ordnung nicht einfach ist, sind diese Assays nützlich, da sie die Bewertung von bis zu acht Tröpfchen-Clustern in Triplex-Sonden-Mix-Assays und bis zu 16 Tröpfchen-Clustern für Quadruplex-Amplituden-basierte Assays ermöglichen.Stellen Sie je nach zu entwickelndem Assay sicher, dass dem Mastermix die richtigen Primer- und Sondenkonzentrationen des Ziels zugesetzt werden. Mit diesem Verfahren können die Targets abwechselnd verwendet werden, um neuartige RT-ddPCR-Assays zu entwickeln. Diese Assays können für verschiedene Forschungszwecke oder für die Diagnose neu auftretender Infektionskrankheiten verwendet werden.Seit ihrer Entwicklung wird diese Technik zur genauen Bestimmung von viralen Nukleinsäurekopien in verschiedenen Standards, im menschlichen Körper und in Umweltproben eingesetzt.

Research

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