Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

מחקר זה מומן על ידי Megaproject of Infectious Disease Control ממשרד הבריאות של סין, מענק מספר 2017ZX10302301-005 ומרכז המחקר המשותף סין-אפריקה, מענק מספר SAJC201605.

הצהרה אתית מכון ווהאן לווירולוגיה (WHIOV) הוא בין המעבדות והמכונים שאושרו על ידי ה- CDC הסיני של העיר ווהאן לערוך מחקר על SARS-CoV-2 ולזהות COVID-19 מדגימות קליניות. מחקר על פיתוח טכניקות אבחון חדשות עבור COVID-19 באמצעות דגימות קליניות אושר גם על ידי הוועדה האתית של מכון ווהאן לווירולוגיה (2020FCA00...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

מעט משאבים זמינים כיצד לפתח מבחני RT-ddPCR לזיהוי SARS-CoV-2. למרות שלא נעשה שימוש במאמר זה, ניתן להשתמש בדוגמאות סטנדרטיות עם עותקים ידועים כדי לפתח ולמטב מבחנים. עם זאת, בעבודה זו, דגימות SARS-CoV-2 שגדלו בתאי Vero-E6 הוקפצו על רקע של RNA גנומי אנושי ושימשו כדגימות סטנדרטיות לפיתוח הבדיקות. רצפי פריימר ובד?...

תגובת שרשרת פולימראז (PCR), טכניקה מוכרת היטב, עברה מספר טרנספורמציות מאז הופעתה והפכה לטכניקה רבת עוצמה המסוגלת לספק תשובות למחקר חומצות גרעין. טרנספורמציות אלה היו שיפור מתמיד של הטכניקה הישנה. ניתן לסכם תמורות אלה לשלושה דורות1. הדור הראשון הוא PCR קונבנציונלי המסתמך על אלקטרופורזה בג'ל כדי לכמת ולזהות מטרות מוגברות. הדור השני הוא PCR כמותי בזמן אמת (qPCR) שיכול לזהות דגימות בזמן אמת ולהסתמך על עקומה סטנדרטית כדי לכמת ישירות מטרות בדגימה. הדור השלישי, PCR דיגיטלי (dPCR), יכול לבצע הן זיהוי, והן כימות מוחלט של מטרות חומצות גרעין ללא צורך בעקומה סטנדרטית. dPCR שופר גם עוד יותר מתאי תגובה המופרדים על ידי בארות של קיר לאמולסיות של נפט, מים וכימיקלים מייצבים בתוך אותה באר כפי שניתן לראות ב- PCR דיגיטלימבוסס טיפות 2. ב-Droplet Digital PCR (ddPCR), הדגימה מחולקת לאלפי טיפות בגודל ננוליטר המכילות מטרות בודדות שמאוחר יותר יכומתו באמצעות סטטיסטיקת פואסון 2,3,4. טכניקה זו מעניקה ל- ddPCR יתרון בכימות מטרות נמוכות בשפע בהשוואה לדורות האחרים של PCR.
לאחרונה, יישומים מרובים הדגישו את העליונות של ddPCR על פני qPCR הנפוץ בעת זיהוי וכימות מטרות נמוכות בשפע 1,5,6. SARS-CoV-2 אינו יוצא מן הכלל ליישומים אלה 7,8,9,10,11,12. מאז התפרצות SARS-CoV-2, מדענים עובדים בכל החזיתות כדי למצוא פתרונות כיצד לאבחן את הנגיף ולזהות אותו ביעילות. תקן הזהב הנוכחי עדיין נשאר להיות qPCR13. עם זאת, RT-ddPCR הוכח כמדויק יותר בזיהוי מטרות SARS-CoV-2 בשפע נמוך מדגימות סביבתיות וקליניות בהשוואה ל- RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. רוב העבודות שפורסמו על ידי SARS-CoV-2 ddPCR תלויות במבדקים חד-צדדיים עם המולטיפלקסים בהתאם למבדקים מסחריים. לפיכך, יש לעשות יותר כדי להסביר כיצד לפתח בדיקות RT-dPCR מרובות לזיהוי SARS-CoV-2.
בתכנון בדיקה נכון, ניתן להשתמש בריבוב כדי לחסוך בעלויות, להגדיל את תפוקת הדגימה ולמקסם את מספר המטרות שניתן לזהות ברגישות בתוך מדגם קטן. כאשר ריבוב עם ddPCR, יש לקחת בחשבון כמה fluorophores ניתן לזהות במערכת מסוימת. פלטפורמות ddPCR מסוימות יכולות לתמוך בעד שלושה ערוצים בעוד שאחרות תומכות בשני ערוצים בלבד. לפיכך, בעת ריבוב עם שני ערוצים, יש להשתמש בגישות שונות, כולל ריבוב מסדר גבוה יותר כדי לזהות יותר משתי מטרות14,15,16. בעבודה זו, מערכת זיהוי ddPCR בשני צבעים משמשת כדי להראות שלבים כיצד לפתח מבחני SARS-CoV-2 RT-ddPCR שונים שניתן להתאים ליישומי מחקר שונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

אבחון מגיפת SARS-CoV-2 המתמשכת נמצא בראש סדר העדיפויות של כל המדינות ברחבי העולם. נכון לעכשיו, PCR כמותי של שעתוק לאחור (RT-qPCR) הוא תקן הזהב לאבחון SARS-CoV-2 מכיוון שאין פתרון קבוע זמין. יעילה ככל שתהיה טכניקה זו, התגלו מחקרים המראים את מגבלותיה בזיהוי ואבחון, במיוחד כשמדובר במטרות נמוכות בשפע. לעומת זאת, PCR דיגיטלי טיפתי (ddPCR), טכנולוגיה מתפתחת לאחרונה עם יתרונות עדיפים על qPCR, הוכחה להתגבר על האתגרים של RT-qPCR באבחון של SARS-CoV-2 מדגימות מטרה בשפע נמוך. באופן פרוספקטיבי, במאמר זה, היכולות של RT-ddPCR מורחבות עוד יותר על ידי הצגת שלבים כיצד לפתח סימפלקס, דופלקס, תערובת בדיקה טריפלקס ומבחני quadruplex באמצעות מערכת זיהוי שני צבעים. באמצעות פריימרים וגשושיות הממוקדים באתרים ספציפיים של גנום SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 ו-RBD2), הפיתוח של בדיקות אלה הוכח כאפשרי. בנוסף, מפורטים צעד אחר צעד פרוטוקולים, הערות והצעות כיצד לשפר את זרימת העבודה של הבדיקות ולנתח נתונים. התאמת זרימת עבודה זו בעבודות עתידיות תבטיח שניתן יהיה לזהות ברגישות את המספר המרבי של יעדים במדגם קטן, שיפור משמעותי בעלות ובתפוקת הדגימה.

במחקר הוכחת היתכנות, הביצועים האנליטיים של מבחני המולטיפלקס נבדקו על דגימות קליניות ומחקריות19. הביצועים של מבחני המרבב היו עדיפים על אלה של RT-PCR19. מכיוון שמספר נמוך של טיפות עשוי להצביע על בעיה במהלך יצירת טיפות, במאמר זה נקבע סף של 10,000 טיפות לבאר בהתבסס על נתונים ...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

עבודה זו מסכמת שלבים לפיתוח בדיקות שונות לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. השלבים מפורטים ונכללו הערות כיצד לשפר את הבדיקות ואת ביצועי הניסוי. ניתן להשתמש בבדיקות אלה עבור יישומי SARS-CoV-2 RT-ddPCR מרובים.

פרוטוקולי PCR דיגיטליים טיפתיים דו-שלביים של תמלול לאחור לזיהוי וכימות SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לפיתוח מבחני ddPCR מולטיפלקס פנימיים לזיהוי SARS-CoV-2 באמצעות מערכת ddPCR בשני צבעים. זה שימושי עבור אנשים שרוצים לפתח ערכות משלהם לזיהוי של SARS-CoV-2 ופתוגנים אחרים. בהשוואה לתקן הזהב RT-qPCR, RT-ddPCR יכול לשמש לכימות גנים מרובים של SARS-CoV-2 ללא צורך בעקומה סטנדרטית.מכיוון ש- ddPCR היא טכניקה מתפתחת, הדגמה חזותית חשובה כדי לעזור למשתמשים הנוכחיים והעתידיים להבין ולפתח בקלות בדיקות מולטיפלקס לזיהוי SARS-CoV-2 ופתוגנים אחרים. עבור סינתזת cDNA, הוסף שני מיקרוליטרים של תערובת מאסטר שעתוק לאחור 5X, חמישה מיקרוליטרים של דגימת RNA מעניינת, ושלושה מיקרוליטרים של מים מזוקקים כפולים ללא RNase לתוך צינור PCR של 100 או 200 מיקרוליטר לנפח סופי של 10 מיקרוליטר כתמיסה, והנח את הצינור על קרח. לאחר הוספת הריאגנטים, טען את הדגימה לתוך מחזור תרמי והגדר את המכשיר להריץ שעתוק לאחור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות, השבתת חום של התעתיק ההפוך למשך 5 שניות ב 85 מעלות צלזיוס, והחזקה אינסופית סופית בארבע מעלות צלזיוס.לפני ביצוע PCR דיגיטלי טיפתי, להוסיף 19.8 מיקרוליטר של תערובת אב מוכן טרי למספר המתאים של בארות של צלחת PCR דיגיטלית טיפתית 96 באר ללא נוקלאז. הוסף 2.2 מיקרוליטר של cDNA לכל באר של תערובת מאסטר לנפח סופי של 22 מיקרוליטר של תערובת תגובה לכל באר ואטם את הצלחת עם אוטם צלחת PCR חד פעמי. לאחר מכן, סובבו את הצלחת במשך 15 עד 30 שניות בצנטריפוגה למשך 10 עד 15 שניות כדי לאסוף את תכולת הבאר בתחתית הצלחת.ליצירת טיפות אוטומטית במסך המגע האוטומטי של מחולל הטיפות, לחץ על הגדר צלחת דגימה ובחר את העמודות שבהן הדגימות ממוקמות על לוח הדגימה. לחץ על אישור ופתח את דלת מחולל הטיפות האוטומטי. טען את לוחות הדגימה ויצירת הטיפות ואת החומרים האחרים הדרושים לניסוי למיקומים המתאימים בתוך המכשיר וסגור את הדלת.כאשר מסך המגע הופך לירוק, המציין שכל החומרים הועמסו למיקומם הנכון, בחרו שמן לגשושיות והתחילו בייצור טיפות. המתן עד שייצור הטיפות יפעל לסיום בהתאם לזמן המצוין על המסך. כאשר המסך אומר טיפות מוכנות, פתח את הדלת כדי להסיר את הצלחת המכילה את הטיפות והשתמש באטם צלחת במשך חמש שניות ב 180 מעלות צלזיוס כדי לאטום את הצלחת עם אטם נייר כסף נוקב.תוך 30 דקות מרגע יצירת הטיפות, הניחו את צלחת הטיפות האטומה לתוך מחזור תרמי של באר עמוקה 96. הגדר את נפח הדגימה ל -40 מיקרוליטר ואת טמפרטורת המכסה ל -105 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, PCR להגביר את הטיפות.לקריאת טיפות, לאחר ההגברה, העבירו את הצלחת התרמית בעלת מחזור 96 בארות לקורא טיפות ופתחו את התוכנה הנלווית במחשב המחובר לקורא הטיפות. ממצב ההתקנה, בחר חדש ולחץ פעמיים על כל באר כדי לפתוח את תיבת הדו-שיח של עורך הבאר. בחר את הבארות לקריאה והגדר ניסוי לכימות מוחלט, supermix כדי droplet דיגיטלי PCR supermix עבור בדיקות.יש לכוון סוג אחד לערוץ 1 לא ידוע ולכוון סוג שני לערוץ 2 לא ידוע. הקצו את השמות לדוגמה בהתבסס על פריסת הלוח ולחצו על 'החל' ו'אישור'. לאחר שמירת התבנית, לחץ על הפעל.כאשר תתבקש על-ידי התוכנה, בחר בצבע FAM/HEX. בסוף רכישת הנתונים, הסר את הלוח מהקורא. לפני ניתוח הנתונים, בדוק את הנתונים מכל הבארות כדי לקבל את המספר הכולל של טיפות.והגדר סף לקבלת מספר מינימלי של טיפות שייספרו כתוצאות חיוביות או שליליות. לניתוח בדיקה חד-צדדית ודופה, לחץ פעמיים על קובץ QLP לניתוח ובחר נתח. השתמש בכלי הסף של משרעת 1D ומשרעת דו-ממדית כדי להבחין בין הטיפות החיוביות והשליליות עבור כל באר בערוץ הנכון, תוך שימוש בפקד תבנית הצומת ובדגימות הבקרה החיוביות כמדריך.לאחר מכן, יצא את התוצאות כקובץ CSV לניתוח נוסף. לבדיקת תערובת גשושיות טריפלקס, פתח את קובץ QLP ובחר את הבארות לניתוח בכרטיסייה עורך הלוחות. הגדר את סוג הניסוי לכימות ישיר ואת המבחן לבדיקת מיקס טריפלקס, והזן את שם היעד.לאחר מכן לחץ על החל. השתמשו בכלי התרשימים להקצאת צבעים מסוימים לאשכולות יעד שונים, בהתאם להוראות הבחירה להקצאת הצעות נפתחות לחלון אשכולות. לאחר הקצאת כל צבעי היעד, נתוני הכימות יוצגו בחלון נתוני הבאר.יצא את הנתונים כקובץ CSV לניתוח במורד הזרם. עבור מבחן מרובע, הגדר את סוג הניסוי לכימות ישיר ואת המבחן למולטיפלקס משרעת. הזן את שם היעד ולחץ על החל.השתמשו בכלי התרשימים להקצאת צבעים מסוימים לאשכולות יעד שונים, בהתאם להוראות הבחירה להקצאת הצעות נפתחות לחלון אשכולות. לאחר הקצאת כל צבעי היעד, נתוני הכימות יוצגו בחלון נתוני הבאר. יצא את הנתונים כקובץ CSV לניתוח נוסף.כפי שנצפה בניתוח שיפוע טמפרטורה מייצג זה, טמפרטורות כריעה גבוהות יותר לא יכלו להבחין בבירור בין טיפות חיוביות לטיפות שליליות כאשר בוצעה בדיקת דופלקס. עם זאת, עם ירידה בטמפרטורת הכריעה, הושגה הפרדה אופטימלית בין טיפות חיוביות ושליליות. באמצעות מערכת זיהוי PCR דיגיטלית טיפתית RT בשני צבעים, ניתן לזהות מטרה אחת, שתיים, שלוש וארבע מטרות SARS-CoV-2 בדגימה אחת.ניתן להשתמש בדוגמת בקרה ללא תבנית כדי לאתר טיפות שליליות כדי לסייע בקביעת הסף השלילי בבדיקות חד-צדדיות. במבחני דופלקס, הניתוח יכול להתבצע בערוצים בודדים או באמפליטודה הדו-ממדית. למרות שניתוח נתונים של מבחני מולטיפלקס מסדר גבוה יותר אינו פשוט, בדיקות אלה שימושיות, מכיוון שהן מאפשרות להעריך עד שמונה אשכולות טיפות במבחני תערובת בדיקה טריפלקסית ועד 16 אשכולות טיפות עבור מבדקים מבוססי משרעת מרובעת.בהתאם לבדיקה שיש לפתח, ודא שפריימר המטרה הנכון וריכוזי הבדיקה מתווספים לתמהיל האב. באמצעות הליך זה, ניתן להחליף את המטרות כדי לפתח בדיקות RT-ddPCR חדשניות. בדיקה זו יכולה לשמש למטרות מחקר שונות או לאבחון של מחלות זיהומיות מתפתחות.מאז פיתוחה, טכניקה זו שימשה לקביעה מדויקת של עותקים של חומצות גרעין נגיפיות בתקנים שונים, גוף האדם ודגימות סביבתיות.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Multiplex PCR הפוך כתם וקו הכלאה Assay (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

אופטימליים PCR מבוססי זיהוי של Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

כימות מוחלטת של פלזמה רמות MicroRNA בקופים Cynomolgus, באמצעות שעתוק במהופך בזמן אמת PCR כמותי

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

אנליזה microbiota באמצעות שני שלבים PCR ו-הדור הבא של 16 rRNA גן רצף

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

אסטרטגיה דו-שלבית המשלבת שינוי אפיגנטי ורמזים ביומכניים ליצירת תאים פלוריפוטנטיים של יונקים

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

סניקה של הסביבה העירונית - צינור לדגימה וזיהוי של SARS-CoV-2 ממאגרים סביבתיים

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

הדמיה קונפוקלית בתפוקה גבוהה של מטרימי ספייק SARS-CoV-2 מצומדים קוונטיים למעקב אחר כריכה ואנדוציטוזיס בתאי HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

כימות רנ"א מעגלי באמצעות טיפות דיגיטליות PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...