Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Questa ricerca è stata finanziata da Megaproject of Infectious Disease Control del Ministero della Salute della Cina, numero di sovvenzione 2017ZX10302301-005 e Sino-Africa Joint Research Center, numero di sovvenzione SAJC201605.

Dichiarazione etica Wuhan Institute of Virology (WHIOV) è tra i laboratori e gli istituti approvati dal China CDC della città di Wuhan per condurre ricerche su SARS-CoV-2 e rilevare COVID-19 da campioni clinici. La ricerca sullo sviluppo di nuove tecniche diagnostiche per COVID-19 utilizzando campioni clinici è stata approvata anche dal comitato etico dell'Istituto di virologia di Wuhan (2020FCA001).
1. Flusso di lavoro di elaborazione dei campioni (Fi...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Sono disponibili poche risorse su come sviluppare saggi RT-ddPCR per il rilevamento di SARS-CoV-2. Sebbene non utilizzati in questo articolo, i campioni standard con copie note possono essere utilizzati per sviluppare e ottimizzare i saggi. In questo lavoro, tuttavia, i campioni di SARS-CoV-2 cresciuti in cellule Vero-E6 sono stati inseriti in uno sfondo di RNA genomico umano e utilizzati come campioni standard per sviluppare i saggi. Sequenze di primer e sonde adeguate sono essenziali quando si sviluppano saggi. Poiché...

La reazione a catena della polimerasi (PCR), una tecnica ben riconosciuta, ha subito diverse trasformazioni dal suo avvento per diventare una tecnica potente in grado di fornire risposte alla ricerca sugli acidi nucleici. Queste trasformazioni sono state un costante miglioramento della vecchia tecnica. Queste trasformazioni possono essere riassunte in tre generazioni1. La prima generazione è la PCR convenzionale che si basa sull'elettroforesi su gel per quantificare e rilevare bersagli amplificati. La seconda generazione è la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) in grado di rilevare campioni in tempo reale e fare affidamento su una curva standard per quantificare direttamente i bersagli in un campione. La terza generazione, la PCR digitale (dPCR), può eseguire sia il rilevamento che la quantificazione assoluta dei bersagli degli acidi nucleici senza la necessità di una curva standard. La dPCR è stata ulteriormente migliorata dalle camere di reazione separate dai pozzetti di una parete in emulsioni di olio, acqua e sostanze chimiche stabilizzanti all'interno dello stesso pozzo come visto nellaPCR digitale 2 basata su goccioline. Nella PCR digitale a goccia (ddPCR), un campione viene partizionato in migliaia di goccioline di dimensioni nanolitri contenenti singoli bersagli che saranno successivamente quantificati utilizzando le statistiche di Poisson 2,3,4. Questa tecnica dà alla ddPCR un vantaggio nel quantificare bersagli a bassa abbondanza rispetto alle altre generazioni di PCR.
Recentemente, molteplici applicazioni hanno evidenziato la superiorità della ddPCR rispetto alla qPCR comunemente usata nel rilevare e quantificare bersagli a bassa abbondanza 1,5,6. SARS-CoV-2 non fa eccezione a queste applicazioni 7,8,9,10,11,12. Dall'epidemia di SARS-CoV-2, gli scienziati hanno lavorato su tutti i fronti per trovare soluzioni su come diagnosticare il virus e rilevarlo in modo efficiente. L'attuale gold standard deve ancora essere qPCR13. Tuttavia, RT-ddPCR ha dimostrato di essere più accurato nel rilevare bersagli SARS-CoV-2 a bassa abbondanza da campioni sia ambientali che clinici rispetto a RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. La maggior parte dei lavori pubblicati su SARS-CoV-2 ddPCR dipendono da saggi simplex con quelli multiplex che dipendono da saggi commerciali. Quindi, si dovrebbe fare di più per spiegare come sviluppare saggi RT-dPCR multiplex per il rilevamento di SARS-CoV-2.
In un corretto progetto di analisi, il multiplexing può essere utilizzato per risparmiare sui costi, aumentare la produttività del campione e massimizzare il numero di obiettivi che possono essere rilevati in modo sensibile all'interno di un campione piccolo. Quando si esegue il multiplexing con ddPCR, si deve tenere conto di quanti fluorofori possono essere rilevati in un particolare sistema. Alcune piattaforme ddPCR possono supportare fino a tre canali, mentre altre supportano solo due canali. Quindi, quando si esegue il multiplexing con due canali, è necessario utilizzare approcci diversi, incluso il multiplexing di ordine superiore per rilevare più di due target14,15,16. In questo lavoro, un sistema di rilevamento ddPCR a due colori viene utilizzato per mostrare i passaggi su come sviluppare diversi saggi SARS-CoV-2 RT-ddPCR che possono essere adattati per diverse applicazioni di ricerca.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

La diagnosi della pandemia di SARS-CoV-2 in corso è una priorità per tutti i paesi del mondo. Attualmente, la PCR quantitativa a trascrizione inversa (RT-qPCR) è il gold standard per la diagnosi di SARS-CoV-2 in quanto non è disponibile una soluzione permanente. Per quanto efficace possa essere questa tecnica, la ricerca è emersa mostrando i suoi limiti nel rilevamento e nella diagnosi, specialmente quando si tratta di obiettivi a bassa abbondanza. Al contrario, la PCR digitale a goccia (ddPCR), una recente tecnologia emergente con vantaggi superiori rispetto alla qPCR, ha dimostrato di superare le sfide della RT-qPCR nella diagnosi di SARS-CoV-2 da campioni bersaglio a bassa abbondanza. In prospettiva, in questo articolo, le capacità di RT-ddPCR sono ulteriormente ampliate mostrando i passaggi su come sviluppare saggi simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex utilizzando un sistema di rilevamento a due colori. Utilizzando primer e sonde mirati a siti specifici del genoma di SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 e RBD2), lo sviluppo di questi saggi si è dimostrato possibile. Inoltre, vengono forniti protocolli dettagliati, note e suggerimenti passo dopo passo su come migliorare il flusso di lavoro dei saggi e analizzare i dati. L'adattamento di questo flusso di lavoro nei lavori futuri garantirà che il numero massimo di obiettivi possa essere rilevato in modo sensibile in un piccolo campione, migliorando significativamente i costi e la produttività del campione.

In uno studio proof-of-concept, le prestazioni analitiche dei test multiplex sono state testate su campioni clinici e di ricerca19. Le prestazioni dei test multiplex erano superiori a quelle di una RT-PCR19. Poiché un basso numero di goccioline può indicare un problema durante la generazione di goccioline, in questo articolo è stato impostato un limite di 10.000 goccioline per pozzetto basato su dati empirici.
Una buona separazione tra gocciol...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Questo lavoro riassume i passaggi nello sviluppo di diversi saggi per il rilevamento di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema ddPCR a due colori. I passaggi sono elaborati e sono state incluse note su come migliorare i test e le prestazioni dell'esperimento. Questi test possono essere utilizzati per molteplici applicazioni SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Protocolli di PCR digitale a goccia di trascrizione inversa in due fasi per il rilevamento e la quantificazione di SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Questi protocolli possono essere utilizzati per sviluppare saggi ddPCR multiplex interni per il rilevamento di SARS-CoV-2 utilizzando un sistema ddPCR a due colori. Questo è utile per le persone che vogliono sviluppare i propri kit per il rilevamento di SARS-CoV-2 e altri agenti patogeni. Rispetto al gold standard RT-qPCR, RT-ddPCR può essere utilizzato per quantificare più geni SARS-CoV-2 senza la necessità di una curva standard.Poiché la ddPCR è una tecnica emergente, la dimostrazione visiva è importante per aiutare gli utenti attuali e futuri a comprendere e sviluppare facilmente saggi multiplex per il rilevamento di SARS-CoV-2 e altri agenti patogeni. Per la sintesi del cDNA, aggiungere due microlitri di master mix di trascrizione inversa 5X, cinque microlitri del campione di RNA di interesse e tre microlitri di acqua doppia distillata priva di RNasi in un tubo PCR da 100 o 200 microlitri a un volume finale di 10 microlitri come soluzione e posizionare il tubo su ghiaccio. Una volta spenti i reagenti, caricare il campione in un termociclatore e impostare lo strumento per eseguire una trascrizione inversa a 37 gradi Celsius per 15 minuti, un'inattivazione termica della trascrizione inversa per 5 secondi a 85 gradi Celsius e una tenuta infinita finale a quattro gradi Celsius.Prima di eseguire la PCR digitale a goccia, aggiungere 19,8 microlitri di master mix appena preparato al numero appropriato di pozzetti di una piastra PCR digitale a 96 pozzetti priva di nucleasi. Aggiungere 2,2 microlitri di cDNA a ciascun pozzetto di miscela master per un volume finale di 22 microlitri di miscela di reazione per pozzetto e sigillare la piastra con un sigillante monouso per piastre PCR. Quindi, vortice la piastra per 15-30 secondi in centrifuga per 10-15 secondi per raccogliere il contenuto del pozzo sul fondo della piastra.Per la generazione automatica di gocce sul touchscreen del generatore automatico di gocce, fare clic su configura piastra campione e selezionare le colonne in cui si trovano i campioni sulla piastra campione. Fare clic su OK e aprire la porta automatica del generatore di gocce. Caricare le piastre di generazione del campione e delle gocce e gli altri materiali necessari per l'esperimento nelle rispettive posizioni all'interno dello strumento e chiudere la porta.Quando il touchscreen diventa verde, indicando che tutti i materiali sono stati caricati nelle loro posizioni corrette, selezionare l'olio per le sonde e avviare la generazione di gocce. Attendere che la generazione di goccioline venga eseguita fino al completamento in base al tempo indicato sullo schermo. Quando lo schermo dice Droplets ready, aprire lo sportello per rimuovere la piastra contenente le goccioline e utilizzare un sigillante per cinque secondi a 180 gradi Celsius per sigillare la piastra con un sigillo di alluminio perforabile.Entro 30 minuti dalla generazione delle gocce, posizionare la piastra di goccia sigillata in un termociclatore a 96 pozzetti profondi. Impostare il volume del campione su 40 microlitri e la temperatura del coperchio su 105 gradi Celsius. Quindi, la PCR amplifica le goccioline.Per la lettura delle goccioline, dopo l'amplificazione, trasferire la piastra termica a 96 pozzetti in un lettore di gocce e aprire il software di accompagnamento su un computer collegato al lettore di gocce. Dalla modalità di configurazione, selezionare Nuovo e fare doppio clic su qualsiasi pozzo per aprire la finestra di dialogo dell'editor del pozzo. Selezionare i pozzetti da leggere e impostare l'esperimento alla quantificazione assoluta, il supermix a goccia di PCR digitale supermix per le sonde.Impostare come destinazione un tipo al canale 1 sconosciuto e due tipi al canale 2 sconosciuto. Assegnare i nomi dei campioni in base al layout della piastra e fare clic su Applica e OK. Dopo aver salvato il modello, fare clic su Esegui.Quando richiesto dal software, selezionare il colore FAM/HEX. Al termine dell'acquisizione dei dati, rimuovere la targhetta dal lettore. Prima di analizzare i dati, controllare i dati di tutti i pozzi per ottenere il numero totale di goccioline.E imposta un limite per accettare un numero minimo di goccioline da contare come risultati positivi o negativi. Per l'analisi del saggio simplex e duplex, fare doppio clic sul file QLP da analizzare e selezionare Analizza. Utilizzare gli strumenti Ampiezza 1D e Soglia ampiezza 2D per distinguere tra le goccioline positive e negative per ogni pozzetto nel canale corretto, utilizzando il controllo modello di nodo e gli esempi di controllo positivo come guida.Quindi, esporta i risultati come file CSV per ulteriori analisi. Per un test di miscelazione di sonde triplex, aprire il file QLP e selezionare i pozzetti da analizzare nella scheda Editor piastre. Impostare il tipo di esperimento per la quantificazione diretta e il test per sondare il triplice mix e immettere il nome della destinazione.Quindi fare clic su Applica. Utilizzare gli strumenti grafici per assegnare colori specifici a diversi cluster di destinazione come indicato dalla selezione per assegnare suggerimenti popup della finestra del cluster. Quando tutti i colori target sono stati assegnati, i dati di quantificazione verranno visualizzati nella finestra dei dati del pozzo.Esportare i dati come file CSV per l'analisi a valle. Per un test quadruplex, impostare il tipo di esperimento sulla quantificazione diretta e il test sul multiplex di ampiezza. Immettere il nome di destinazione e fare clic su Applica.Utilizzare gli strumenti grafici per assegnare colori specifici a diversi cluster di destinazione come indicato dalla selezione per assegnare suggerimenti popup della finestra del cluster. Quando tutti i colori target sono stati assegnati, i dati di quantificazione verranno visualizzati nella finestra dei dati del pozzo. Esporta i dati come file CSV per ulteriori analisi.Come osservato in questa analisi rappresentativa del gradiente di temperatura, temperature più elevate in ginocchio non sono state in grado di distinguere chiaramente le goccioline positive dalle goccioline negative quando è stato eseguito un test duplex. Tuttavia, con una diminuzione della temperatura inginocchiata, è stata raggiunta una separazione ottimale tra goccioline positive e negative. Utilizzando un sistema di rilevamento PCR digitale a goccia RT a due colori, è possibile rilevare uno, due, tre e quattro bersagli SARS-CoV-2 all'interno di un singolo campione.È possibile utilizzare un esempio di controllo senza modello per individuare le goccioline negative per aiutare a impostare la soglia negativa nei saggi simplex. Nei saggi duplex, l'analisi può essere eseguita in singoli canali o nell'ampiezza 2D. Sebbene l'analisi dei dati dei saggi multiplex di ordine superiore non sia semplice, questi test sono utili, perché consentono di valutare fino a otto cluster di goccioline in saggi di mix di sonde triplex e fino a 16 cluster di goccioline per saggi basati sull'ampiezza quadruplex.A seconda del test da sviluppare, assicurarsi che le corrette concentrazioni di primer e sonda target siano aggiunte al master mix. Utilizzando questa procedura, si possono alternare gli obiettivi per sviluppare nuovi saggi RT-ddPCR. Questi test possono essere utilizzati per diversi scopi di ricerca o per la diagnosi di malattie infettive emergenti.Fin dal suo sviluppo, questa tecnica è stata utilizzata per la determinazione accurata delle copie di acido nucleico virale in diversi standard, il corpo umano e campioni ambientali.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

PCR multiplex e Reverse Blot Assay Linea Hybridization (MPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Ricerca

Biologia

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Ottimizzati basati sulla PCR Rilevazione di Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

L&#39;isolamento di epatociti umani da un Two-step Collagenase perfusione procedura

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Impiegando digitale Droplet PCR per identificare mutazioni BRAF V600E in inclusi in paraffina fissati in formalina Linee cella di riferimento standard

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Analisi microbiota utilizzando PCR in due fasi e sequenziamento genico rRNA 16S di nuova generazione

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Una strategia in due fasi che combina modificazione epigenetica e segnali biomeccanici per generare cellule pluripotenti di mammifero

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Tamponare l'ambiente urbano - Una pipeline per il campionamento e il rilevamento della SARS-CoV-2 dai bacini ambientali

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Imaging confocale ad alto rendimento di trimeri spike SARS-CoV-2 coniugati quantum dot per tracciare il legame e l'endocitosi nelle cellule HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Quantificazione di RNA circolari mediante Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...