Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
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この研究は、中国保健省の感染症対策メガプロジェクト(助成金番号2017ZX10302301-005)および中アフリカ共同研究センター(助成金番号SAJC201605)から資金提供を受けました。

倫理声明 武漢ウイルス学研究所(WHIOV)は、武漢市の中国CDCによってSARS-CoV-2の研究を実施し、臨床サンプルからCOVID-19を検出することを承認された研究所の1つです。臨床サンプルを使用したCOVID-19の新しい診断技術の開発に関する研究は、武漢ウイルス学研究所の倫理委員会(2020FCA001)によっても承認されています。
1. サンプル処理ワークフロー(<strong class="xfig"...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

SARS-CoV-2検出のためのRT-ddPCRアッセイの開発方法に関するリソースはほとんどありません。この記事では使用しませんが、既知のコピーを含む標準サンプルを使用して、アッセイを開発および最適化できます。ただし、この研究では、Vero-E6細胞で増殖したSARS-CoV-2サンプルをヒトゲノムRNAのバックグラウンドでスパイクし、アッセイを開発するための標準サンプルとして使用しました。適切な?...

よく知られている技術であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、その登場以来、核酸研究に答えを提供できる強力な技術になるためにいくつかの変革を遂げてきました。これらの変換は、古い手法の絶え間ない改善でした。これらの変換は、3世代に要約できます1。第1世代は、増幅されたターゲットを定量および検出するためにゲル電気泳動に依存する従来のPCRです。第2世代は定量的リアルタイムPCR(qPCR)で、サンプルをリアルタイムで検出し、標準曲線に依存してサンプル中のターゲットを直接定量することができます。第3世代のデジタルPCR(dPCR)は、標準曲線を必要とせずに核酸標的の検出と絶対定量の両方を実行できます。dPCRはまた、液滴ベースのデジタルPCR2に見られるように、壁のウェルによって分離された反応チャンバーから、同じウェル内の油、水、および安定化化学物質のエマルジョンにさらに改善されました。液滴デジタルPCR(ddPCR)では、サンプルは個々のターゲットを含む数千のナノリットルサイズの液滴に分割され、後でポアソン統計2,3,4を使用して定量されます。この手法により、ddPCRは、他の世代のPCRと比較して、存在量の少ないターゲットを定量する上で優位に立つことができます。
最近、複数のアプリケーションが、低存在量のターゲットを検出および定量する際に、一般的に使用されるqPCRに対するddPCRの優位性を強調しています1,5,6。SARS-CoV-2は、これらのアプリケーション7、8、9、10、11、12の例外ではありません。SARS-CoV-2の発生以来、科学者たちはウイルスを診断し、効率的に検出する方法に関する解決策を考え出すためにあらゆる面で取り組んできました。現在のゴールドスタンダードはまだqPCR13です。ただし、RT-ddPCRは、RT-qPCR7、8、9、10、11、12と比較して、環境サンプルと臨床サンプルの両方から低存在量のSARS-CoV-2ターゲットをより正確に検出できることが示されています。SARS-CoV-2 ddPCRで発表された研究のほとんどはシンプレックスアッセイに依存しており、マルチプレックスアッセイは市販のアッセイに依存しています。したがって、SARS-CoV-2検出のためのマルチプレックスRT-dPCRアッセイを開発する方法を説明するために、さらに多くのことを行う必要があります。
適切なアッセイデザインでは、マルチプレックスを使用してコストを節約し、サンプルスループットを向上させ、小さなサンプル内で高感度に検出できるターゲットの数を最大化できます。ddPCRでマルチプレックス化する場合、特定のシステムで検出できる蛍光色素の数を考慮する必要があります。ddPCRプラットフォームには、最大3つのチャネルをサポートできるものもあれば、2つのチャネルのみをサポートするものもあります。したがって、2つのチャネルで多重化する場合、2つ以上のターゲットを検出するための高次多重化を含む異なるアプローチを使用する必要があります14、15、16。この研究では、2色ddPCR検出システムを使用して、さまざまな研究アプリケーションに適応できるさまざまなSARS-CoV-2RT-ddPCRアッセイを開発する方法の手順を示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

進行中のSARS-CoV-2パンデミックの診断は、世界中のすべての国にとって優先事項です。現在、逆転写定量PCR(RT-qPCR)は、恒久的な解決策が利用できないため、SARS-CoV-2診断のゴールドスタンダードです。この手法がどれほど効果的であっても、特に存在量の少ないターゲットに関しては、検出と診断の限界を示す研究が浮上しています。対照的に、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)は、qPCRよりも優れた利点を持つ最近の新興技術であり、低量のターゲットサンプルからのSARS-CoV-2の診断におけるRT-qPCRの課題を克服することが示されています。この記事では、2色検出システムを使用してシンプレックス、デュプレックス、トリプレックスプローブミックス、およびクワッドプレックスアッセイを開発する方法の手順を示すことで、RT-ddPCRの機能をさらに拡張します。SARS-CoV-2ゲノムの特定の部位(N、ORF1ab、RPP30、およびRBD2)を標的とするプライマーとプローブを使用して、これらのアッセイの開発が可能であることが示されています。さらに、アッセイワークフローを改善し、データを分析する方法に関する詳細なプロトコル、メモ、および提案を段階的に提供します。このワークフローを将来の作業に適応させることで、小さなサンプルで最大数のターゲットを高感度に検出できるようになり、コストとサンプルスループットが大幅に向上します。

概念実証研究において、マルチプレックスアッセイの分析性能を臨床および研究サンプル19で試験した。マルチプレックスアッセイの性能はRT-PCR19よりも優れていました。液滴数が少ない場合は液滴生成中の問題を示している可能性があるため、この記事では、経験的データに基づいてウェルあたり10,000液滴のカットオフを設定しました。
<p class="jove_cont...

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Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

この作業では、2色ddPCRシステムを使用したSARS-CoV-2検出のためのさまざまなアッセイを開発する手順を要約しています。手順は精巧であり、アッセイと実験のパフォーマンスを改善する方法に関するメモが含まれています。これらのアッセイは、複数のSARS-CoV-2 RT-ddPCRアプリケーションに使用できます。

SARS-CoV-2の検出と定量のための2段階逆転写液滴デジタルPCRプロトコル

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

これらのプロトコルは、2色ddPCRシステムを使用してSARS-CoV-2を検出するための社内マルチプレックスddPCRアッセイを開発するために使用できます。これは、SARS-CoV-2やその他の病原体を検出するための独自のキットを開発したい人に役立ちます。ゴールドスタンダードのRT-qPCRと比較して、RT-ddPCRは、標準曲線を必要とせずに複数のSARS-CoV-2遺伝子を定量するために使用できます。ddPCRは新しい技術であるため、現在および将来のユーザーがSARS-CoV-2検出やその他の病原体のマルチプレックスアッセイを理解し、簡単に開発できるようにするには、視覚的なデモンストレーションが重要です。cDNA合成の場合は、2マイクロリットルの5X逆転写マスターミックス、5マイクロリットルの目的のRNAサンプル、および3マイクロリットルのRNaseフリー二重蒸留水を100または200マイクロリットルのPCRチューブに加え、溶液として最終容量10マイクロリットルにし、チューブを氷上に置きます。試薬がオフになったら、サンプルをサーマルサイクラーにロードし、摂氏37度で15分間逆転写を実行し、摂氏85度で5秒間逆転写を熱失活させ、摂氏4度で最終的な無限ホールドを実行するように装置を設定します。液滴デジタルPCRを実行する前に、19.8マイクロリットルの新たに調製したマスターミックスを、ヌクレアーゼフリーの96ウェル液滴デジタルPCRプレートの適切な数のウェルに追加します。マスターミックスの各ウェルに2.2マイクロリットルのcDNAを加え、ウェルあたり22マイクロリットルの反応ミックスの最終容量にし、使い捨てPCRプレートシーラーでプレートを密封します。次に、プレートを遠心分離機で15〜30秒間ボルテックスし、プレートの底部にあるウェル内容物を回収する。自動液滴発生器のタッチスクリーンで液滴を自動生成するには、サンプルプレートの設定をクリックし、サンプルプレート上のサンプルが配置されているカラムを選択します。[OK]をクリックして、自動液滴発生器ドアを開きます。実験に必要なサンプルや液滴生成プレートなど、装置内の各場所にセットし、ドアを閉めます。タッチスクリーンが緑色に変わり、すべての材料が正しい位置にロードされたことを示したら、プローブ用のオイルを選択し、液滴の生成を開始します。画面に表示されている時間に従って、液滴の生成が完了するのを待ちます。画面に「液滴の準備ができました」と表示されたら、ドアを開けて液滴を含むプレートを取り出し、プレートシーラーを摂氏180度で5秒間使用して、穴の開いたホイルシールでプレートをシールします。液滴生成から30分以内に、密封された液滴プレートを96ディープウェルサーマルサイクラーに入れます。サンプル量を40マイクロリットルに設定し、蓋の温度を摂氏105度に設定します。次に、PCRは液滴を増幅します。液滴読み取りの場合、増幅後、サーマルサイクルされた96ウェルプレートを液滴リーダーに移し、液滴リーダーに接続されたコンピューターで付属のソフトウェアを開きます。セットアップ モードから [新規] を選択し、任意のウェルをダブルクリックして [ウェル エディタ] ダイアログ ボックスを開きます。読み取るウェルを選択し、実験を絶対定量、スーパーミックスから液滴デジタルPCRスーパーミックス用プローブに設定します。1 つのタイプをチャネル 1 不明にターゲットにし、2 つのタイプをチャネル 2 不明にターゲットにします。プレートレイアウトに基づいてサンプル名を割り当て、[適用]と[OK]をクリックします。テンプレートを保存したら、[実行] をクリックします。ソフトウェアによってプロンプトが表示されたら、FAM / HEXカラーを選択します。データ収集の最後に、リーダーからプレートを取り外します。データを解析する前に、すべてのウェルのデータをチェックして、液滴の総数を取得します。そして、陽性または陰性の結果としてカウントされる液滴の最小数を受け入れるようにカットオフを設定します。シンプレックスおよびデュプレックスアッセイ解析の場合は、解析するQLPファイルをダブルクリックし、解析を選択します。1D振幅および2D振幅閾値ツールを使用して、ノードテンプレートコントロールとポジティブコントロールサンプルをガイドとして使用して、正しいチャネル内の各ウェルの正液滴と負液滴を区別します。次に、追加の分析のために結果を CSV ファイルとしてエクスポートします。トリプレックスプローブミックスアッセイの場合は、QLPファイルを開き、プレートエディタータブで分析するウェルを選択します。実験タイプをダイレクト定量に設定し、アッセイをプローブミックストリプレックスに設定し、ターゲット名を入力します。次に、[適用] をクリックします。グラフツールを使用して、クラスターウィンドウの選択ポップアップの提案の指示に従って、異なるターゲットクラスターに特定の色を割り当てます。すべてのターゲットカラーが割り当てられると、定量データがウェルデータウィンドウに表示されます。ダウンストリーム分析用にデータを CSV ファイルとしてエクスポートします。四重鎖アッセイの場合は、実験タイプを直接定量に設定し、アッセイを振幅マルチプレックスに設定します。ターゲット名を入力し、[適用] をクリックします。グラフツールを使用して、クラスターウィンドウの選択ポップアップの提案の指示に従って、異なるターゲットクラスターに特定の色を割り当てます。すべてのターゲットカラーが割り当てられると、定量データがウェルデータウィンドウに表示されます。追加の分析のために、データを CSV ファイルとしてエクスポートします。この代表的な温度勾配分析で観察されたように、デュプレックスアッセイを実行したときに、より高いニーリング温度は正の液滴と負の液滴を明確に区別することができませんでした。しかしながら、ひざまずく温度の低下と共に、正および負の液滴の間の最適な分離が達成された。2色のRT液滴デジタルPCR検出システムを使用すると、1つのサンプル内で1つ、2つ、3つ、および4つのSARS-CoV-2ターゲットを検出することができます。テンプレートなしの対照サンプルを使用して陰性の液滴を見つけ、シンプレックスアッセイで負の閾値を設定するのに役立ちます。二重鎖アッセイでは、分析は個々のチャンネルまたは2D振幅で実行できます。高次マルチプレックスアッセイのデータ解析は簡単ではありませんが、トリプレックスプローブミックスアッセイでは最大8つの液滴クラスターを、四重振幅ベースのアッセイでは最大16の液滴クラスターを評価できるため、これらのアッセイは有用です。開発するアッセイに応じて、正しいターゲットプライマーとプローブの濃度がマスターミックスに追加されていることを確認してください。この手順を使用して、新しいRT-ddPCRアッセイを開発するためにターゲットを交互にすることができます。このアッセイは、さまざまな研究目的や新興感染症の診断に使用できます。開発以来、この技術は、さまざまな標準、人体、および環境サンプル中のウイルス核酸コピーの正確な測定に使用されてきました。

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

マルチプレックスPCRおよび逆ラインブロットハイブリダイゼーションアッセイ（mPCR / RLB）

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Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

マイコプラズマの最適化されたPCRベースの検出

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Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

二段階コラゲナーゼ灌流手順によって、ヒト肝細胞の分離

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Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

ホルマリン固定パラフィン包埋参照標準細胞株にBRAF V600E変異を検出するデジタルドロップレットPCRを採用

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

定量的リアルタイム逆転写 PCR を用いたカニクイザルにおける血中マイクロ Rna の絶対定量

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Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

2段階PCRと次世代16S rRNA遺伝子シーケンシングを用いての微生物叢解析

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エピジェネティック修飾と生体力学的手がかりを組み合わせて哺乳類多能性細胞を生成する2段階戦略

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Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

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HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

デジタル液滴PCRを用いた環状RNAの定量

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...