Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

이 연구는 중국 보건부의 전염병 통제 메가 프로젝트(보조금 번호 2017ZX10302301-005) 및 중국-아프리카 공동 연구 센터(보조금 번호 SAJC201605)의 지원을 받았습니다.

윤리적 진술 우한 바이러스 연구소(WHIOV)는 SARS-CoV-2에 대한 연구를 수행하고 임상 샘플에서 COVID-19를 검출하기 위해 우한시의 중국 CDC에서 승인한 실험실 및 기관 중 하나입니다. 임상 샘플을 사용한 COVID-19에 대한 새로운 진단 기술 개발에 대한 연구도 우한 바이러스 연구소 윤리 위원회(2020FCA001)의 승인을 받았습니다.
1. 샘플 처리 워크플로(그림 1...

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	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

SARS-CoV-2 검출을 위한 RT-ddPCR 분석을 개발하는 방법에 대한 리소스는 거의 없습니다. 이 기사에서는 사용되지 않지만 알려진 사본이 있는 표준 샘플을 사용하여 분석을 개발하고 최적화할 수 있습니다. 그러나 이 작업에서는 Vero-E6 세포에서 성장한 SARS-CoV-2 샘플을 인간 게놈 RNA의 배경에 스파이크하여 분석을 개발하기 위한 표준 샘플로 사용했습니다. 적절한 프라이머 및 프로브 서열은 분석을 개?...

잘 알려진 기술인 중합효소연쇄반응(PCR)은 핵산 연구에 대한 해답을 제공할 수 있는 강력한 기술이 되기 위해 등장한 이후 여러 가지 변형을 거쳤습니다. 이러한 변형은 이전 기술의 지속적인 개선이었습니다. 이러한 변형은 3세대로 요약할 수 있다1. 1세대는 증폭된 표적을 정량화하고 검출하기 위해 겔 전기영동에 의존하는 기존 PCR입니다. 2세대는 실시간으로 시료를 검출할 수 있는 정량적 실시간 PCR(qPCR)이며 표준 곡선을 사용하여 시료의 표적을 직접 정량화할 수 있습니다. 3세대 디지털 PCR(dPCR)은 표준 곡선 없이 핵산 표적의 검출 및 절대 정량을 모두 수행할 수 있습니다. dPCR은 또한 액적 기반 디지털 PCR2에서 볼 수 있는 것과 동일한 웰 내에서 벽의 웰에 의해 오일, 물 및 안정화 화학 물질의 에멀젼으로 분리되는 반응 챔버에서 더욱 개선되었습니다. 액적 디지털 PCR(ddPCR)에서 샘플은 나중에 푸아송 통계 2,3,4를 사용하여 정량화될 개별 표적을 포함하는 수천 나노리터 크기의 액적으로 분할됩니다. 이 기술은 ddPCR이 다른 세대의 PCR과 비교할 때 낮은 농도의 표적을 정량화하는 데 우위를 점할 수 있도록 합니다.
최근에, 다수의 응용은 낮은 풍부 표적 1,5,6을 검출하고 정량화할 때 일반적으로 사용되는 qPCR에 비해 ddPCR의 우월성을 강조했다. SARS-CoV-2도 이러한 응용 프로그램 7,8,9,10,11,12에서 예외는 아닙니다. SARS-CoV-2가 발생한 이후 과학자들은 바이러스를 진단하고 효율적으로 탐지하는 방법에 대한 솔루션을 제시하기 위해 모든 전선에서 노력해 왔습니다. 현재 금본위제는 여전히 qPCR13으로 남아 있습니다. 그러나 RT-ddPCR은 RT-qPCR 7,8,9,10,11,12와 비교할 때 환경 및 임상 모두에서 낮은 풍부 SARS-CoV-2 표적을 검출하는 데 더 정확한 것으로 나타났습니다. SARS-CoV-2 ddPCR 발표 작업의 대부분은 상업용 분석에 따라 다중 분석과 함께 심플렉스 분석에 의존합니다. 따라서 SARS-CoV-2 검출을 위한 다중 RT-dPCR 분석을 개발하는 방법을 설명하기 위해 더 많은 작업을 수행해야 합니다.
적절한 분석 설계에서 멀티플렉싱을 사용하여 비용을 절감하고 시료 처리량을 늘리며 작은 시료 내에서 민감하게 검출할 수 있는 표적 수를 최대화할 수 있습니다. ddPCR로 멀티플렉싱할 때 특정 시스템에서 얼마나 많은 형광단을 검출할 수 있는지 고려해야 합니다. 일부 ddPCR 플랫폼은 최대 3개의 채널을 지원할 수 있는 반면 다른 플랫폼은 2개의 채널만 지원할 수 있습니다. 그러므로, 2개의 채널로 다중화할 때, 2개 이상의 타겟(14,15,16)을 검출하기 위해 고차 다중화를 포함하는 상이한 접근법을 사용해야 한다. 이 작업에서는 2색 ddPCR 검출 시스템을 사용하여 다양한 연구 응용 분야에 적용할 수 있는 다양한 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 분석을 개발하는 방법에 대한 단계를 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

진행중인 SARS-CoV-2 전염병의 진단은 전 세계 모든 국가의 우선 순위입니다. 현재 역전사 정량 PCR(RT-qPCR)은 영구적인 솔루션을 사용할 수 없기 때문에 SARS-CoV-2 진단의 황금 표준입니다. 이 기술이 아무리 효과적일 수 있지만, 특히 낮은 풍부 표적과 관련하여 탐지 및 진단의 한계를 보여주는 연구가 나타났습니다. 대조적으로, qPCR보다 우수한 장점을 가진 최근 신기술인 액적 디지털 PCR(ddPCR)은 낮은 풍부 표적 샘플에서 SARS-CoV-2 진단에서 RT-qPCR의 문제를 극복하는 것으로 나타났습니다. 이 기사에서는 2색 검출 시스템을 사용하여 심플렉스, 듀플렉스, 트리플렉스 프로브 믹스 및 쿼드러플렉스 분석을 개발하는 방법에 대한 단계를 보여줌으로써 RT-ddPCR의 기능을 더욱 확장합니다. SARS-CoV-2 게놈(N, ORF1ab, RPP30 및 RBD2)의 특정 부위를 표적으로 하는 프라이머와 프로브를 사용하여 이러한 분석법의 개발이 가능한 것으로 나타났습니다. 또한 분석 워크플로를 개선하고 데이터를 분석하는 방법에 대한 단계별 세부 프로토콜, 메모 및 제안이 제공됩니다. 향후 작업에서 이 워크플로우를 조정하면 작은 샘플에서 최대 수의 표적을 민감하게 검출할 수 있어 비용과 샘플 처리량이 크게 향상됩니다.

개념 증명 연구에서, 다중 분석 분석 성능은 임상 및 연구 샘플19에 대해 테스트되었습니다. 멀티플렉스 분석의 성능은 RT-PCR19의 성능보다 우수했습니다. 액적 수가 적으면 액적 생성 중에 문제가 발생할 수 있으므로 이 기사에서는 경험적 데이터를 기반으로 웰당 10,000개의 액적 컷오프를 설정했습니다.
비 간섭을 최소화하면서 양수 물방울...

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Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

이 작업은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 다양한 분석법을 개발하는 단계를 요약합니다. 단계는 정교하며 분석 및 실험 성능을 개선하는 방법에 대한 메모가 포함되어 있습니다. 이러한 분석은 여러 SARS-CoV-2 RT-ddPCR 응용 분야에 사용할 수 있습니다.

SARS-CoV-2 검출 및 정량화를 위한 2단계 역전사 액적 디지털 PCR 프로토콜

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

이러한 프로토콜은 2색 ddPCR 시스템을 사용하여 SARS-CoV-2 검출을 위한 사내 다중 ddPCR 분석을 개발하는 데 사용할 수 있습니다. 이것은 SARS-CoV-2 및 기타 병원체 검출을 위한 자체 키트를 개발하려는 사람들에게 유용합니다. 금본위제 RT-qPCR과 비교하여 RT-ddPCR은 표준 곡선 없이 여러 SARS-CoV-2 유전자를 정량화하는 데 사용할 수 있습니다.ddPCR은 새로운 기술이기 때문에 현재 및 미래의 사용자가 SARS-CoV-2 검출 및 기타 병원체에 대한 다중 분석을 이해하고 쉽게 개발할 수 있도록 시각적 시연이 중요합니다. cDNA 합성의 경우, 5X 역전사 마스터 믹스 2마이크로리터, 관심 RNA 샘플 5마이크로리터 및 RNase가 없는 이중 증류수 3마이크로리터를 용액으로 100 또는 200 마이크로리터 PCR 튜브에 넣고 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 시약이 추가되면 샘플을 열 순환기에 로드하고 섭씨 37도에서 15분 동안 역전사를 실행하고, 섭씨 85도에서 5초 동안 역전사를 열 비활성화하고, 섭씨 4도에서 최종 무한 유지를 실행하도록 기기를 설정합니다.액적 디지털 PCR을 수행하기 전에 새로 준비된 마스터 믹스 19.8마이크로리터를 뉴클레아제가 없는 96웰 액적 디지털 PCR 플레이트의 적절한 수의 웰에 추가합니다. 마스터 믹스의 각 웰에 2.2 마이크로리터의 cDNA를 웰 당 22 마이크로리터의 반응 믹스의 최종 부피에 첨가하고, 일회용 PCR 플레이트 실러로 플레이트를 밀봉한다. 이어서, 플레이트를 10 내지 15초 동안 원심분리기에서 15 내지 30초 동안 와동시켜 플레이트의 바닥에 웰 내용물을 수집하였다.자동 액적 발생기 터치스크린에서 자동 액적 생성을 위해 샘플 플레이트 구성을 클릭하고 샘플 플레이트에서 샘플이 있는 컬럼을 선택합니다. 확인을 클릭하고 자동 액적 발생기 도어를 엽니다. 시료와 액적 생성 플레이트 및 실험에 필요한 기타 재료를 기기 내의 각 위치에 넣고 도어를 닫습니다.터치스크린이 녹색으로 바뀌어 모든 재료가 올바른 위치에 로드되었음을 나타내면 프로브용 오일을 선택하고 액적 생성을 시작합니다. 화면에 표시된 시간에 따라 액적 생성이 완료될 때까지 기다립니다. 화면에 Droplets ready(물방울 준비)가 표시되면 도어를 열어 물방울이 포함된 플레이트를 제거하고 플레이트 실러를 섭씨 180도에서 5초 동안 사용하여 피어싱 가능한 호일 씰로 플레이트를 밀봉합니다.액적 생성 후 30분 이내에 밀봉된 액적 플레이트를 96 깊이의 우물 열 순환기에 넣습니다. 샘플 부피를 40마이크로리터로 설정하고 뚜껑 온도를 섭씨 105도로 설정합니다. 그런 다음 PCR은 액적을 증폭합니다.액적 판독을 위해 증폭 후 열 순환 96웰 플레이트를 액적 판독기로 옮기고 액적 판독기에 연결된 컴퓨터에서 함께 제공되는 소프트웨어를 엽니다. 설정 모드에서 새로 만들기를 선택하고 아무 웰이나 두 번 클릭하여 웰 편집기 대화 상자를 엽니다. 판독할 웰을 선택하고 실험을 절대 정량화로 설정하고, 프로브용 슈퍼믹스를 액적 디지털 PCR 슈퍼믹스로 설정합니다.한 가지 유형을 알 수 없는 채널 1로 지정하고 두 가지 유형을 알 수 없는 채널 2로 지정합니다. 플레이트 레이아웃에 따라 샘플 이름을 할당하고 적용(apply) 및 확인(okay)을 클릭합니다. 템플릿을 저장한 후 Run(실행)을 클릭합니다.소프트웨어에서 메시지가 표시되면 FAM/HEX 색상을 선택합니다. 데이터 수집이 끝나면 리더에서 플레이트를 제거합니다. 데이터를 분석하기 전에 모든 웰의 데이터를 확인하여 총 액적 수를 구하십시오.그리고 양성 또는 음성 결과로 계산할 최소 수의 물방울을 수용하도록 컷오프를 설정합니다. 심플렉스 및 듀플렉스 분석 분석의 경우 분석할 QLP 파일을 두 번 클릭하고 분석을 선택합니다. 1D 진폭 및 2D 진폭 임계값 툴을 사용하여 노드 템플릿 대조군 및 양성 대조군 샘플을 가이드로 사용하여 올바른 채널의 각 웰에 대한 양수 및 음수 액적을 구별합니다.그런 다음 추가 분석을 위해 결과를 CSV 파일로 내보냅니다. 삼중 프로브 혼합 분석의 경우 QLP 파일을 열고 플레이트 편집기 탭에서 분석할 웰을 선택합니다. 실험 유형을 직접 정량화로, 분석을 프로브 믹스 트리플렉스로 설정하고 대상 이름을 입력합니다.그런 다음 적용을 클릭합니다. 그래프 도구를 사용하여 select to assign clusters(클러스터 할당 선택) 창 팝업 제안의 지시에 따라 다른 대상 클러스터에 특정 색상을 할당합니다. 모든 대상 색상이 할당되면 정량화 데이터가 웰 데이터 창에 표시됩니다.다운스트림 분석을 위해 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다. 4중 분석의 경우 실험 유형을 직접 정량화로 설정하고 분석을 진폭 다중화로 설정합니다. 대상 이름을 입력하고 적용을 클릭합니다.그래프 도구를 사용하여 select to assign clusters(클러스터 할당 선택) 창 팝업 제안의 지시에 따라 다른 대상 클러스터에 특정 색상을 할당합니다. 모든 대상 색상이 할당되면 정량화 데이터가 웰 데이터 창에 표시됩니다. 추가 분석을 위해 데이터를 CSV 파일로 내보냅니다.이 대표적인 온도 구배 분석에서 관찰된 바와 같이, 이중 분석을 실행할 때 더 높은 무릎 꿇는 온도는 양의 물방울과 음의 물방울을 명확하게 구별할 수 없었습니다. 그러나 무릎을 꿇는 온도가 감소함에 따라 양수 및 음수 물방울 사이의 최적 분리가 달성되었습니다. 2색 RT 액적 디지털 PCR 검출 시스템을 사용하여 단일 샘플 내에서 1개, 2개, 3개 및 4개의 SARS-CoV-2 표적을 검출할 수 있습니다.템플릿이 없는 대조군 샘플은 심플렉스 분석에서 음성 임계값을 설정하는 데 도움이 되는 음성 방울을 찾는 데 사용할 수 있습니다. 듀플렉스 분석에서 분석은 개별 채널 또는 2D 진폭에서 수행할 수 있습니다. 고차 멀티플렉스 어세이 데이터 분석은 간단하지 않지만, 이러한 어세이는 삼중 프로브 혼합 어세이에서 최대 8개의 액적 클러스터를 평가할 수 있고 사중 진폭 기반 어세이의 경우 최대 16개의 액적 클러스터를 평가할 수 있기 때문에 유용합니다.개발할 분석법에 따라 올바른 표적 프라이머와 프로브 농도가 마스터 믹스에 추가되었는지 확인하십시오. 이 절차를 사용하여 새로운 RT-ddPCR 분석을 개발하기 위해 표적을 교체할 수 있습니다. 이 분석은 다양한 연구 목적이나 신종 전염병 진단에 사용할 수 있습니다.개발 이후, 이 기술은 다양한 표준, 인체 및 환경 샘플에서 바이러스 핵산 사본의 정확한 측정에 사용되었습니다.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

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Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

연구

생물학

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

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Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

도시 환경 면봉 - 환경 저수지에서 SARS-CoV-2의 샘플링 및 검출을 위한 파이프라인

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

HEK293T 세포에서 결합 및 엔도사이토시스를 추적하기 위한 양자점 접합 SARS-CoV-2 스파이크 삼량체의 고처리량 공초점 이미징

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

디지털 액적 PCR을 사용한 원형 RNA의 정량화

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...