Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Denne forskningen ble finansiert av Megaproject of Infectious Disease Control fra Helsedepartementet i Kina, tilskuddsnummer 2017ZX10302301-005 og Sino-Africa Joint Research Center, tilskuddsnummer SAJC201605.

Etisk erklæring Wuhan Institute of Virology (WHIOV) er blant laboratoriene og instituttene som er godkjent av China CDC i Wuhan by for å utføre forskning på SARS-CoV-2 og oppdage COVID-19 fra kliniske prøver. Forskning på utvikling av nye diagnostiske teknikker for COVID-19 ved bruk av kliniske prøver er også godkjent av den etiske komiteen ved Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).
1. Arbeidsflyt for prøvebehandling (figur 1A)
<p...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Få ressurser er tilgjengelige for hvordan man utvikler RT-ddPCR-analyser for SARS-CoV-2-deteksjon. Selv om det ikke brukes i denne artikkelen, kan standardprøver med kjente kopier brukes til å utvikle og optimalisere analyser. I dette arbeidet ble imidlertid SARS-CoV-2-prøver dyrket i Vero-E6-celler pigget i en bakgrunn av humant genomisk RNA og brukt som standardprøver for å utvikle analysene. Riktig primer- og sondesekvenser er avgjørende når du utvikler analyser. Siden det meste av forarbeidet på SARS-CoV-2 R...

Polymerasekjedereaksjon (PCR), en anerkjent teknikk, har gjennomgått flere transformasjoner siden adventen for å bli en kraftig teknikk som er i stand til å gi svar på nukleinsyreforskning. Disse transformasjonene har vært en konstant forbedring av den gamle teknikken. Disse transformasjonene kan oppsummeres i tre generasjoner1. Den første generasjonen er konvensjonell PCR som er avhengig av gelelektroforese for å kvantifisere og oppdage forsterkede mål. Den andre generasjonen er kvantitativ sanntids-PCR (qPCR) som kan oppdage prøver i sanntid og stole på en standardkurve for direkte kvantifisering av mål i en prøve. Den tredje generasjonen, digital PCR (dPCR), kan utføre både deteksjon og absolutt kvantifisering av nukleinsyremål uten behov for en standardkurve. dPCR har også blitt forbedret ytterligere fra reaksjonskamre som separeres av brønnene i en vegg til emulsjoner av olje, vann og stabiliserende kjemikalier i samme brønn som sett i dråpebasert digital PCR2. I dråpedigital PCR (ddPCR) deles en prøve inn i tusenvis av dråper i nanoliterstørrelse som inneholder individuelle mål som senere skal kvantifiseres ved hjelp av Poisson-statistikk 2,3,4. Denne teknikken gir ddPCR en fordel i å kvantifisere mål med lav rikelig sammenlignet med de andre generasjonene av PCR.
Nylig har flere applikasjoner fremhevet overlegenheten til ddPCR over den ofte brukte qPCR når man oppdager og kvantifiserer mål med lav mengde 1,5,6. SARS-CoV-2 er intet unntak fra disse applikasjonene 7,8,9,10,11,12. Siden utbruddet av SARS-CoV-2 har forskere jobbet på alle fronter for å komme opp med løsninger på hvordan man diagnostiserer viruset og oppdager det effektivt. Den nåværende gullstandarden gjenstår fortsatt å være qPCR13. Imidlertid har RT-ddPCR vist seg å være mer nøyaktig når det gjelder å oppdage lave mengder SARS-CoV-2-mål fra både miljømessige og kliniske prøver sammenlignet med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De fleste av SARS-CoV-2 ddPCR-publiserte verk er avhengige av simplex-analyser med multipleksene, avhengig av kommersielle analyser. Derfor bør mer gjøres for å forklare hvordan man utvikler multiplekse RT-dPCR-analyser for SARS-CoV-2-deteksjon.
I en riktig analysedesign kan multipleksing brukes til å spare kostnader, øke prøvegjennomstrømningen og maksimere antall mål som kan oppdages følsomt i en liten prøve. Ved multipleksing med ddPCR må man ta hensyn til hvor mange fluoroforer som kan detekteres i et bestemt system. Noen ddPCR-plattformer kan støtte opptil tre kanaler, mens andre bare støtter to kanaler. Derfor, når multipleksing med to kanaler, må man bruke forskjellige tilnærminger, inkludert høyere ordens multipleksing for å oppdage mer enn to mål14,15,16. I dette arbeidet brukes et tofarget ddPCR-deteksjonssystem for å vise trinn for hvordan man utvikler forskjellige SARS-CoV-2 RT-ddPCR-analyser som kan tilpasses for forskjellige forskningsapplikasjoner.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

Diagnostisering av den pågående SARS-CoV-2-pandemien er en prioritet for alle land over hele verden. For tiden er revers transkripsjon kvantitativ PCR (RT-qPCR) gullstandarden for SARS-CoV-2-diagnose, da ingen permanent løsning er tilgjengelig. Uansett hvor effektiv denne teknikken kan være, har det kommet forskning som viser sine begrensninger i deteksjon og diagnose, spesielt når det gjelder lave rikelige mål. I motsetning til dette har dråpe digital PCR (ddPCR), en nylig fremvoksende teknologi med overlegne fordeler i forhold til qPCR, vist seg å overvinne utfordringene med RT-qPCR i diagnostisering av SARS-CoV-2 fra lave rikelig målprøver. Prospektivt, i denne artikkelen, utvides mulighetene til RT-ddPCR ytterligere ved å vise trinn for hvordan du utvikler simplex, duplex, triplex probe mix og quadruplex analyser ved hjelp av et tofargedeteksjonssystem. Ved å bruke primere og prober rettet mot spesifikke steder i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 og RBD2), er utviklingen av disse analysene vist å være mulig. I tillegg gis detaljerte protokoller, notater og forslag til hvordan du kan forbedre analysearbeidsflyten og analysere data. Tilpasning av denne arbeidsflyten i fremtidige arbeider vil sikre at maksimalt antall mål kan oppdages følsomt i et lite utvalg, noe som forbedrer kostnadene og prøvegjennomstrømningen betydelig.

I en proof-of-concept-studie ble multiplex-analysens analytiske ytelse testet på kliniske prøver og forskningsprøver19. Ytelsen til multipleksanalysene var bedre enn for en RT-PCR19. Siden lavt antall dråper kan indikere et problem under dråpegenerering, ble det i denne artikkelen satt en grenseverdi på 10 000 dråper per brønn basert på empiriske data.
En god separasjon mellom positive og negative dråper med minimal regninterferens kan ...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Dette arbeidet oppsummerer trinn for å utvikle forskjellige analyser for SARS-CoV-2-deteksjon ved hjelp av et tofarget ddPCR-system. Trinnene er forseggjorte og notater er inkludert om hvordan du kan forbedre analysene og eksperimentytelsen. Disse analysene kan brukes til flere SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikasjoner.

To-trinns omvendt transkripsjon dråpe digitale PCR-protokoller for SARS-CoV-2 deteksjon og kvantifisering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Disse protokollene kan brukes til å utvikle interne multiplex ddPCR-analyser for påvisning av SARS-CoV-2 ved bruk av et tofarget ddPCR-system. Dette er nyttig for folk som ønsker å utvikle sine egne sett for påvisning av SARS-CoV-2 og andre patogener. Sammenlignet med gullstandarden RT-qPCR, kan RT-ddPCR brukes til å kvantifisere flere SARS-CoV-2-gener uten behov for en standardkurve.Siden ddPCR er en fremvoksende teknikk, er visuell demonstrasjon viktig for å hjelpe nåværende og fremtidige brukere til å forstå og enkelt utvikle multipleksanalyser for SARS-CoV-2-deteksjon og andre patogener. For cDNA-syntese, tilsett to mikroliter 5X omvendt transkripsjonsmasterblanding, fem mikroliter av RNA-prøven av interesse og tre mikroliter RNase-fritt dobbeltdestillert vann i et 100 eller 200 mikroliter PCR-rør til et endelig volum på 10 mikroliter som løsning, og legg røret på is. Når reagensene er tilsatt, legg prøven inn i en termisk syklist og sett instrumentet til å kjøre en revers transkripsjon ved 37 grader Celsius i 15 minutter, en varmeinaktivering av reverstranskripsjonen i 5 sekunder ved 85 grader Celsius, og et endelig uendelig hold ved fire grader Celsius.Før du utfører dråpe digital PCR, tilsett 19,8 mikroliter nytilberedt masterblanding til riktig antall brønner i en nukleasefri 96-brønns dråpe digital PCR-plate. Tilsett 2,2 mikroliter cDNA til hver brønn av masterblanding til et endelig volum på 22 mikroliter reaksjonsblanding per brønn og forsegle platen med en engangs PCR-plateforsegler. Deretter virvler du platen i 15 til 30 sekunder i sentrifuge i 10 til 15 sekunder for å samle brønninnholdet i bunnen av platen.For automatisk dråpegenerering på den automatiserte berøringsskjermen for dråpegeneratoren, klikk på konfigurer prøveplate og velg kolonnene der prøvene er plassert på prøveplate. Klikk ok og åpne den automatiserte dråpegeneratordøren. Legg prøve- og dråpegenereringsplatene og de andre materialene som er nødvendige for eksperimentet, på de respektive stedene i instrumentet og lukk døren.Når berøringsskjermen blir grønn, noe som indikerer at alle materialene er lastet inn i riktig posisjon, velger du olje for sonder og starter dråpegenerering. Vent til dråpegenereringen er fullført i henhold til tiden som er angitt på skjermen. Når skjermen sier Dråper klare, åpne døren for å fjerne platen som inneholder dråpene og bruk en plateforsegler i fem sekunder ved 180 grader Celsius for å forsegle platen med en gjennomtrengelig folieforsegling.Innen 30 minutter etter dråpegenereringen, plasser den forseglede dråpeplaten i en 96 dyp brønn termisk syklist. Sett prøvevolumet til 40 mikroliter og lokktemperaturen til 105 grader Celsius. Deretter forsterker PCR dråpene.For dråpeavlesning, etter forsterkningen, overfør den termiske syklede 96-brønnsplaten til en dråpeleser og åpne den medfølgende programvaren på en datamaskin som er koblet til dråpeleseren. Fra oppsettmodus velger du Ny og dobbeltklikker på en hvilken som helst brønn for å åpne dialogboksen brønnredigeringsprogram. Velg brønnene som skal leses og sett eksperiment til absolutt kvantifisering, supermix til dråpe digital PCR supermix for prober.Målrett mot én type til ukjent kanal 1, og målrett mot to, type til ukjent kanal 2. Tilordne eksempelnavnene basert på plateoppsettet, og klikk Bruk og ok. Når du har lagret malen, klikker du Kjør.Når du blir bedt om det av programvaren, velger du FAM / HEX-fargen. På slutten av datainnsamlingen, fjern platen fra leseren. Før du analyserer dataene, må du kontrollere dataene fra alle brønnene for å få totalt antall dråper.Og sett en grense for å godta et minimum antall dråper som skal telles som positive eller negative resultater. For simpleks og tosidig analyseanalyse, dobbeltklikk på QLP-filen som skal analyseres og velg Analyser. Bruk terskelverktøyene 1D-amplitude og 2D-amplitude til å skille mellom de positive og negative dråpene for hver brønn i riktig kanal, ved å bruke nodemalkontrollen og positive kontrollprøver som veiledning.Deretter eksporterer du resultatene som en CSV-fil for ytterligere analyse. For en triplex-sondemiksanalyse åpner du QLP-filen og velger brønnene som skal analyseres, i plateredigeringsfanen. Sett eksperimenttypen til direkte kvantifisering og analysen for å undersøke mix triplex, og skriv inn målnavnet.Klikk deretter på Bruk. Bruk diagramverktøyene til å tilordne bestemte farger til forskjellige målgrupper, som anvist av popup-forslagene for velg for å tilordne klyngevindu. Når alle målfargene er tilordnet, vises kvantifiseringsdataene i brønndatavinduet.Eksporter dataene som en CSV-fil for nedstrømsanalyse. For en quadruplex-analyse, sett eksperimenttypen til direkte kvantifisering og analysen til amplitudemultipleks. Skriv inn målnavnet og klikk på Bruk.Bruk diagramverktøyene til å tilordne bestemte farger til forskjellige målgrupper, som anvist av popup-forslagene for velg for å tilordne klyngevindu. Når alle målfargene er tilordnet, vises kvantifiseringsdataene i brønndatavinduet. Eksporter dataene som en CSV-fil for ytterligere analyse.Som observert i denne representative temperaturgradientanalysen, kunne høyere knelende temperaturer ikke tydelig skille positive dråper fra negative dråper når en tosidig analyse ble kjørt. Imidlertid, med en reduksjon i knestående temperatur, ble det oppnådd en optimal separasjon mellom positive og negative dråper. Ved å bruke et tofarget RT-dråpe digitalt PCR-deteksjonssystem, er det mulig å oppdage ett, to, tre og fire SARS-CoV-2-mål i en enkelt prøve.En prøve uten malkontroll kan brukes til å finne negative dråper for å bidra til å angi den negative terskelen i simpleksanalyser. I dupleksanalyser kan analysen utføres i individuelle kanaler eller i 2D-amplituden. Selv om dataanalyse av multipleksanalyser av høyere orden ikke er enkle, er disse analysene nyttige, fordi de tillater opptil åtte dråpeklynger å bli vurdert i triplex sondeblandingsanalyser og opptil 16 dråpeklynger for quadruplex amplitude-baserte analyser.Avhengig av analysen som skal utvikles, må du sørge for at riktig målprimer og sondekonsentrasjoner legges til masterblandingen. Ved hjelp av denne prosedyren kan man veksle mellom målene for å utvikle nye RT-ddPCR-analyser. Disse analysene kan brukes til ulike forskningsformål eller for diagnostisering av nye smittsomme sykdommer.Siden utviklingen har denne teknikken blitt brukt til nøyaktig bestemmelse av virale nukleinsyrekopier i forskjellige standarder, menneskekroppen og miljøprøver.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering av humane hepatocytter av en to-trinns Collage Perfusjons Prosedyre

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Ansette Digital Droplet PCR å oppdage BRAF V600E Mutasjoner i formalinfiksert parafininnstøpte Reference Standard cellelinjer

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolutt kvantifisering av Plasma MicroRNA i Cynomolgus aper, ved hjelp av kvantitative sanntid omvendt transkripsjon PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Bakterieflora analyse ved hjelp av to-trinns PCR og neste generasjons 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

En to-trinns strategi som kombinerer epigenetisk modifikasjon og biomekaniske signaler for å generere pattedyr pluripotente celler

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing the Urban Environment - En rørledning for prøvetaking og påvisning av SARS-CoV-2 fra miljøreservoarer

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Konfektavbildning av Quantum Dot-Konjugert SARS-CoV-2 spike trimers for å spore binding og endokytose i HEK293T-celler

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Kvantifisering av sirkulære RNA ved bruk av Digital Droplet PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...