Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Esta pesquisa foi financiada pelo Megaprojeto de Controle de Doenças Infecciosas do Ministério da Saúde da China, número de concessão 2017ZX10302301-005 e Centro de Pesquisa Conjunta Sino-África, número de concessão SAJC201605.

Declaração ética O Instituto de Virologia de Wuhan (WHIOV) está entre os laboratórios e institutos aprovados pelo CDC da China da cidade de Wuhan para conduzir pesquisas sobre o SARS-CoV-2 e detectar COVID-19 a partir de amostras clínicas. A pesquisa sobre o desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico para COVID-19 usando amostras clínicas também foi aprovada pelo comitê de ética do Instituto de Virologia de Wuhan (2020FCA001).
1. Fluxo de trabalho de process...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Poucos recursos estão disponíveis sobre como desenvolver ensaios RT-ddPCR para detecção de SARS-CoV-2. Embora não sejam usadas neste artigo, amostras padrão com cópias conhecidas podem ser usadas para desenvolver e otimizar ensaios. Neste trabalho, no entanto, as amostras de SARS-CoV-2 cultivadas em pilhas Vero-E6 foram cravadas em um fundo do RNA genomic humano e usadas como amostras padrão para desenvolver os ensaios. Sequências adequadas de primers e sondas são essenciais no desenvolvimento de ensaios. Uma v...

A reação em cadeia da polimerase (PCR), uma técnica bem reconhecida, passou por diversas transformações desde seu advento para se tornar uma poderosa técnica capaz de fornecer respostas à pesquisa de ácidos nucleicos. Essas transformações têm sido um constante aprimoramento da antiga técnica. Essas transformações podem ser resumidas em três gerações1. A primeira geração é a PCR convencional que se baseia na eletroforese em gel para quantificar e detectar alvos amplificados. A segunda geração é a PCR quantitativa em tempo real (qPCR) que pode detectar amostras em tempo real e contar com uma curva padrão para quantificar diretamente os alvos em uma amostra. A terceira geração, PCR digital (dPCR), pode realizar tanto a detecção quanto a quantificação absoluta de alvos de ácidos nucleicos sem a necessidade de uma curva padrão. A dPCR também foi melhorada a partir de câmaras de reação sendo separadas pelos poços de uma parede em emulsões de óleo, água e produtos químicos estabilizantes dentro do mesmo poço, como visto na PCR digital baseada em gotículas2. Na PCR digital de gotículas (ddPCR), uma amostra é particionada em milhares de gotículas de tamanho nanolitro contendo alvos individuais que serão posteriormente quantificados usando a estatística de Poisson 2,3,4. Esta técnica confere à ddPCR uma vantagem na quantificação de alvos pouco abundantes quando comparada com as outras gerações de PCR.
Recentemente, múltiplas aplicações têm destacado a superioridade da ddPCR sobre a qPCR comumente usada na detecção e quantificação de alvos pouco abundantes 1,5,6. O SARS-CoV-2 não é exceção a essas aplicações 7,8,9,10,11,12. Desde o surto do SARS-CoV-2, os cientistas têm trabalhado em todas as frentes para encontrar soluções sobre como diagnosticar o vírus e detectá-lo de forma eficiente. O padrão-ouro atual ainda continua sendo o qPCR13. No entanto, o RT-ddPCR mostrou-se mais preciso na detecção de alvos SARS-CoV-2 pouco abundantes de amostras ambientais e clínicas quando comparado ao RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. A maioria dos trabalhos publicados sobre o ddPCR SARS-CoV-2 depende de ensaios simplex com os multiplex, dependendo dos ensaios comerciais. Portanto, mais deve ser feito para explicar como desenvolver ensaios multiplex RT-dPCR para detecção de SARS-CoV-2.
Em um projeto de ensaio adequado, a multiplexação pode ser usada para economizar custos, aumentar a taxa de transferência da amostra e maximizar o número de alvos que podem ser detectados sensivelmente em uma pequena amostra. Ao multiplexar com ddPCR, deve-se levar em conta quantos fluoróforos podem ser detectados em um determinado sistema. Algumas plataformas ddPCR podem suportar até três canais, enquanto outras suportam apenas dois canais. Assim, na multiplexação com dois canais, deve-se utilizar diferentes abordagens, incluindo a multiplexação de ordem superior para detectar mais de dois alvos14,15,16. Neste trabalho, um sistema de detecção ddPCR de duas cores é usado para mostrar etapas sobre como desenvolver diferentes ensaios de RT-ddPCR de SARS-CoV-2 que podem ser adaptados para diferentes aplicações de pesquisa.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

O diagnóstico da pandemia SARS-CoV-2 em curso é uma prioridade para todos os países em todo o mundo. Atualmente, o PCR quantitativo de transcrição reversa (RT-qPCR) é o padrão ouro para o diagnóstico de SARS-CoV-2, pois nenhuma solução permanente está disponível. Por mais eficaz que essa técnica possa ser, pesquisas têm surgido mostrando suas limitações na detecção e diagnóstico, principalmente quando se trata de alvos pouco abundantes. Em contraste, o PCR digital de gotículas (ddPCR), uma tecnologia emergente recente com vantagens superiores sobre o qPCR, mostrou superar os desafios do RT-qPCR no diagnóstico de SARS-CoV-2 a partir de amostras alvo pouco abundantes. Prospectivamente, neste artigo, os recursos do RT-ddPCR são expandidos ainda mais, mostrando etapas sobre como desenvolver ensaios simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex usando um sistema de detecção de duas cores. Usando primers e sondas que visam locais específicos do genoma do SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 e RBD2), o desenvolvimento destes ensaios mostra-se possível. Além disso, protocolos detalhados passo a passo, notas e sugestões sobre como melhorar o fluxo de trabalho de ensaios e analisar dados são fornecidos. A adaptação desse fluxo de trabalho em trabalhos futuros garantirá que o número máximo de destinos possa ser detectado de forma sensível em uma pequena amostra, melhorando significativamente o custo e a taxa de transferência da amostra.

Em um estudo de prova de conceito, o desempenho analítico dos ensaios multiplex foi testado em amostras clínicas e de pesquisa19. O desempenho dos ensaios multiplex foi superior ao de um RT-PCR19. Como um baixo número de gotículas pode indicar um problema durante a geração de gotículas, neste artigo um ponto de corte de 10.000 gotículas por poço foi definido com base em dados empíricos.
Uma boa separação entre gotículas positivas e n...

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Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Este trabalho resume as etapas no desenvolvimento de ensaios diferentes para a detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. As etapas são elaboradas e notas foram incluídas sobre como melhorar os ensaios e o desempenho do experimento. Estes ensaios podem ser usados para aplicações SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Protocolos digitais de PCR digital de gotícula de transcrição reversa em duas etapas para detecção e quantificação de SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Esses protocolos podem ser usados para desenvolver ensaios internos de ddPCR multiplex para detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. Isso é útil para pessoas que querem desenvolver seus próprios kits para a detecção de SARS-CoV-2 e outros patógenos. Em comparação com o RT-qPCR padrão-ouro, o RT-ddPCR pode ser usado para quantificar vários genes SARS-CoV-2 sem a necessidade de uma curva padrão.Uma vez que o ddPCR é uma técnica emergente, a demonstração visual é importante para ajudar os usuários atuais e futuros a entender e desenvolver facilmente ensaios multiplex para detecção de SARS-CoV-2 e outros patógenos. Para a síntese de cDNA, adicione dois microlitros de mistura mestre de transcrição reversa 5X, cinco microlitros da amostra de RNA de interesse e três microlitros de água bidestilada livre de RNase em um tubo de PCR de 100 ou 200 microlitros para um volume final de 10 microlitros como solução e coloque o tubo sobre gelo. Quando os reagentes tiverem sido adicionados, carregue a amostra em um termociclador e ajuste o instrumento para executar uma transcrição reversa a 37 graus Celsius por 15 minutos, uma inativação de calor da transcrição reversa por 5 segundos a 85 graus Celsius e uma retenção infinita final a quatro graus Celsius.Antes de realizar a PCR digital de gotículas, adicione 19,8 microlitros de mistura mestre recém-preparada ao número apropriado de poços de uma placa de PCR digital de gotículas de 96 poços livre de nucleases. Adicione 2,2 microlitros de cDNA a cada poço de mistura mestra para um volume final de 22 microlitros de mistura de reação por poço e sele a placa com um selador de placa de PCR descartável. Em seguida, agite a placa por 15 a 30 segundos em centrífuga por 10 a 15 segundos para coletar o conteúdo do poço no fundo da placa.Para a geração automatizada de gotículas na tela sensível ao toque do gerador de gotículas automatizado, clique em configurar a placa de amostra e selecione as colunas nas quais as amostras estão localizadas na placa de amostra. Clique em OK e abra a porta do gerador de gotículas automatizado. Coloque as placas geradoras de amostras e gotículas e os demais materiais necessários para o experimento nos respectivos locais dentro do instrumento e feche a porta.Quando a tela sensível ao toque ficar verde, indicando que todos os materiais foram carregados em suas posições corretas, selecione o óleo para as sondas e inicie a geração de gotículas. Aguarde a geração da gotícula ser concluída de acordo com o tempo indicado na tela. Quando a tela disser Gotículas prontas, abra a porta para remover a placa que contém as gotículas e use um selador de placa por cinco segundos a 180 graus Celsius para selar a placa com um selo de folha perfurável.Dentro de 30 minutos após a geração da gotícula, coloque a placa de gotícula selada em um termociclador de poço profundo de 96 anos. Ajuste o volume da amostra para 40 microlitros e a temperatura da tampa para 105 graus Celsius. Em seguida, a PCR amplifica as gotículas.Para a leitura das gotículas, após a amplificação, transfira a placa termociclada de 96 poços para um leitor de gotículas e abra o software que a acompanha em um computador conectado ao leitor de gotículas. No modo de configuração, selecione Novo e clique duas vezes em qualquer poço para abrir a caixa de diálogo do editor de poços. Selecione os poços a serem lidos e defina o experimento para quantificação absoluta, supermix para supermix de PCR digital para sondas.Direcione um tipo para o canal 1 desconhecido e direcione dois tipos para o canal 2 desconhecido. Atribua os nomes de exemplo com base no layout da chapa e clique em aplicar e ok. Depois de salvar o modelo, clique em Executar.Quando solicitado pelo software, selecione a cor FAM/HEX. Ao final da aquisição de dados, remova a placa do leitor. Antes de analisar os dados, verifique os dados de todos os poços para obter o número total de gotículas.E defina um ponto de corte para aceitar um número mínimo de gotículas a serem contadas como resultados positivos ou negativos. Para análise de ensaios simplex e duplex, clique duas vezes no arquivo QLP a ser analisado e selecione Analisar. Use as ferramentas de amplitude 1D e limiar de amplitude 2D para distinguir entre as gotículas positivas e negativas para cada poço no canal correto, usando o controle de modelo de nó e amostras de controle positivo como guia.Em seguida, exporte os resultados como um arquivo CSV para análise adicional. Para um ensaio de mistura de sonda triplex, abra o arquivo QLP e selecione os poços a serem analisados na guia editor de placas. Defina o tipo de experimento para quantificação direta e o ensaio para sonda mistura triplex, e insira o nome do destino.Em seguida, clique em Aplicar. Use as ferramentas de gráfico para atribuir cores específicas a diferentes clusters de destino, conforme indicado pela seleção para atribuir sugestões pop-up de janela de cluster. Quando todas as cores de destino tiverem sido atribuídas, os dados de quantificação serão exibidos na janela de dados do poço.Exporte os dados como um arquivo CSV para análise downstream. Para um ensaio quadruplex definir o tipo de experimento para quantificação direta e o ensaio para amplitude multiplex. Insira o nome do destino e clique em Aplicar.Use as ferramentas de gráfico para atribuir cores específicas a diferentes clusters de destino, conforme indicado pela seleção para atribuir sugestões pop-up de janela de cluster. Quando todas as cores de destino tiverem sido atribuídas, os dados de quantificação serão exibidos na janela de dados do poço. Exporte os dados como um arquivo CSV para análise adicional.Como observado nesta análise de gradiente de temperatura representativo, temperaturas mais altas de ajoelhamento não foram capazes de distinguir claramente gotículas positivas de gotículas negativas quando um ensaio duplex foi executado. No entanto, com a diminuição da temperatura de ajoelhamento, obteve-se uma separação ótima entre gotículas positivas e negativas. Usando um sistema de detecção digital de PCR de gotículas RT de duas cores, é possível detectar um, dois, três e quatro alvos do SARS-CoV-2 em uma única amostra.Uma amostra de controle sem modelo pode ser usada para localizar gotículas negativas para ajudar a definir o limiar negativo em ensaios simplex. Em ensaios duplex, a análise pode ser realizada em canais individuais ou na amplitude 2D. Embora a análise de dados de ensaios multiplex de ordem superior não seja simples, esses ensaios são úteis, pois permitem que até oito grupos de gotículas sejam avaliados em ensaios de mistura de sonda triplex e até 16 clusters de gotículas para ensaios baseados em amplitude quádrupla.Dependendo do ensaio a ser desenvolvido, certifique-se de que as concentrações corretas do primer alvo e da sonda sejam adicionadas à mistura mestre. Usando este procedimento, pode-se alternar os alvos para desenvolver novos ensaios RT-ddPCR. Estes ensaios podem ser usados para diferentes propósitos de pesquisa ou para o diagnóstico de doenças infecciosas emergentes.Desde o seu desenvolvimento, esta técnica tem sido utilizada para a determinação precisa de cópias de ácidos nucleicos virais em diferentes padrões, no corpo humano e em amostras ambientais.

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