Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Это исследование было профинансировано Мегапроектом по борьбе с инфекционными заболеваниями Министерства здравоохранения Китая, номер гранта 2017ZX10302301-005 и Китайско-африканским совместным исследовательским центром, номер гранта SAJC201605.

Этическое заявление Уханьский институт вирусологии (WHIOV) входит в число лабораторий и институтов, одобренных Китайским центром по контролю и профилактике заболеваний города Ухань для проведения исследований SARS-CoV-2 и выявления COVID-19 в клинических образцах. Исследования по ра?...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Существует мало ресурсов о том, как разрабатывать анализы RT-ddPCR для обнаружения SARS-CoV-2. Хотя стандартные образцы с известными копиями не используются в этой статье, они могут быть использованы для разработки и оптимизации анализов. Однако в этой работе образцы SARS-CoV-2, выращенные в клетка?...

Полимеразная цепная реакция (ПЦР), хорошо известная методика, с момента своего появления претерпела несколько трансформаций и стала мощным методом, способным дать ответы на исследования нуклеиновых кислот. Эти преобразования были постоянным совершенствованием старой техники. Эти преобразования можно свести к тремпоколениям1. Первое поколение - это обычная ПЦР, которая основана на гель-электрофорезе для количественной оценки и обнаружения амплифицированных мишеней. Второе поколение — это количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР), которая может обнаруживать образцы в режиме реального времени и полагаться на стандартную кривую для прямого количественного определения целей в образце. Третье поколение, цифровая ПЦР (дПЦР), может выполнять как обнаружение, так и абсолютное количественное определение мишеней нуклеиновых кислот без необходимости стандартной кривой. дПЦР также была усовершенствована за счет того, что реакционные камеры были разделены скважинами стенки на эмульсии нефти, воды и стабилизирующих химических веществ в той же лунке, что и при цифровой ПЦР2 на основе капель. При капельной цифровой ПЦР (ddPCR) образец разбивается на тысячи капель нанолитрового размера, содержащих отдельные мишени, которые позже будут количественно определены с использованием статистики Пуассона 2,3,4. Этот метод дает ddPCR преимущество в количественной оценке малораспространенных мишеней по сравнению с другими поколениями ПЦР.
В последнее время во многих приложениях подчеркивается превосходство ddPCR над широко используемой qPCR при обнаружении и количественной оценке малораспространенных мишеней 1,5,6. SARS-CoV-2 не является исключением из этих приложений 7,8,9,10,11,12. С момента вспышки SARS-CoV-2 ученые работали на всех фронтах, чтобы найти решения о том, как диагностировать вирус и эффективно его обнаруживать. Нынешним золотым стандартом по-прежнему остается qPCR13. Однако было показано, что ОТ-дПЦР более точна при обнаружении малораспространенных мишеней SARS-CoV-2 как из экологических, так и из клинических образцов по сравнению с ОТ-кПЦР 7,8,9,10,11,12. Большинство опубликованных работ по ddPCR SARS-CoV-2 основаны на симплексных анализах, а мультиплексные - на коммерческих анализах. Следовательно, необходимо сделать больше, чтобы объяснить, как разрабатывать мультиплексные анализы ОТ-дПЦР для обнаружения SARS-CoV-2.
При правильном дизайне анализа мультиплексирование может быть использовано для экономии затрат, увеличения пропускной способности образца и максимизации количества мишеней, которые могут быть чувствительно обнаружены в небольшом образце. При мультиплексировании с помощью ddPCR необходимо учитывать, сколько флуорофоров может быть обнаружено в конкретной системе. Некоторые платформы ddPCR могут поддерживать до трех каналов, в то время как другие поддерживают только два канала. Следовательно, при мультиплексировании с двумя каналами приходится использовать разные подходы, в том числе мультиплексирование более высокого порядка для обнаружения более двух целей14,15,16. В этой работе двухцветная система обнаружения ddPCR используется для демонстрации шагов по разработке различных анализов SARS-CoV-2 RT-ddPCR, которые можно адаптировать для различных исследовательских приложений.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

Диагностика продолжающейся пандемии SARS-CoV-2 является приоритетом для всех стран мира. В настоящее время количественная ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-кПЦР) является золотым стандартом диагностики SARS-CoV-2, поскольку постоянного решения нет. Каким бы эффективным ни был этот метод, появились исследования, показывающие его ограничения в обнаружении и диагностике, особенно когда речь идет о малораспространенных мишенях. Напротив, было показано, что капельная цифровая ПЦР (ddPCR), недавно появившаяся технология с превосходными преимуществами по сравнению с кПЦР, преодолевает проблемы ОТ-кПЦР в диагностике SARS-CoV-2 из малораспространенных целевых образцов. В перспективе в этой статье возможности ОТ-дПЦР еще больше расширяются за счет демонстрации шагов по разработке симплексных, дуплексных, триплексных зондовых смесей и квадруплексных анализов с использованием двухцветной системы детектирования. Показано, что разработка этих анализов возможна с использованием праймеров и зондов, нацеленных на определенные участки генома SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 и RBD2). Кроме того, предоставляются пошаговые подробные протоколы, примечания и предложения о том, как улучшить рабочий процесс анализа и анализа данных. Адаптация этого рабочего процесса в будущих работах обеспечит возможность чувствительного обнаружения максимального количества целей в небольшой выборке, что значительно снизит стоимость и пропускную способность выборки.

В экспериментальном исследовании аналитическая эффективность мультиплексных анализов была протестирована на клинических и исследовательских образцах19. Эффективность мультиплексных анализов была выше, чем у ОТ-ПЦР19. Поскольку низкое количество капель може...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

В этой работе обобщены шаги по разработке различных анализов для обнаружения SARS-CoV-2 с использованием двухцветной системы ddPCR. Шаги проработаны, и были включены примечания о том, как улучшить анализы и результаты экспериментов. Эти анализы могут использоваться для нескольких приложений SARS-CoV-2 RT-ddPCR.

Двухэтапные протоколы капельной цифровой ПЦР с обратной транскрипцией для обнаружения и количественного определения SARS-CoV-2

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Эти протоколы могут быть использованы для разработки собственных мультиплексных анализов ddPCR для обнаружения SARS-CoV-2 с использованием двухцветной системы ddPCR. Это полезно для людей, которые хотят разработать собственные наборы для обнаружения SARS-CoV-2 и других патогенов. По сравнению с золотым стандартом ОТ-кПЦР, ОТ-дПЦР можно использовать для количественной оценки нескольких генов SARS-CoV-2 без необходимости стандартной кривой.Поскольку ddPCR является новым методом, визуальная демонстрация важна для того, чтобы помочь нынешним и будущим пользователям понять и легко разработать мультиплексные анализы для обнаружения SARS-CoV-2 и других патогенов. Для синтеза кДНК добавьте два микролитра 5-кратной смеси обратной транскрипции, пять микролитров интересующего образца РНК и три микролитра двойной дистиллированной воды без РНКазы в пробирку для ПЦР объемом 100 или 200 микролитров до конечного объема 10 микролитров в виде раствора и поместите пробирку на лед. Когда реагенты будут добавлены, загрузите образец в термоциклер и настройте прибор на обратную транскрипцию при 37 градусах Цельсия в течение 15 минут, тепловую инактивацию обратной транскрипции в течение 5 секунд при 85 градусах Цельсия и окончательное бесконечное удержание при четырех градусах Цельсия.Перед проведением капельной цифровой ПЦР добавьте 19,8 микролитра свежеприготовленной мастер-смеси в соответствующее количество лунок 96-луночной планшета для цифровой ПЦР-диагностики без нуклеаз. Добавьте 2,2 микролитра кДНК в каждую лунку мастер-смеси до конечного объема 22 микролитра реакционной смеси на лунку и запечатайте пластину одноразовым запайщиком пластин для ПЦР. Затем встряхните пластину в течение 15-30 секунд в центрифуге в течение 10-15 секунд, чтобы собрать содержимое лунки на дне пластины.Для автоматической генерации капель на сенсорном экране автоматического генератора капель нажмите «Настроить пластину для образцов» и выберите столбцы, в которых образцы расположены на пластине для образцов. Нажмите «ОК» и откройте дверцу автоматического генератора капель. Загрузите пластины для генерации образцов и капель и другие материалы, необходимые для эксперимента, в соответствующие места внутри прибора и закройте дверцу.Когда сенсорный экран загорится зеленым цветом, указывая на то, что все материалы были загружены в правильное положение, выберите масло для зондов и начните генерацию капель. Дождитесь завершения генерации капель в соответствии со временем, указанным на экране. Когда на экране появится сообщение «Капли готовы», откройте дверцу, чтобы удалить пластину, содержащую капли, и используйте запайщик пластин в течение пяти секунд при температуре 180 градусов Цельсия, чтобы запечатать пластину с помощью прокалываемой фольги.В течение 30 минут после образования капель поместите герметичную пластину для капель в термоциклер глубиной 96 скважин. Установите объем образца на 40 микролитров и температуру крышки на 105 градусов Цельсия. Затем ПЦР амплифицирует капли.Для считывания показаний капель после усиления перенесите термоциклированную 96-луночную пластину в считыватель капель и откройте сопутствующее программное обеспечение на компьютере, подключенном к считывателю капель. В режиме настройки выберите «Создать» и дважды щелкните любую скважину, чтобы открыть диалоговое окно редактора скважины. Выберите лунки для считывания и установите эксперимент на абсолютное количественное определение, супермикс на капельную цифровую ПЦР-суперсмесь для зондов.Нацеливайте один тип на канал 1 неизвестный, а два типа — на канал 2 неизвестный. Назначьте имена образцов на основе макета пластины, нажмите «Применить» и «ОК». После сохранения шаблона нажмите кнопку Выполнить.По запросу программного обеспечения выберите цвет FAM/HEX. По окончании сбора данных снимите пластину со считывателя. Прежде чем анализировать данные, проверьте данные со всех скважин, чтобы получить общее количество капель.И установите пороговое значение, чтобы принять минимальное количество капель, которые будут считаться положительными или отрицательными результатами. Для симплексного и дуплексного анализа дважды щелкните файл QLP, который нужно проанализировать, и выберите «Анализировать». Используйте инструменты 1D-амплитуды и 2D-амплитудного порога, чтобы различать положительные и отрицательные капли для каждой скважины в правильном канале, используя в качестве ориентира контрольные образцы шаблона узла и положительные контрольные образцы.Затем экспортируйте результаты в виде CSV-файла для дополнительного анализа. Для анализа смеси триплексных зондов откройте файл QLP и выберите скважины для анализа на вкладке редактора пластин. Задайте тип эксперимента на прямое количественное определение, а анализ на триплекс смеси зонда и введите имя цели.Затем нажмите «Применить». Используйте инструменты построения графиков, чтобы назначить определенные цвета различным целевым кластерам в соответствии с предложениями всплывающего окна выбора для назначения кластера. Когда все целевые цвета будут назначены, данные количественного определения будут отображаться в окне данных скважины.Экспортируйте данные в виде CSV-файла для последующего анализа. Для квадруплексного анализа установите тип эксперимента на прямое количественное определение, а анализ — на амплитудный мультиплекс. Введите целевое имя и нажмите кнопку Применить.Используйте инструменты построения графиков, чтобы назначить определенные цвета различным целевым кластерам в соответствии с предложениями всплывающего окна выбора для назначения кластера. Когда все целевые цвета будут назначены, данные количественного определения будут отображаться в окне данных скважины. Экспортируйте данные в виде CSV-файла для дополнительного анализа.Как было отмечено в этом репрезентативном анализе температурного градиента, более высокие температуры колена не могли четко отличить положительные капли от отрицательных при проведении дуплексного анализа. Однако при снижении температуры стоя на коленях было достигнуто оптимальное разделение между положительными и отрицательными каплями. Используя двухцветную цифровую систему обнаружения капель RT, можно обнаружить одну, две, три и четыре мишени SARS-CoV-2 в одном образце.Контрольный образец без шаблона можно использовать для обнаружения отрицательных капель, чтобы помочь установить отрицательный порог в симплексных анализах. В дуплексных анализах анализ может выполняться в отдельных каналах или в 2D-амплитуде. Хотя анализ данных мультиплексных анализов более высокого порядка не является простым, эти анализы полезны, поскольку они позволяют оценить до восьми кластеров капель в анализах триплексной зондовой смеси и до 16 кластеров капель для анализов на основе квадруплексной амплитуды.В зависимости от анализа, который будет разработан, убедитесь, что в основную смесь добавлены правильные целевые праймеры и концентрации зонда. Используя эту процедуру, можно чередовать мишени для разработки новых анализов ОТ-дПЦР. Эти анализы могут быть использованы для различных исследовательских целей или для диагностики возникающих инфекционных заболеваний.С момента своего развития этот метод использовался для точного определения копий вирусных нуклеиновых кислот в различных стандартах, организме человека и образцах окружающей среды.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Мультиплекс ПЦР и обратной линии блот гибридизация анализ (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Оптимизированная на основе ПЦР Выявление Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Выделение гепатоцитов человека два-ступенчатой ​​коллагеназы процедуры перфузионный

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Используя цифровой капли ПЦР для обнаружения гена BRAF V600E Мутации в формалине фиксированной в парафин Ссылка на стандарт клеточных линиях

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Абсолютная количественная оценка уровня микроРНК в плазме у обезьян Cynomolgus, используя количественные реального времени обратной транскрипции PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Анализ микробиоты с использованием двухступенчатого ПЦР и секвенирования гена нового поколения 16S rRNA

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Двухэтапная стратегия, которая сочетает эпигенетическую модификацию и биомеханические сигналы для создания плюрипотентных клеток млекопитающих

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Анализ городской среды - трубопровод для отбора проб и обнаружения SARS-CoV-2 из экологических резервуаров

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Высокопроизводительная конфокальная визуализация квантовых точек-конъюгированных пиковых тримеров SARS-CoV-2 для отслеживания связывания и эндоцитоза в клетках HEK293T

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Количественная оценка циркулярных РНК с использованием цифровой капельной ПЦР

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...