Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Denna forskning finansierades av Megaproject of Infectious Disease Control från Kinas hälsovårdsministerium, bidragsnummer 2017ZX10302301-005 och Sino-Africa Joint Research Center, bidragsnummer SAJC201605.

Etiskt uttalande Wuhan Institute of Virology (WHIOV) är bland de laboratorier och institut som godkänts av China CDC i Wuhan stad för att bedriva forskning om SARS-CoV-2 och upptäcka COVID-19 från kliniska prover. Forskning om att utveckla nya diagnostiska tekniker för COVID-19 med hjälp av kliniska prover har också godkänts av den etiska kommittén vid Wuhan Institute of Virology (2020FCA001).
1. Arbetsflöde för provbearbetning (bild 1A</stron...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

Få resurser finns tillgängliga för hur man utvecklar RT-ddPCR-analyser för SARS-CoV-2-detektering. Även om de inte används i den här artikeln kan standardprover med kända kopior användas för att utveckla och optimera analyser. I detta arbete spikades dock SARS-CoV-2-prover odlade i Vero-E6-celler i en bakgrund av humant genomiskt RNA och användes som standardprover för att utveckla analyserna. Korrekta primer- och sondsekvenser är avgörande vid utveckling av analyser. Eftersom det mesta preliminära arbetet...

Polymeraskedjereaktion (PCR), en välkänd teknik, har genomgått flera omvandlingar sedan dess tillkomst för att bli en kraftfull teknik som kan ge svar på nukleinsyraforskning. Dessa omvandlingar har varit en ständig förbättring av den gamla tekniken. Dessa omvandlingar kan sammanfattas i tre generationer1. Den första generationen är konventionell PCR som bygger på gelelektrofores för att kvantifiera och detektera förstärkta mål. Den andra generationen är kvantitativ realtids-PCR (qPCR) som kan detektera prover i realtid och förlita sig på en standardkurva för att direkt kvantifiera mål i ett prov. Den tredje generationen, digital PCR (dPCR), kan utföra både detektion och absolut kvantifiering av nukleinsyramål utan behov av en standardkurva. dPCR har också förbättrats ytterligare från reaktionskammare som separeras av brunnarna i en vägg till emulsioner av olja, vatten och stabiliserande kemikalier inom samma brunn som ses i droppbaserad digital PCR2. I droplet digital PCR (ddPCR) delas ett prov upp i tusentals nanoliterstora droppar som innehåller individuella mål som senare kommer att kvantifieras med hjälp av Poisson-statistik 2,3,4. Denna teknik ger ddPCR en fördel när det gäller att kvantifiera låga rikliga mål jämfört med andra generationer av PCR.
Nyligen har flera applikationer belyst överlägsenheten hos ddPCR jämfört med den vanliga qPCR när man detekterar och kvantifierar låga rikliga mål 1,5,6. SARS-CoV-2 är inget undantag från dessa applikationer 7,8,9,10,11,12. Sedan utbrottet av SARS-CoV-2 har forskare arbetat på alla fronter för att komma fram till lösningar på hur man diagnostiserar viruset och upptäcker det effektivt. Den nuvarande guldstandarden är fortfarande qPCR13. RT-ddPCR har dock visat sig vara mer exakt när det gäller att upptäcka låga rikliga SARS-CoV-2-mål från både miljö- och kliniska prover jämfört med RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. De flesta av SARS-CoV-2 ddPCR-publicerade verk beror på simplexanalyser med multiplexa beroende på kommersiella analyser. Därför bör mer göras för att förklara hur man utvecklar multiplexa RT-dPCR-analyser för SARS-CoV-2-detektion.
I en korrekt analysdesign kan multiplexering användas för att spara kostnader, öka provgenomströmningen och maximera antalet mål som kan detekteras känsligt i ett litet urval. Vid multiplexering med ddPCR måste man ta hänsyn till hur många fluoroforer som kan detekteras i ett visst system. Vissa ddPCR-plattformar kan stödja upp till tre kanaler medan andra bara stöder två kanaler. Därför, när multiplexering med två kanaler, måste man använda olika metoder, inklusive högre ordermultiplexering för att upptäcka mer än två mål14,15,16. I detta arbete används ett tvåfärgs ddPCR-detekteringssystem för att visa steg på hur man utvecklar olika SARS-CoV-2 RT-ddPCR-analyser som kan anpassas för olika forskningsapplikationer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

Diagnos av den pågående SARS-CoV-2-pandemin är en prioritet för alla länder över hela världen. För närvarande är kvantitativ PCR med omvänd transkription (RT-qPCR) guldstandarden för SARS-CoV-2-diagnos eftersom ingen permanent lösning finns tillgänglig. Hur effektiv denna teknik än kan vara, har forskning framkommit som visar dess begränsningar i upptäckt och diagnos, särskilt när det gäller låga rikliga mål. Däremot har droplet digital PCR (ddPCR), en ny framväxande teknik med överlägsna fördelar jämfört med qPCR, visat sig övervinna utmaningarna med RT-qPCR vid diagnos av SARS-CoV-2 från låga rikliga målprover. Prospektivt, i den här artikeln, utökas funktionerna i RT-ddPCR ytterligare genom att visa steg för hur man utvecklar simplex-, duplex-, triplex-sondblandning och quadruplex-analyser med hjälp av ett tvåfärgsdetekteringssystem. Med hjälp av primers och sonder riktade mot specifika platser i SARS-CoV-2-genomet (N, ORF1ab, RPP30 och RBD2) har utvecklingen av dessa analyser visat sig vara möjlig. Dessutom tillhandahålls detaljerade protokoll, anteckningar och förslag på hur man kan förbättra analysarbetsflödet och analysera data. Att anpassa detta arbetsflöde i framtida arbeten kommer att säkerställa att det maximala antalet mål kan identifieras känsligt i ett litet urval, vilket avsevärt förbättrar kostnaden och provgenomströmningen.

I en proof-of-concept-studie testades multiplexanalysernas analytiska prestanda på kliniska och forskningsprover19. Multiplexanalysernas prestanda var överlägsen den för en RT-PCR19. Eftersom ett lågt antal droppar kan indikera ett problem under generering av droppar, fastställdes i denna artikel en cutoff på 10 000 droppar per brunn baserat på empiriska data.
En bra separation mellan positiva och negativa droppar med minimal regnstörnin...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Detta arbete sammanfattar steg för att utveckla olika analyser för SARS-CoV-2-detektering med ett tvåfärgs ddPCR-system. Stegen är detaljerade och anteckningar har inkluderats om hur man förbättrar analyserna och experimentprestandan. Dessa analyser kan användas för flera SARS-CoV-2 RT-ddPCR-applikationer.

Tvåstegs omvänd transkriptionsdroppe digitala PCR-protokoll för SARS-CoV-2-detektering och kvantifiering

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Dessa protokoll kan användas för att utveckla interna multiplex ddPCR-analyser för detektion av SARS-CoV-2 med hjälp av ett tvåfärgat ddPCR-system. Detta är användbart för personer som vill utveckla egna kit för detektion av SARS-CoV-2 och andra patogener. Jämfört med guldstandarden RT-qPCR kan RT-ddPCR användas för att kvantifiera flera SARS-CoV-2-gener utan behov av en standardkurva.Eftersom ddPCR är en framväxande teknik är visuell demonstration viktig för att hjälpa nuvarande och framtida användare att förstå och enkelt utveckla multiplexanalyser för SARS-CoV-2-detektion och andra patogener. För cDNA-syntes, tillsätt två mikroliter 5X omvänd transkriptionsmasterblandning, fem mikroliter av RNA-provet av intresse och tre mikroliter RNasfritt dubbeldestillerat vatten i ett 100 eller 200 mikroliter PCR-rör till en slutlig volym på 10 mikroliter som lösning och placera röret på is. När reagenserna har tillsatts, ladda provet i en termisk cykler och ställ in instrumentet för att köra en omvänd transkription vid 37 grader Celsius i 15 minuter, en värmeinaktivering av omvänd transkription i 5 sekunder vid 85 grader Celsius och ett slutligt oändligt grepp vid fyra grader Celsius.Innan du utför digital dropp-PCR, tillsätt 19,8 mikroliter nyberedd masterblandning till lämpligt antal brunnar på en nukleasfri digital PCR-platta med 96 brunnar. Tillsätt 2,2 mikroliter cDNA till varje brunn mastermix till en slutlig volym på 22 mikroliter reaktionsblandning per brunn och försegla plattan med en engångs PCR-plattförseglare. Virvla sedan plattan i 15 till 30 sekunder i centrifug i 10 till 15 sekunder för att samla upp brunnsinnehållet längst ner på plattan.För automatisk generering av droppar på pekskärmen för den automatiska droppgeneratorn klickar du på konfigurera provplatta och väljer de kolumner där proverna finns på provplattan. Klicka på okej och öppna den automatiska droppgeneratordörren. Ladda prov- och droppgenereringsplattorna och andra material som behövs för experimentet på respektive plats i instrumentet och stäng dörren.När pekskärmen blir grön, vilket indikerar att alla material har laddats i rätt position, väljer du olja för prober och startar droppgenerering. Vänta tills droppgenereringen körs till slutförandet enligt den tid som anges på skärmen. När skärmen säger Droppar klara, öppna dörren för att ta bort plattan som innehåller dropparna och använd en plattförseglare i fem sekunder vid 180 grader Celsius för att försegla plattan med en genomträngbar folietätning.Inom 30 minuter efter droppgenereringen, placera den förseglade droppplattan i en 96 djup brunn termisk cykler. Ställ in provvolymen på 40 mikroliter och locktemperaturen på 105 grader Celsius. Sedan förstärker PCR dropparna.För droppavläsning, efter förstärkningen, överför den termiska cykliska 96-brunnsplattan till en droppläsare och öppna den medföljande programvaran på en dator ansluten till droppläsaren. Från inställningsläget väljer du Ny och dubbelklickar på valfri brunn för att öppna dialogrutan för brunnsredigerare. Välj brunnarna som ska läsas och ställ in experimentet på absolut kvantifiering, supermix till droppe digital PCR supermix för sonder.Rikta in dig på en typ på okänd kanal 1 och mål två på okänd kanal 2. Tilldela provnamnen baserat på plattlayouten och klicka på tillämpa och okej. När du har sparat mallen klickar du på Kör.När du uppmanas av programvaran väljer du FAM / HEX-färgen. I slutet av datainsamlingen, ta bort plattan från läsaren. Innan du analyserar data, kontrollera data från alla brunnar för att få det totala antalet droppar.Och ställ in en cutoff för att acceptera ett minsta antal droppar som ska räknas som positiva eller negativa resultat. För simplex- och duplexanalysanalys, dubbelklicka på QLP-filen som ska analyseras och välj Analysera. Använd verktygen 1D-amplitud och 2D-amplitudtröskel för att skilja mellan positiva och negativa droppar för varje brunn i rätt kanal, med hjälp av nodmallkontrollen och positiva kontrollprover som vägledning.Exportera sedan resultaten som en CSV-fil för ytterligare analys. För en triplex sondblandningsanalys, öppna QLP-filen och välj brunnarna som ska analyseras på fliken plattredigerare. Ange experimenttypen till direkt kvantifiering och analysen för att undersöka mix triplex och ange målnamnet.Klicka sedan på Använd. Använd diagramverktygen för att tilldela specifika färger till olika målkluster enligt anvisningarna i popup-förslagen Välj att tilldela klusterfönster. När alla målfärger har tilldelats visas kvantifieringsdata i brunnsdatafönstret.Exportera data som en CSV-fil för underordnad analys. För en quadruplex-analys ställer du in experimenttypen på direkt kvantifiering och analysen på amplitudmultiplex. Ange målnamnet och klicka på Använd.Använd diagramverktygen för att tilldela specifika färger till olika målkluster enligt anvisningarna i popup-förslagen Välj att tilldela klusterfönster. När alla målfärger har tilldelats visas kvantifieringsdata i brunnsdatafönstret. Exportera data som en CSV-fil för ytterligare analys.Som observerats i denna representativa temperaturgradientanalys kunde högre knätemperaturer inte tydligt skilja positiva droppar från negativa droppar när en duplexanalys kördes. Men med en minskning av en knäböjningstemperatur uppnåddes en optimal separation mellan positiva och negativa droppar. Med hjälp av ett tvåfärgat RT-droppdigitalt PCR-detekteringssystem är det möjligt att detektera ett, två, tre och fyra SARS-CoV-2-mål i ett enda prov.Ett kontrollprov utan mall kan användas för att hitta negativa droppar för att ställa in det negativa tröskelvärdet i simplexanalyser. I duplexanalyser kan analysen utföras i enskilda kanaler eller i 2D-amplituden. Även om dataanalys av högre ordning för multiplexanalyser inte är okomplicerad, är dessa analyser användbara, eftersom de gör det möjligt att bedöma upp till åtta droppkluster i triplexsondblandningsanalyser och upp till 16 droppkluster för quadruplex amplitudbaserade analyser.Beroende på vilken analys som ska utvecklas, se till att rätt målprimer och sondkoncentrationer tillsätts i masterblandningen. Med hjälp av denna procedur kan man alternera målen för att utveckla nya RT-ddPCR-analyser. Dessa analyser kan användas för olika forskningsändamål eller för diagnos av nya infektionssjukdomar.Sedan dess utveckling har denna teknik använts för noggrann bestämning av virala nukleinsyrakopior i olika standarder, människokroppen och miljöprover.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Multiplex PCR och Omvänd Linje Blot Hybridisering analys (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Optimerad PCR-baserad detektion av Mycoplasma

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Isolering av humana hepatocyter med två steg kollagenas perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Anställa Digital Droppe PCR för att upptäcka BRAF V600E Mutationer i formalinfixerade paraffininbäddade referensstandard cellinjer

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Absolut kvantifiering av mikroRNA plasmanivåer hos Cynomolgus-apor använder kvantitativ realtids omvänd Transkription PCR

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

Microbiota analys med två steg PCR och nästa generations 16S rRNA Gene sekvensering

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

En tvåstegsstrategi som kombinerar epigenetisk modifiering och biomekaniska ledtrådar för att generera däggdjurs pluripotenta celler

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Swabbing the Urban Environment - En pipeline för provtagning och detektion av sars-cov-2 från miljöreservoarer

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

Konfokal avbildning av kvantpunkt-konjugerad SARS-CoV-2 spike trimers för att spåra bindning och endocytos i HEK293T-celler

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Kvantifiering av cirkulära RNA med hjälp av digital dropp-PCR

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...