Name: two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification
Uploaded: 2021-03-31T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Bu araştırma, Çin Sağlık Bakanlığı'ndan Bulaşıcı Hastalık Kontrolü Mega Projesi, hibe numarası 2017ZX10302301-005 ve Çin-Afrika Ortak Araştırma Merkezi, hibe numarası SAJC201605 tarafından finanse edilmiştir.

Etik beyan Wuhan Viroloji Enstitüsü (WHIOV), SARS-CoV-2 üzerine araştırma yapmak ve klinik örneklerden COVID-19'u tespit etmek için Wuhan şehrinin Çin CDC'si tarafından onaylanan laboratuvarlar ve enstitüler arasındadır. Klinik örnekler kullanılarak COVID-19 için yeni tanı teknikleri geliştirme araştırması, Wuhan Viroloji Enstitüsü (2020FCA001) etik komitesi tarafından da onaylanmıştır.
1. Örnek işleme iş akışı (Şekil 1A<...

<ol>
	<li>Nyaruaba, R., Mwaliko, C., Kering, K. K., Wei, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+digital+PCR+applications+in+the+tuberculosis+world.">Droplet digital PCR applications in the tuberculosis world.</a> Tuberculosis. 117, 85-92 (2019).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nature Methods. 9 (6), 541-544 (2012).</li><li>Quan, P. L., Sauzade, M., Brouzes, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=dPCR:+a+technology+review.">dPCR: a technology review.</a> Sensors. 18 (4), 1271 (2018).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (16), 9236 (1999).</li><li>Kuypers, J., Jerome, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+digital+PCR+for+clinical+microbiology.">Applications of digital PCR for clinical microbiology.</a> Journal of Clinical Microbiology. 55 (6), 1621 (2017).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+droplet+digital+PCR+to+detect+the+pathogens+of+infectious+diseases.">Application of droplet digital PCR to detect the pathogens of infectious diseases.</a> Bioscience Reports. 38 (6), (2018).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+comparisons+of+SARS-COV-2+detection+by+qRT-PCR+and+ddPCR+with+multiple+primer/probe+sets.">Analytical comparisons of SARS-COV-2 detection by qRT-PCR and ddPCR with multiple primer/probe sets.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1175-1179 (2020).</li><li>Suo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ddPCR:+a+more+accurate+tool+for+SARS-CoV-2+detection+in+low+viral+load+specimens.">ddPCR: a more accurate tool for SARS-CoV-2 detection in low viral load specimens.</a> Emerging Microbes &amp; Infections. 9 (1), 1259-1268 (2020).</li><li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aerodynamic+analysis+of+SARS-CoV-2+in+two+Wuhan+hospitals.">Aerodynamic analysis of SARS-CoV-2 in two Wuhan hospitals.</a> Nature. 582 (7813), 557-560 (2020).</li><li>Lv, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+SARS-CoV-2+RNA+residue+on+object+surfaces+in+nucleic+acid+testing+laboratory+using+droplet+digital+PCR.">Detection of SARS-CoV-2 RNA residue on object surfaces in nucleic acid testing laboratory using droplet digital PCR.</a> Science of The Total Environment. 742, 140370 (2020).</li><li>Yu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+detection+and+viral+load+analysis+of+SARS-CoV-2+in+infected+patients.">Quantitative detection and viral load analysis of SARS-CoV-2 in infected patients.</a> Clinical Infectious Diseases. 71 (15), 793-798 (2020).</li><li>Scutari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+SARS-CoV-2+infection+associated+with+viral+dissemination+in+different+body+fluids+including+bile+in+two+patients+with+acute+cholecystitis.">Long-term SARS-CoV-2 infection associated with viral dissemination in different body fluids including bile in two patients with acute cholecystitis.</a> Life. 10 (11), 302 (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+field-deployable+RT-qPCR+workflow+for+COVID-19+detection.">Development of a field-deployable RT-qPCR workflow for COVID-19 detection.</a> Preprints. , (2020).</li><li>Whale, A. S., Huggett, J. F., Tzonev, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamentals+of+multiplexing+with+digital+PCR.">Fundamentals of multiplexing with digital PCR.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 10, 15-23 (2016).</li><li>Dobnik, D., &#352;tebih, D., Blejec, A., Morisset, D., &#381;el, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+quantification+of+four+DNA+targets+in+one+reaction+with+Bio-Rad+droplet+digital+PCR+system+for+GMO+detection.">Multiplex quantification of four DNA targets in one reaction with Bio-Rad droplet digital PCR system for GMO detection.</a> Scientific Reports. 6 (1), 35451 (2016).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+single+dye+duplex+droplet+digital+PCR+assay+for+the+rapid+detection+and+quantification+of+mycobacterium+tuberculosis.">Development and evaluation of a single dye duplex droplet digital PCR assay for the rapid detection and quantification of mycobacterium tuberculosis.</a> Microorganisms. 8 (5), 701 (2020).</li><li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SARS-CoV-2+detection+using+digital+PCR+for+COVID-19+diagnosis,+treatment+monitoring+and+criteria+for+discharge.">SARS-CoV-2 detection using digital PCR for COVID-19 diagnosis, treatment monitoring and criteria for discharge.</a> medRxiv. , (2020).</li><li>Nyaruaba, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+multiplex+ddPCR+assays+for+SARS-CoV-2+detection+based+on+probe+mix+and+amplitude+based+multiplexing.">Developing multiplex ddPCR assays for SARS-CoV-2 detection based on probe mix and amplitude based multiplexing.</a> Expert Review of Molecular Diagnostics. , 1-11 (2020).</li></ol>

SARS-CoV-2 tespiti için RT-ddPCR testlerinin nasıl geliştirileceği konusunda çok az kaynak mevcuttur. Bu makalede kullanılmamasına rağmen, bilinen kopyaları olan standart numuneler, tahlilleri geliştirmek ve optimize etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, bu çalışmada, Vero-E6 hücrelerinde yetiştirilen SARS-CoV-2 örnekleri, insan genomik RNA'sının bir arka planında çivilendi ve tahlilleri geliştirmek için standart örnekler olarak kullanıldı. Tahliller geliştirilirken uygun astar ve prob ...

İyi bilinen bir teknik olan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), nükleik asit araştırmalarına cevap verebilen güçlü bir teknik haline gelmesinden bu yana çeşitli dönüşümler geçirmiştir. Bu dönüşümler eski tekniğin sürekli bir gelişimi olmuştur. Bu dönüşümler üç kuşakta özetlenebilir1. İlk nesil, güçlendirilmiş hedefleri ölçmek ve tespit etmek için jel elektroforezine dayanan geleneksel PCR'dir. İkinci nesil, numuneleri gerçek zamanlı olarak tespit edebilen ve bir numunedeki hedefleri doğrudan ölçmek için standart bir eğriye dayanan kantitatif gerçek zamanlı PCR'dir (qPCR). Üçüncü nesil dijital PCR (dPCR), standart bir eğriye ihtiyaç duymadan nükleik asit hedeflerinin hem tespitini hem de mutlak nicelleştirilmesini gerçekleştirebilir. dPCR ayrıca, bir duvarın kuyuları tarafından ayrılan reaksiyon odalarından, damlacık bazlı dijital PCR2'de görüldüğü gibi, aynı kuyu içinde yağ, su emülsiyonlarına ve stabilize edici kimyasallara daha da geliştirilmiştir. Damlacık dijital PCR'de (ddPCR), bir numune, daha sonra Poisson istatistikleri 2,3,4 kullanılarak ölçülecek olan bireysel hedefleri içeren binlerce nanolitre boyutlu damlacığa bölünür. Bu teknik, ddPCR'ye, diğer PCR nesillerine kıyasla düşük bol hedeflerin ölçülmesinde bir avantaj sağlar.
Son zamanlarda, birden fazla uygulama, düşük bol hedefleri tespit ederken ve ölçerken ddPCR'nin yaygın olarak kullanılan qPCR'ye göre üstünlüğünü vurgulamıştır 1,5,6. SARS-CoV-2 bu uygulamalar için bir istisna değildir 7,8,9,10,11,12. SARS-CoV-2'nin patlak vermesinden bu yana, bilim adamları virüsün nasıl teşhis edileceği ve verimli bir şekilde nasıl tespit edileceği konusunda çözümler bulmak için tüm cephelerde çalışıyorlar. Mevcut altın standart hala qPCR13 olmaya devam etmektedir. Bununla birlikte, RT-ddPCR'nin, RT-qPCR 7,8,9,10,11,12 ile karşılaştırıldığında, hem çevresel hem de klinik örneklerden düşük miktarda SARS-CoV-2 hedeflerini tespit etmede daha doğru olduğu gösterilmiştir. SARS-CoV-2 ddPCR tarafından yayınlanan çalışmaların çoğu, ticari tahlillere bağlı olarak multipleks tahlillere bağlı olarak simpleks tahlillerine dayanmaktadır. Bu nedenle, SARS-CoV-2 tespiti için multipleks RT-dPCR testlerinin nasıl geliştirileceğini açıklamak için daha fazla şey yapılmalıdır.
Uygun bir tahlil tasarımında çoğullama, maliyetten tasarruf etmek, numune verimini artırmak ve küçük bir numune içinde hassas bir şekilde tespit edilebilecek hedef sayısını en üst düzeye çıkarmak için kullanılabilir. ddPCR ile çoğullama yaparken, belirli bir sistemde kaç floroforun tespit edilebileceği dikkate alınmalıdır. Bazı ddPCR platformları en fazla üç kanalı desteklerken, diğerleri yalnızca iki kanalı destekler. Bu nedenle, iki kanalla çoklama yaparken, ikiden fazla hedefi tespit etmek için daha yüksek dereceli çoklama da dahil olmak üzere farklı yaklaşımlar kullanmak gerekir14,15,16. Bu çalışmada, farklı araştırma uygulamaları için uyarlanabilecek farklı SARS-CoV-2 RT-ddPCR testlerinin nasıl geliştirileceğine dair adımları göstermek için iki renkli bir ddPCR tespit sistemi kullanılmıştır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FHT101-32</td>
			<td>Automated extractor for RNA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AutoDG Oil for Probes</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003017</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR 96-Well Plates</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>12003185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1863024</td>
			<td>Making ddPCR assay mastermix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DG32 AutoDG Cartridges</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864108</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electronic thermostatic water bath pot</td>
			<td>Beijing Changfeng Instrument and Meter Company</td>
			<td>XMTD-8000</td>
			<td>Heat inactivation of samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit</td>
			<td>Genfine Biotech</td>
			<td>FMY502T5</td>
			<td>Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierceable Foil Heat Seals</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tips for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864120</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864125</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)</td>
			<td>TaKaRa</td>
			<td>RR036A</td>
			<td>cDNA generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PX1 PCR Plate Sealer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1814000</td>
			<td>Seal the droplet plate from AutoDG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft 1.7 Software</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>10026368</td>
			<td>Data acquisition and analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantaSoft Analysis Pro 1.0</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Data analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG)</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864101</td>
			<td>QX200 AutoDG consumable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QX200 Droplet Reader</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1864003</td>
			<td>Droplet reading and data acquisition</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1861096</td>
			<td>Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-step reverse transcription droplet digital pcr protocols for sars-cov-2 detection and quantification

Devam eden SARS-CoV-2 pandemisinin teşhisi, dünyadaki tüm ülkeler için bir önceliktir. Şu anda, ters transkripsiyon kantitatif PCR (RT-qPCR), kalıcı bir çözüm bulunmadığından SARS-CoV-2 tanısı için altın standarttır. Bu teknik ne kadar etkili olursa olsun, özellikle düşük bol hedefler söz konusu olduğunda, tespit ve tanıdaki sınırlamalarını gösteren araştırmalar ortaya çıkmıştır. Buna karşılık, qPCR'ye göre üstün avantajlara sahip yeni ortaya çıkan bir teknoloji olan damlacık dijital PCR'nin (ddPCR), düşük miktarda hedef numuneden SARS-CoV-2 tanısında RT-qPCR'nin zorluklarının üstesinden geldiği gösterilmiştir. İleriye dönük olarak, bu makalede, RT-ddPCR'nin yetenekleri, iki renkli bir algılama sistemi kullanarak simpleks, dubleks, tripleks prob karışımı ve dörtlü testlerin nasıl geliştirileceğine dair adımlar gösterilerek daha da genişletilmiştir. SARS-CoV-2 genomunun belirli bölgelerini (N, ORF1ab, RPP30 ve RBD2) hedefleyen primerler ve problar kullanılarak, bu testlerin geliştirilmesinin mümkün olduğu gösterilmiştir. Ek olarak, tahlil iş akışının nasıl geliştirileceği ve verilerin nasıl analiz edileceği konusunda adım adım ayrıntılı protokoller, notlar ve öneriler sağlanmaktadır. Bu iş akışının gelecekteki çalışmalara uyarlanması, küçük bir numunede maksimum hedef sayısının hassas bir şekilde tespit edilebilmesini sağlayacak ve maliyet ve numune verimini önemli ölçüde artıracaktır.

Bir kavram kanıtı çalışmasında, multipleks tahlillerin analitik performansı klinik ve araştırma örnekleri üzerinde test edilmiştir19. Multipleks tahlillerin performansı RT-PCR 19'unkinden daha üstündü. Düşük sayıda damlacık damlacık üretimi sırasında bir soruna işaret edebileceğinden, bu makalede ampirik verilere dayanarak kuyu başına 10.000 damlacık kesimi ayarlanmıştır.
Minimum yağmur paraziti ile pozitif ve ne...

Watch this Scientific Journal Video about Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification at JoVE.com

Two-Step Reverse Transcription Droplet Digital PCR Protocols for SARS-CoV-2 Detection and Quantification

Bu çalışma, iki renkli bir ddPCR sistemi kullanarak SARS-CoV-2 tespiti için farklı tahliller geliştirme adımlarını özetlemektedir. Adımlar ayrıntılıdır ve tahlillerin ve deney performansının nasıl geliştirileceğine dair notlar eklenmiştir. Bu testler birden fazla SARS-CoV-2 RT-ddPCR uygulaması için kullanılabilir.

SARS-CoV-2 Tespiti ve Ölçümü için İki Adımlı Ters Transkripsiyon Damlacığı Dijital PCR Protokolleri

Diagnosis of the ongoing SARS-CoV-2 pandemic is a priority for all countries across the globe. Currently, reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) ...

Bu protokoller, iki renkli bir ddPCR sistemi kullanarak SARS-CoV-2'nin tespiti için şirket içi multipleks ddPCR testleri geliştirmek için kullanılabilir. Bu, SARS-CoV-2 ve diğer patojenlerin tespiti için kendi kitlerini geliştirmek isteyen insanlar için yararlıdır. Altın standart RT-qPCR ile karşılaştırıldığında, RT-ddPCR, standart bir eğriye ihtiyaç duymadan çoklu SARS-CoV-2 genlerini ölçmek için kullanılabilir.ddPCR gelişmekte olan bir teknik olduğundan, mevcut ve gelecekteki kullanıcıların SARS-CoV-2 tespiti ve diğer patojenler için multipleks tahlilleri anlamalarına ve kolayca geliştirmelerine yardımcı olmak için görsel gösterim önemlidir. cDNA sentezi için, iki mikrolitre 5X ters transkripsiyon ana karışımı, ilgilenilen RNA örneğinin beş mikrolitresi ve üç mikrolitre RNaz içermeyen çift damıtılmış suyu, çözelti olarak 10 mikrolitrelik bir son hacme 10 mikrolitrelik bir PCR tüpüne ekleyin ve tüpü buzun üzerine yerleştirin. Reaktifler eklendiğinde, numuneyi bir termal döngüleyiciye yükleyin ve cihazı 15 dakika boyunca 37 santigrat derecede ters transkripsiyon, 85 santigrat derecede 5 saniye boyunca ters transkripsiyonun ısıl inaktivasyonu ve dört santigrat derecede son sonsuz tutma çalıştıracak şekilde ayarlayın.Damlacık dijital PCR yapmadan önce, nükleaz içermeyen 96 delikli damlacık dijital PCR plakasının uygun sayıda kuyucuğuna 19,8 mikrolitre taze hazırlanmış ana karışım ekleyin. Ana karışımın her bir kuyucuğuna, kuyu başına 22 mikrolitre reaksiyon karışımının son hacmine 2.2 mikrolitre cDNA ekleyin ve plakayı tek kullanımlık bir PCR plaka sızdırmazlık maddesi ile kapatın. Ardından, plakanın altındaki kuyu içeriğini toplamak için plakayı 15 ila 30 saniye boyunca santrifüjde 10 ila 15 saniye boyunca vorteks edin.Otomatik damlacık oluşturucu dokunmatik ekranında otomatik damlacık üretimi için numune plakasını yapılandır'a tıklayın ve numunelerin numune plakasında bulunduğu sütunları seçin. Tamam'a tıklayın ve otomatik damlacık jeneratörü kapağını açın. Numune ve damlacık üretim plakalarını ve deney için gerekli diğer malzemeleri cihaz içindeki ilgili yerlere yükleyin ve kapıyı kapatın.Dokunmatik ekran yeşile döndüğünde, tüm malzemelerin doğru konumlarına yüklendiğini gösterir, problar için yağ seçin ve damlacık oluşumunu başlatın. Damlacık üretiminin ekranda belirtilen süreye göre tamamlanmasını bekleyin. Ekran Damlacıklar hazır dediğinde, damlacıkları içeren plakayı çıkarmak için kapıyı açın ve plakayı delinebilir bir folyo contasıyla kapatmak için 180 santigrat derecede beş saniye boyunca bir plaka mühürleyici kullanın.Damlacık oluşumundan sonraki 30 dakika içinde, kapalı damlacık plakasını 96 derin kuyulu bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Numune hacmini 40 mikrolitreye ve kapak sıcaklığını 105 santigrat dereceye ayarlayın. Daha sonra, PCR damlacıkları yükseltir.Damlacık okuması için, amplifikasyondan sonra, termal döngülü 96 delikli plakayı bir damlacık okuyucuya aktarın ve beraberindeki yazılımı damlacık okuyucuya bağlı bir bilgisayarda açın. Kurulum modundan Yeni'yi seçin ve kuyu düzenleyici iletişim kutusunu açmak için herhangi bir kuyucuğa çift tıklayın. Okunacak kuyucukları seçin ve deneyi mutlak nicelemeye, süpermiksi damlacık dijital PCR süpermiksine problar için ayarlayın.Bir türü bilinmeyen kanal 1'e ve iki türü bilinmeyen kanal 2'ye hedefleyin. Örnek adları plaka düzenine göre atayın ve uygula ve tamam'ı tıklatın. Şablonu kaydettikten sonra Çalıştır'ı tıklatın.Yazılım tarafından istendiğinde, FAM/HEX rengini seçin. Veri toplamanın sonunda, plakayı okuyucudan çıkarın. Verileri analiz etmeden önce, toplam damlacık sayısını elde etmek için tüm kuyucuklardan gelen verileri kontrol edin.Ve pozitif veya negatif sonuç olarak sayılacak minimum damlacık sayısını kabul etmek için bir kesim ayarlayın. Tek taraflı ve dubleks tahlil analizi için, analiz edilecek QLP dosyasına çift tıklayın ve Analiz Et'i seçin. Düğüm şablonu kontrolünü ve pozitif kontrol örneklerini kılavuz olarak kullanarak doğru kanaldaki her bir kuyu için pozitif ve negatif damlacıkları ayırt etmek için 1B genlik ve 2B genlik eşiği araçlarını kullanın.Ardından, ek analiz için sonuçları CSV dosyası olarak dışa aktarın. Bir tripleks prob karışımı testi için, QLP dosyasını açın ve plaka düzenleyici sekmesinde analiz edilecek kuyucukları seçin. Deney türünü doğrudan nicelemeye ve testi tripleks karışımını araştırmak için ayarlayın ve hedef adı girin.Ardından Uygula'yı tıklayın. Küme atamayı seç penceresi açılır pencere önerilerinin yönlendirdiği şekilde farklı hedef kümelere belirli renkler atamak için grafik araçlarını kullanın. Tüm hedef renkler atandığında, niceleme verileri kuyu verileri penceresinde görüntülenir.Aşağı akış analizi için verileri CSV dosyası olarak dışa aktarın. Dörtlü bir tahlil için, deney türünü doğrudan nicelemeye ve tahlili genlik multipleksine ayarlayın. Hedef adını girin ve Uygula'yı tıklayın.Küme atamayı seç penceresi açılır pencere önerilerinin yönlendirdiği şekilde farklı hedef kümelere belirli renkler atamak için grafik araçlarını kullanın. Tüm hedef renkler atandığında, niceleme verileri kuyu verileri penceresinde görüntülenir. Ek analiz için verileri CSV dosyası olarak dışa aktarın.Bu temsili sıcaklık gradyanı analizinde gözlemlendiği gibi, daha yüksek diz çökme sıcaklıkları, dubleks bir tahlil yapıldığında pozitif damlacıkları negatif damlacıklardan açıkça ayırt edememiştir. Bununla birlikte, diz çökme sıcaklığındaki bir düşüşle, pozitif ve negatif damlacıklar arasında optimal bir ayrım sağlanmıştır. İki renkli RT damlacık dijital PCR algılama sistemi kullanarak, tek bir numune içinde bir, iki, üç ve dört SARS-CoV-2 hedefini tespit etmek mümkündür.Şablonsuz bir kontrol örneği, simpleks tahlillerinde negatif eşiğin ayarlanmasına yardımcı olmak üzere negatif damlacıkları bulmak için kullanılabilir. Dubleks tahlillerde, analiz bireysel kanallarda veya 2D genliğinde gerçekleştirilebilir. Her ne kadar daha yüksek mertebeden multipleks tahlil veri analizi basit olmasa da, bu tahliller yararlıdır, çünkü tripleks prob karışımı tahlillerinde sekiz damlacık kümesine ve dörtlü genliğe dayalı analizler için 16 damlacık kümesine kadar değerlendirilmesine izin verirler.Geliştirilecek tahlile bağlı olarak, ana karışıma doğru hedef astar ve prob konsantrasyonlarının eklendiğinden emin olun. Bu prosedürü kullanarak, yeni RT-ddPCR testleri geliştirmek için hedefler değiştirilebilir. Bu tahliller farklı araştırma amaçları için veya ortaya çıkan bulaşıcı hastalıkların teşhisi için kullanılabilir.Geliştirilmesinden bu yana, bu teknik, farklı standartlarda, insan vücudunda ve çevresel örneklerde viral nükleik asit kopyalarının doğru bir şekilde belirlenmesi için kullanılmıştır.

Research

JoVE Journal

Biology

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay (mPCR/RLB)

Multiplex PCR and Reverse Line Blot Hybridization Assay mPCR/RLB

Multiplex PCR ve Reverse Line Blot Hibridizasyon Testi (mPCR / RLB)

Multiplex PCR/Reverse Line Blot Hybridization assay allows the detection of up to 43 molecular targets in 43 samples using one multiplex PCR reaction ...

Optimized PCR-based Detection of Mycoplasma

Mycoplasma optimize edilmiş PCR tabanlı Algılama

The maintenance of contamination-free cell lines is essential to cell-based research. Among the biggest contaminant concerns are mycoplasma contamination. ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

Bir iki aşamalı kolajenes perfüzyon prosedür ile insan Hepatositlerin İzolasyonu

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

Employing Digital Droplet PCR to Detect BRAF V600E Mutations in Formalin-fixed Paraffin-embedded Reference Standard Cell Lines

Dijital Damlacık PCR Formalin sabit Parafin gömülü Referans Standart Hücre Hatlarında BRAF V600E mutasyonları tespit etmek istihdam

ddPCR is a highly sensitive PCR method that utilizes a water-oil emulsion system. Using a droplet generator, an extracted nucleic acid sample is ...

Absolute Quantification of Plasma MicroRNA Levels in Cynomolgus Monkeys, Using Quantitative Real-time Reverse Transcription PCR

Cynomolgus maymunlar, nicel gerçek zamanlı ters transkripsiyon PCR kullanarak plazma mikroRNA düzeylerinin mutlak miktar

RT-qPCR is one of the most common methods to assess individual target miRNAs. MiRNAs levels are generally measured relative to a reference sample. This ...

Microbiota Analysis Using Two-step PCR and Next-generation 16S rRNA Gene Sequencing

İki adımlı PCR ve Yeni Nesil 16S rRNA Gen Sıralaması Kullanarak Mikrobiyota Analizi

The human gut is colonized by trillions of bacteria that support physiologic functions such as food metabolism, energy harvesting, and regulation of the ...

A Two-Step Strategy that Combines Epigenetic Modification and Biomechanical Cues to Generate Mammalian Pluripotent Cells

Memeli Pluripotent Hücreleri Üretmek için Epigenetik Modifikasyonu ve Biyomekanik İpuçlarını Birleştiren İki Adımlı Bir Strateji

Cell phenotype can be reversed or modified with different methods, with advantages and limitations that are specific for each technique. Here we describe ...

Swabbing the Urban Environment - A Pipeline for Sampling and Detection of SARS-CoV-2 From Environmental Reservoirs

Kentsel Çevrenin Taranması - Çevre Rezervuarlarından SARS-CoV-2'nin Örneklemesi ve Tespiti için Bir Boru Hattı

To control community transmission of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) during the 2020 global pandemic, most countries ...

High-throughput Confocal Imaging of Quantum Dot-Conjugated SARS-CoV-2 Spike Trimers to Track Binding and Endocytosis in HEK293T Cells

HEK293T Hücrelerinde Bağlanma ve Endositozu İzlemek için Kuantum Nokta Konjuge SARS-CoV-2 Spike Trimerlerinin Yüksek Verimli Konfokal Görüntülemesi

The development of new technologies for cellular fluorescence microscopy has facilitated high-throughput screening methods for drug discovery. Quantum ...

Quantification of Circular RNAs Using Digital Droplet PCR

Dairesel RNA'ların Dijital Damlacık PCR Kullanılarak Nicelleştirilmesi

Digital droplet polymerase chain reaction (dd-PCR) is one of the most sensitive quantification methods; it fractionates the reaction into nearly 20,000 ...