Name: visualizing ocular morphogenesis by lightsheet microscopy using rx3:gfp transgenic zebrafish
Uploaded: 2021-04-05T14:00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish at JoVE.com

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom Büro des Direktors der National Institutes of Health (NIH) unter der Preisnummer S10OD020067 und vom NIH-Preis R01EY021769 (an A.C.M.) unterstützt. Wir danken Doug Harrison und Jim Begley im Arts & Sciences Imaging Center der University of Kentucky und Lucas Vieira Francisco und Evelyn M. Turnbaugh für die fachkundige Pflege von Zebrafischen.

Alle Experimente mit der Verwendung von Zebrafischen wurden in Übereinstimmung mit Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Kentucky festgelegt wurden.
1. Probenvorbereitung
<ol><li>Stellen Sie ein sich paarendes Paar Tg (Rx3: GFP) Zebrafische in einem geschlossenen Quertank in der Nacht vor der Planung der Bildgebung auf. Am nächsten Morgen ziehen Sie das Tor, als die Lichter in der Fischanlage34,35 angehen. HINWEIS: Das ausgewählte Paarungspaar von Fischen sollte zwischen 4 Monaten und 2 Jahren alt sein und anhand von Körperform und Färbung leicht als männlich oder weiblich unterschiedenwerden können 35.</li>
	<li>Überprüfen Sie die Kreuze jede halbe Stunde auf Embryonen und notieren Sie, wann Embryonen zuerst im Boden des Kreuzbeckens sichtbar gemacht werden. Übertragen Sie die Embryonen in eine Petrischale und halten Sie die Embryonen für ca. 10 h bei 28,5 ° C, um sich zum 1-2 Somitestadium (ss) zu entwickeln. Beginnen Sie mit der Bildgebung im 1-2 Somite-Stadium (ss).</li>
	<li>Um auf das Vorhandensein von Somiten zu untersuchen, beobachten Sie die Embryonen unter einem Stereoskop bei 10 hpf und zählen Sie die Anzahl der Somiten1. HINWEIS: Alle Embryonen, die über das einzelne Somitestadium hinausgehen, sollten für dieses Experiment nicht verwendet werden.</li>
	<li>Aus den Embryonen, die sich im Einzelsomitestadium befinden, wird die GFP-Expression mit einem Fluoreszenzadapter in Kombination mit einem Stereomikroskop untersucht, um das Vorhandensein des Rx3:GFP-Transgens zu bestätigen. Sobald 3-5 GFP-positive Individuen identifiziert wurden, verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Embryonen zu dechorionieren, und übertragen Sie sie in eine kleine Petrischale mit E3-Embryopuffer mit einer Glaspipette35.</li>
	<li>Anästhesieren Sie die Embryonen, indem Sie sie in einen 0,5 ml E3-Embryopuffer (pH 7) mit 0,168 mg/ml Tricain (MS222) in einem Mikrozentrifugenröhrchen35,36 übertragen. Spontane Muskelbewegungen beginnen bereits mit 17 hpf37. Stellen Sie sicher, dass Embryonen über diesen Zeitpunkt hinaus betäubt werden.</li>
	<li>Betten Sie die Embryonen in 1% niedriger Schmelztemperatur Agarose in 0,168 mg / ml Tricain und E3 ein. HINWEIS: Dies ist die optimale Konzentration von Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, damit der Embryo an Ort und Stelle gehalten werden kann, aber biegsam genug bleibt, um das Wachstum des Embryos über den Bildgebungszeitverlaufzu ermöglichen 30,31.</li>
	<li>Bereiten Sie eine 10 ml Lösung aus 2% niedriger Schmelztemperatur Agarose im E3-Puffer vor. Erhitzen Sie es in einem Mikrowellenherd, um Agarose in Intervallen von 15 s aufzulösen, um zu verhindern, dass die Lösung überkocht. Lassen Sie die Lösung so abkühlen, dass sie ohne Beschwerden hält, aber nicht so sehr, dass sie sich verfestigt und den Embryonen keinen Schaden zufügt. Sobald die Agarose ausreichend abgekühlt ist, fügen Sie 0,5 ml zu den Embryonen in der Tube von Tricain in E3 hinzu und pipettieren Sie vorsichtig die Lösung und die Embryonen, um sie zu mischen.</li>
	<li>Ziehen Sie die Embryonen in der Agaroselösung mit einer 1-mm-Glaskapillare und einem Kolben aus Polytetrafluorethylen (PTFE) in die Kapillare hoch. Stellen Sie sicher, dass Sie insgesamt 3-5 Embryonen (mehrere Embryonen) in die Kapillare ziehen, um die Wahrscheinlichkeit eines gut positionierten Embryos zu erhöhen. HINWEIS: Aufgrund der runden Natur der Embryonen zu diesem Zeitpunkt ist es schwierig, eine bestimmte Ausrichtung in der Kapillare zu gewährleisten. Idealerweise wird der Körper des Embryos seitlich in der Kapillare positioniert, was eine möglichst einfache Positionierung innerhalb des Mikroskops ermöglicht.</li>
	<li>Lassen Sie die Agarose über einen Zeitraum von 30-60 s bei Raumtemperatur erstarren. Geben Sie die Kapillare in ein Becherglas mit 0,168 mg/ml Tricain in den E3-Puffer, bis sie zur Abbildung bereit ist (Abbildung 1A). HINWEIS: Die überschüssige 2% Agaroselösung mit niedriger Schmelztemperatur kann in zukünftigen Experimenten erstarren und anschließend wieder erwärmt werden.</li>
	<li>Legen Sie die Kapillare in den Probenhalter (Abbildung 1B-F), wie in Schritt 2.5 beschrieben.</li>
</ol>2. Zeiss Lightsheet Z.1 einrichten
<ol><li>Schalten Sie jede Komponente des Mikroskops und des Computers in der folgenden Reihenfolge ein: 1) System, 2) PC, dann 3) Inkubation (Abbildung 2A).</li>
	<li>Platzieren Sie das 20-fache Abbildungsobjektiv und das 10-fache Beleuchtungsobjektiv in der Mikroskopkammer. Passen Sie die Zieleinstellungen in der Zen-Software-Benutzeroberfläche auf der Registerkarte " Verwalten" an.</li>
	<li>Schieben Sie die Kammer (Abbildung 2C) mit dem Rohr nach außen in das Gehäuse auf der Schiene (Abbildung 2B). Der Schlauch wird an die entsprechenden Anschlüsse auf der rechten Seite angeschlossen, wie in Abbildung 2E dargestellt.</li>
	<li>Befestigen Sie die Verlängerungsleitung mit dem Luer-Lock-Mechanismus an der Spritze (Abbildung 2D); Füllen Sie es mit Tricain in E3 und legen Sie es in die Halterung, die rechts am Mikroskop35 angebracht ist. Verbinden Sie die Verlängerung, die an der mit Tricain in E3 gefüllten Spritze befestigt ist, unten rechts in der Kammer mit dem Luer-Lock-Mechanismus. Drücken Sie den Kolben, um die Kammer mit dem Tricain/E3-Puffer zu füllen. Schließen Sie die Tür zur Kammer.</li>
	<li>Legen Sie die Kapillare mit der Probe in den Kapillarprobenhalter. Der Kapillarprobenhalter besteht aus zwei Gummihülsen, einer Metallprobenhalterscheibe, einem Metallstiel und einer Metallkappe (Abbildung 1B). Klicken Sie mit dem Metallmantel in die Mitte der Metallscheibe (Abbildung 1C). Legen Sie die beiden Gummistopfen in die Hülle, wobei die Schlitze den Enden der Scheide zugewandt sind, gefolgt von der Kapillare. Schieben Sie die Kapillare durch die Mitte der Gummistopfen. Befestigen Sie es mit der Metallkappe, sobald sich der Marker an der Basis des Metallmantels befindet (Abbildung 1D).</li>
	<li>Legen Sie den Kapillarprobenhalter auf die Oberseite des Mikroskops, wobei die weißen Markierungen ausgerichtet sind (Abbildung 1E,F). Schließen Sie den Deckel.</li>
	<li>Klicken Sie auf der Softwareoberfläche auf die Schaltfläche Kapillare suchen (Abbildung 3A). Verwenden Sie das ErgoDrive-Bedienfeld, ein manuelles Gerät, das die Kapillarausrichtung steuert (Abbildung 3E), um die Kapillare zu bewegen und direkt über dem Objektiv zu positionieren (Abbildung 3B).</li>
	<li>Öffnen Sie den Deckel und drücken Sie vorsichtig auf den Kolben, bis der Agaroseabschnitt, der den Embryo enthält, unter dem Kapillarboden hängt und sich vor dem Objektiv befindet (Abbildung 3C).</li>
	<li>Deaktivieren Sie Kapillare suchen, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Beispiel suchen " (Abbildung 3A). Dadurch wird der Blick von der Webcam der Probenkammer auf das Mikroskopobjektiv umgeschaltet (Abbildung 3D). Verwenden Sie diese Ansicht, um die Position der Probe genauer einzustellen. Deaktivieren Sie Beispiel suchen (Abbildung 3A).</li>
	<li>Wechseln Sie zur Registerkarte Akquisition. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Z-Stack und Time Series.</li>
	<li>Wählen Sie im Fenster Parameter für den Erfassungsmodus die Einstellung Dual Side Lightsheet aus, und aktivieren Sie die Kontrollkästchen für Online Dual Side Fusion und Pivot Scanning.</li>
	<li>Wählen Sie im Fenster Kanäle die Option 488 Kanal aus, stellen Sie die Laserleistung auf 1 und die Belichtungszeit auf 7,5 ms ein.</li>
	<li>Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche Fortlaufend , um eine Live-Ansicht des Embryos zu erhalten. Verwenden Sie das ErgoDrive-Bedienfeld, um die Position des Embryos anzupassen, bis das Augenfeld direkt der Kamera zugewandt ist. Fahren Sie fort, die linken und rechten Lichtblätter in den Channels-Parametern anzupassen, bis das Augenfeld ausreichend scharf ist.</li>
	<li>Stellen Sie die Z-Stack-Parameter über das ErgoDrive-Bedienfeld ein, um sich durch die Z-Ebene zu bewegen. Stellen Sie die erste und die letzte Z-Position um 500 μm über das letzte detektierbare Fluoreszenzsignal hinaus. Dies lässt Raum für das Augenfeld, um im Rahmen zu bleiben, während der Embryo während der Zeitraffer-Bildgebungssitzung wächst. Nachdem Sie den Bereich des Z-Stacks eingestellt haben, klicken Sie auf die Schaltfläche Optimal, um die Schrittweite auf 0,477 μm, die optimale Einstellung, einzustellen.</li>
	<li>Stellen Sie die Inkubationsparameter ein, indem Sie das Kontrollkästchen für die Peltier-Einheit aktivieren, um die Temperatur bei 28 ° C zu halten. Wählen Sie im Fenster Zeitreihe die Frequenz und das Zeitintervall für die Aufnahme von Bildern aus. In diesem Protokoll wurden die Parameter so eingestellt, dass sie alle 5 Minuten abbilden, für insgesamt 166 Intervalle.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche Experiment starten . Wählen Sie den Ordner aus, in dem der Bildsatz gespeichert werden soll. Legen Sie das Bildpräfix fest und klicken Sie auf Speichern , um die Bildgebung zu starten. HINWEIS: Das Mikroskop durchläuft nun jedes eingestellte Bild im angegebenen Intervall.</li>
	<li>Nachdem die Zeitraffer-Bildgebungssitzung abgeschlossen ist, senden Sie die Stufe an die Belastungsposition, und entfernen Sie den Kapillarprobenhalter. Nehmen Sie den Kapillarprobenhalter in der umgekehrten Reihenfolge, in der er zusammengesetzt wurde, auseinander und verwenden Sie den Kolben, um die Probe und überschüssige Agarose aus der Kapillare zu entfernen. Öffnen Sie die Kammertür. Verwenden Sie die Spritze, um die Kammerflüssigkeit aus der Kammer zu entfernen, trennen und entfernen Sie die Kammer, spülen Sie sie dann mit Wasser ab und trocknen Sie sie an der Luft.</li>
</ol>3. Bildanalyse
<ol><li>Öffnen Sie das Softwareprogramm arivis Vision4D.</li>
	<li>Klicken Sie auf Datei und wählen Sie dann Datei importieren. Wählen Sie alle CZI-Dateien aus der Zeitraffer-Imaging-Sitzung aus und öffnen Sie sie. Das nächste Fenster mit den Optionen zum Importieren der Dateien wird geöffnet. Wählen Sie Z-Stapel als Rahmen aus, um die Z-Stapel in der erhaltenen Reihenfolge zu sortieren. Sobald die Dateien importiert wurden, speichert die Software als einzelne .sis-Datei. Um den Speicherort für die zu speichernde Datei anzugeben, wählen Sie den Ordner aus, bevor Sie auf Importieren klicken.</li>
	<li>Nachdem die Datei importiert wurde, ist arivis nun bereit, ein Video der Zeitrafferbilder zu rendern. Klicken Sie auf den 4D Viewer Cube in der unteren linken Ecke und das Scale Bar-Symbol (Abbildung 4D-E). Klicken Sie auf das Videosymbol, um die Storyboard-Taskleiste an den unteren Bildschirmrand zu bringen (Abbildung 4C).</li>
	<li>Wählen Sie in der Storyboard-Taskleiste Keyframe-Sequenz hinzufügen aus (Abbildung 4F). Geben Sie die Dauer des Videos in Sekunden an, deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Drehung erstellen und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitverlauf verwenden, um die spezifischen Zeitpunkte in das Video aufzunehmen. Die Software zeigt diese Parameter rechts neben der Storyboard-Taskleiste an, um jederzeit Anpassungen vornehmen zu können. Speichern Sie das Storyboard, um dieselben Parameter auf mehrere Bildsätze anzuwenden (Abbildung 4F).</li>
	<li>Klicken Sie auf Film exportieren , um ein Video der Zeitrafferbildgebung zu speichern (Abbildung 4F). Geben Sie die Filmexporteinstellungen an, einschließlich Dateiname und Speicherort, Videoformat (.mp4), Videoauflösung (1.080 p), Bildrate (60 FPS) und Datenauflösung (1.297 x 1.297 x 784). Fügen Sie hier bei Bedarf Zeitstempel hinzu. Sobald diese Parameter gesetzt sind, wählen Sie Record (Aufzeichnung ) (Abbildung 4F).</li>
	<li>Die Schritte 3.4 und 3.5 können mit einer Änderung an Schritt 3.4 wiederholt werden, um Rotationsvideos zu bestimmten Zeitpunkten zu erstellen. Wenn Sie dem Storyboard eine Keyframe-Sequenz hinzufügen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Drehung erstellen , und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitprogression verwenden. Befolgen Sie dann die gleichen Anweisungen wie in Schritt 3.5.</li>
	<li>Um ein hochauflösendes Bild in beliebiger Ausrichtung zu einem beliebigen Zeitpunkt zu rendern, wählen Sie das Kamerasymbol im 4D-Viewer, um ein hochauflösendes Bild zu erhalten (Abbildung 4C).</li>
	<li>Um eine Pipeline für die Analyse zu erstellen, wählen Sie das Flask-Symbol , um auf das Bedienfeld "Analyse " zuzugreifen (Abbildung 4B). Klicken Sie im Bedienfeld Analyse auf das Dropdown-Menü Analysevorgänge. Als Beispiel veranschaulicht das Protokoll im Folgenden die Reihenfolge der Vorgänge für eine Volumenanalysepipeline. Führen Sie jeden Schritt der Pipeline einzeln aus oder machen Sie ihn rückgängig, um die einzelnen Parameter zu optimieren (Tabelle 1).</li>
	<li>Klicken Sie auf das blaue Dreieck oben in der Pipeline, damit die Pipeline ausgeführt werden kann. HINWEIS: Dies dauert je nach Geschwindigkeit des Computers einige Zeit. Sobald die Pipeline optimiert wurde, kann die Pipeline problemlos exportiert und nach arivis importiert und in einer Batch-Analyse auf mehrere Datensätze angewendet werden.</li>
	<li>Um auf die Chargenanalyse zuzugreifen, klicken Sie auf der Registerkarte Analyse auf Chargenanalyse. </li>
	<li>Nachdem die Pipeline ausgeführt wurde, wird ein Fenster mit allen gefundenen Objekten angezeigt. Greifen Sie manuell über das Tabellensymbol darauf zu (Abbildung 4B). Klicken Sie oben in diesem Fenster auf das Feld Feature-Spalten , um eine Liste der Features aufzurufen, die Informationen über das Objekt von Interesse bereitstellen können. Für die Analyse des Augenfeldvolumens umfassen diese Funktionen Oberfläche, Volumen (Volumen, VoxelCount), Intensitäten #1 (Mittelwert), Attribute (ID, Typ) und Zeitpunkt (Erste). Klicken Sie auf Exportieren , um die Daten in eine Tabelle zu exportieren.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

In diesem Protokoll wurde das Lightsheet-Mikroskop verwendet, um Zeitraffer-Bildgebung der Augenentwicklung durchzuführen und die resultierenden Daten wurden analysiert. Der resultierende Datensatz kann wertvolle Einblicke in den Prozess der Augenmorphogenese sowie Störungen dieses Prozesses infolge genetischer Mutationen, Exposition gegenüber pharmakologischen Wirkstoffen oder anderen experimentellen Parametern liefern. Hier demonstrierte das Protokoll, wie dieser Datensatz erhalten werden kann und lieferte ein Beispiel dafür, wie das Volumen des Augenfeldes durch frühe Entwicklung analysiert werden kann. Diese Daten erwiesen sich als reproduzierbar und konsistent (weniger als 10% Variation des Volumens) über biologische Replikate hinweg, wobei zu berücksichtigen ist, dass geringfügige Unterschiede in der Staging-Phase des Embryos vor Beginn des Durchlaufs zu einer gewissen Variation der endgültigen Volumenmessungen führen können.
Bei der anfänglichen Positionierung des Embryos in der Kapillare und bei der Positionierung des eingebetteten Embryos vor dem Ziel ist Vorsicht geboten. Die Orientierung spielt eine wichtige Rolle, um zu verhindern, dass der Embryo wächst und sich aus der Sicht des Ziels bewegt. Die Embryonen haben eine runde Form bei 10 hpf, was es schwierig macht, eine bestimmte Orientierung in der Kapillare zu gewährleisten. Idealerweise wird der Körper des Embryos seitlich in der Kapillare positioniert. Das Laden mehrerer Embryonen in die Kapillare erhöht die Wahrscheinlichkeit, einen gut positionierten Embryo zu haben.
Bei diesem Verfahren wird der Embryo in Agarose eingebettet, um ihn vor den Bildgebungs- und Beleuchtungszielen zu suspendieren. Die Wahl der richtigen Konzentration der Agarose mit niedriger Schmelztemperatur ist von entscheidender Bedeutung. Eine zu hohe Konzentration wird den Embryo einengen und verhindern, dass er sich richtig entwickelt; Eine zu geringe Konzentration führt dazu, dass die Agarose auseinanderfällt und den Embryo nicht hält. Die für dieses Protokoll optimale Konzentration ist eine Endkonzentration von 1% niedriger SchmelztemperaturAgarose 30,31.
Ein weiteres Element, das berücksichtigt werden sollte, ist der Sättigungsgrad. Wenn das Augenfeld wächst und sich differenziert, verstärkt sich die Stärke des Rx3:GFP-Signals. Daher sollten bei der Einstellung der anfänglichen Bildgebungsparameter die Belichtung und die Laserleistung reduziert werden, um das Bild zu untersättigen. Dadurch wird verhindert, dass das Bild übersättigt wird, da der Rx3:GFP im Laufe der Zeit heller wird. Es können Änderungen vorgenommen werden, um die Untersättigung in der Bildverarbeitung zu korrigieren, aber die Übersättigung kann nicht korrigiert werden, nachdem die Bilder aufgenommen wurden.
Es gibt einige zusätzliche Änderungen, die an diesem Protokoll vorgenommen werden können, die für einige Projekte, die in diesem Dokument nicht beschrieben werden, von Vorteil sein können. Beispielsweise ist es möglich, Multiview Imaging in der Bilderfassung einzurichten. Dieser Parameter würde es ermöglichen, mehrere Embryonen an verschiedenen Positionen entlang der y-Achse in jedem Zeitintervall sequentiell abzubilden. Während es den Datensatz komplexer macht, würde es die Rate der Datenerfassung erhöhen. Darüber hinaus ist es in Bezug auf die Bildverarbeitung möglich, das Augenfeld durch andere Parameter zu quantifizieren. Hier haben wir beschrieben, wie man die Daten in Bezug auf das Augenfeldvolumen quantifizieren kann. Alternativ könnte eine Pipeline erstellt werden, um einzelne Zellen zu quantifizieren und zu verfolgen oder die Rate der optischen Vesikelevagination zu bestimmen.
Wie bereits erwähnt, wurden sowohl konfokale als auch Lightsheet-Mikroskopie verwendet, um Zeitraffer-Bildgebungsstudien von Zebrafischen durchzuführen. Lightsheet wurde speziell für dieses Projekt ausgewählt, da es eine überlegene Fähigkeit hat, durch eine dicke (>1 mm) Probe zu fotografieren, weil es mit einer Inkubationseinheit ausgestattet ist, um eine ideale Temperaturumgebung für den Zebrafischembryo aufrechtzuerhalten, und weil seine Fähigkeit, schneller als die konfokale Mikroskopie abzubilden, eine Bildaufnahme in den zahlreichen Zeitintervallen ermöglicht, die für dieses Protokoll erforderlich sind, keine begleitende Beschädigung oder Photobleiche des Embryos21, 22,23,24,25,26,27,28,29,30,31. Es ist auch wichtig zu beachten, dass das Lightsheet-Mikroskop so ausgestattet ist, dass es das Signal von mehreren Fluorophoren abbildet. Das in dieser Studie verwendete Lightsheet-Mikroskop verfügt über Festkörperlaser-Anregungslinien bei 405, 445, 488, 515, 561 und 638 nm, die für die Abbildung transgener Embryonen nützlich sein könnten, die mehr als ein fluoreszierendes Reportertransgen exprimieren.
Während dieses Protokoll Anweisungen für die Bildaufnahmeanalyse speziell mit dem Lightsheet Z.1 Dual Illumination Microscope System und der arivis Vision4D-Analysesoftware enthält, gibt es andere kommerziell erhältliche Lightsheet-Mikroskope von Leica, Olympus und Luxendo sowie Bildanalysesoftware von Imaris, mit denen ähnliche Ergebnisse erzielt werden können. Die Auswahl der Ausrüstung und Software für dieses Protokoll wurde durch die Verfügbarkeit in unserem Institut bestimmt.
Zusammenfassend wird erwartet, dass dieses Protokoll einen soliden Ausgangspunkt für die Durchführung von Zeitrafferbildern mit Lightsheet-Mikroskopie und für die Bildquantifizierung der frühen Augenentwicklung bei Zebrafischen bieten wird.

Die Embryonalentwicklung ist ein komplexer Prozess, der die präzise Koordination vieler verschiedener Ereignisse erfordert. Die Bildung des Wirbeltierauges beginnt im sich entwickelnden Vorderhirn, wo ein Teil der Zellen als Augenfeld spezifiziert ist. Diese Zellen evaginalieren in Richtung des Oberflächenektoderms, wodurch zwei bilaterale optische Vesikelentstehen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10. Der Kontakt mit dem Oberflächenektoderm induziert dann eine Invagination des optischen Vesikels in einen optischen Becher. Das Oberflächenektoderm führt zu den vorderen Strukturen des Auges, wie der Linse und der Hornhaut, während der Sehbecher die neuronale Netzhaut und das retinale pigmentierte Epithel 1,2,3,5,6,7,8,9,10,11,12 hervorbringt. . Störungen in diesem Prozess können zu angeborenen Defekten wie Mikrophthalmie, Anaphthalmie und Kolobom (MAC) führen. Derzeit gibt es keine Möglichkeiten, diese Mängelzu beheben 3,5,6,7,9,10,11,12. Weitere Studien zu den Mechanismen der Augenmorphogenese und den Problemen, die zu MAC führen können, werden eine Wissensgrundlage liefern, die möglicherweise zu Behandlungen führen wird. Ein leistungsfähiges Werkzeug, um das dynamische Verhalten von Zellen während der Augenentwicklung zu untersuchen, ist die Zeitraffer-Bildgebung, mit der dieser Prozess in vivo und in Echtzeit visualisiert und charakterisiert werden kann.
Zebrafische (Danio rerio) sind ein hervorragendes Modell, um die frühe Augenentwicklung mit Hilfe der Zeitrafferbildgebung zu visualisieren. Sie haben ein hochkonserviertes Wirbeltierauge und besitzen die Fähigkeit, sich schnell und äußerlich zu entwickeln, während sie optisch transparentbleiben 1. Zebrafische bieten aufgrund dieser Eigenschaften, die Säugetiermodellen fehlen, eine großartige Ressource für die Zeitrafferbildgebung. Zeitraffer-Bildgebungsstudien zur Entwicklung von Zebrafischaugen werden durch die Verwendung der transgenen Zebrafischlinie Tg(rx3:GFP)13 erheblich erleichtert. Rx3 (Retinal homeobox protein 3) ist ein Transkriptionsfaktor, der für die Augenentwicklung essentiellist 14. Rx3 ist das erste der drei rx-Gene im Zebrafisch, das exprimiert wird, beginnend mit seiner Expression in der Mitte der Gastrulation, etwa 8 h nach der Befruchtung (hpf)15,16. Das rx3:GFP-Transgen kann im sich entwickelnden Vorderhirn ab dem 1-Somite-Stadium (ss), ca. 10 hpf 15,17,18,19,20, sichtbar gemacht werden. Im sich entwickelnden Vorderhirn markiert die rx3: GFP-Expression die Zellen des einzelnen Augenfeldes, und GFP (grün fluoreszierendes Protein) wird weiterhin durch den Rest der Augenmorphogenese exprimiert. Die hochauflösende Zeitrafferbildgebung der rx3: GFP-Expression ermöglicht es uns daher, das einzelne Augenfeld durch die Zeit zu verfolgen, während es sich zur Netzhaut17,18,20 entwickelt.
Zeitraffer-Bildgebungsstudien zur Entwicklung von Zebrafischen wurden hauptsächlich mit konfokaler oder Lightsheet-Mikroskopie durchgeführt. Die konfokale Mikroskopie ist insofern von Vorteil, als sie die präzise Abbildung von Proben entlang der z-Achse ermöglicht und das fluoreszierende Hintergrundsignal reduziert. Es ist jedoch begrenzt durch die Zeit, die benötigt wird, um ein Bild aufzunehmen, die Steifigkeit der Probenposition und seine Neigung zum Photobleichen und zur Phototoxizität lebender Proben. Die Lightsheet-Mikroskopie ist eine ideale Methode zur Abbildung der okulären Morphogenese im Laufe der Zeit aufgrund ihrer Fähigkeit, dickere Proben für die Fluoreszenzbildgebung zu durchdringen, erhöhte Flexibilität in der Probenorientierung, minimierte Photobleiche und Phototoxizität und Bildgebung mit hoher Geschwindigkeit 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30 ,31. Die mit aktuellen Lichtblatt-Mikrokopiersystemen erreichbare räumliche Auflösung beträgt ca. 250-500 Nanometer (nm). Obwohl sich dies nicht wesentlich von dem unterscheidet, was mit konfokaler Mikroskopie erreicht werden kann, kann die Probe frei gedreht und aus mehreren Winkeln abgebildet werden, was sowohl die Bildgebungstiefe als auch die Auflösung verbessert und eine viel größere Flexibilität für In-vivo-Zeitraffer-Bildgebungsexperimente bietet als die konfokale Plattform27,32 . Aus diesen Gründen wird die Lightsheet-Mikroskopie schnell zur bevorzugten Methode für Zeitraffer-Bildgebungsstudien der Zebrafischentwicklung. Dieses Protokoll beschreibt die Schritte zur Quantifizierung der Okkulologenese durch die Bildgebung von Rx3:GFP transgenen Zebrafischen mit einem kommerziell erhältlichen Lightsheet-Mikroskop33 und beschreibt eine Pipeline für die Bildanalyse mit der arivis Softwareplattform.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>60mL Syringe Luer-Lok Tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309653</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose, Low Melting Temperature</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V2111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>arivis Vision4D Software</td>
			<td>arivis</td>
			<td>https://www.arivis.com/en/imaging-science/arivis-vision4d</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumoxel N3C Forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>0203-N3C-PO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E3 fish buffer (5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary &#8211; Size 2 (~1mm)</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Black/701904</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heidelberger Extension Line 100cm</td>
			<td>B. Braun</td>
			<td>4097262</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light &#38; Filter Set &#8211; Royal Blue</td>
			<td>Night Sea</td>
			<td>SFA-LFS-RB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish (100 x 15 mm)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25384-302</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope Fluorescence Adapter</td>
			<td>NightSea</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon Tipped Plunger &#8211; Size 2</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>#701997</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tg(rx3:GFP) zebrafish</td>
			<td></td>
			<td>This line was established by Rembold et al.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine (MS222)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A-5040</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z.1 Lightsheet</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zen Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/microscope-software/zen.html</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing ocular morphogenesis by lightsheet microscopy using rx3:gfp transgenic zebrafish

Die Entwicklung von Wirbeltierenaugen ist ein komplexer Prozess, der gegen Ende der Embryogastrulation beginnt und die präzise Koordination der Zellmigration, -proliferation und -differenzierung erfordert. Die Zeitraffer-Bildgebung bietet einzigartige Einblicke in das Verhalten von Zellen während der Augenentwicklung, da sie es uns ermöglicht, die Okulogenese in vivo zu visualisieren. Zebrafische sind ein hervorragendes Modell, um diesen Prozess aufgrund ihres hochgradig konservierten Wirbeltierauges und ihrer Fähigkeit, sich schnell und extern zu entwickeln und gleichzeitig optisch transparent zu bleiben, zu visualisieren. Zeitraffer-Bildgebungsstudien zur Entwicklung von Zebrafischaugen werden durch die Verwendung der transgenen Zebrafischlinie Tg(rx3:GFP) erheblich erleichtert. Im sich entwickelnden Vorderhirn markiert die rx3: GFP-Expression die Zellen des einzelnen Augenfeldes, und GFP wird weiterhin exprimiert, wenn das Augenfeld evaginatiert, um ein optisches Vesikel zu bilden, das dann invaginiert, um eine optische Tasse zu bilden. Die hochauflösende Zeitrafferbildgebung der rx3: GFP-Expression ermöglicht es uns daher, das Augenprimordium durch die Zeit zu verfolgen, während es sich zur Netzhaut entwickelt. Die Lightsheet-Mikroskopie ist eine ideale Methode, um die okuläre Morphogenese im Laufe der Zeit abzubilden, da sie dickere Proben für die Fluoreszenzbildgebung durchdringen, Photobleichen und Phototoxizität minimieren und mit hoher Geschwindigkeit abbilden kann. Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von Bildanalysesoftware. Der resultierende Datensatz kann wertvolle Einblicke in den Prozess der Augenmorphogenese sowie in Störungen dieses Prozesses infolge genetischer Mutationen, Exposition gegenüber pharmakologischen Agenzien oder anderen experimentellen Manipulationen liefern.

Der hier angezeigte Datensatz wurde mit dem oben beschriebenen Protokoll abgebildet. Ein Tg(Rx3:GFP)-Embryo wurde beginnend im 1-Somit-Stadium (ss) bis 24 hpf, einem Gesamtzeitraum von 14 h, aufgenommen, wobei die Bilder in Abständen von 5 Minuten aufgenommen wurden. Die Zeitrafferbildgebung ermöglicht eine einfache Auswahl und einen einfachen Vergleich jedes Zeitpunkts, der einen Phänotyp von Interesse zeigt. Abbildung 5 zeigt eine Reihe von hochauflösenden Bildern, die aus dem dorsalen Blickwinkel zu ausgewählten Entwicklungszeitpunkten gerendert wurden. Die in arivis Vision4D ausgeführte Pipeline baut eine Maske, die das sich entwickelnde Auge darstellt, wie es durch Fluoreszenzsignal identifiziert wird. In Abbildung 5 und Videos 1-6 kann die Maske im Vergleich zur fluoreszierenden Darstellung des sich entwickelnden Auges visualisiert werden. Zusätzlich werden in Tabelle 2 die Volumendaten des sich entwickelnden Auges an jedem Bildgebungspunkt angezeigt. Dieser Datensatz enthält den Segmentnamen, die ID, das Volumen in μm 3 und die Voxelzahl, die mittlere Fluoreszenzintensität des Objekts, den Zeitpunkt, zu dem das Objekt identifiziert wurde, und die Oberfläche des Objekts in μm2. Es ist wichtig zu beachten, dass, wenn sich das Augenfeld in zwei optische Vesikel trennt (beginnend mit Timepoint 64), eine dritte Region verbleibt, die Rx3: GFP-positiv im Vorderhirn ist, was zum Hypothalamus38,39,40 beiträgt (Abbildung 5D-M). Dies zeigt sich in den in Tabelle 2 dargestellten Volumendaten (ab Timepoint 71 gelb hervorgehoben) und kann leicht von den optischen Vesikeln getrennt werden, da es im Volumen viel kleiner ist als jedes optische Vesikel.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig01.jpg"> Abbildung 1: Probenvorbereitung. (A) Positionierung der Embryonen in einer Glaskapillare. Der Pfeil zeigt auf einen Embryo in der Kapillare. (B) Kapillar- und Kapillarhalterteile aus Glas. (C) Teilweise montierter Kapillarhalter. (D) Vollständig montierter Kapillarhalter. (E) Lightsheet-Montagekammer. Der Pfeil zeigte die weiße Linie an, mit der der Kapillarhalter ausgerichtet wurde. (F) Kapillarhalter, der ordnungsgemäß im Lichtblatt montiert ist. Der Pfeil zeigt die passenden weißen Linien an, die die richtige Ausrichtung des Kapillarhalters anzeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig02.jpg"> Abbildung 2: Lightsheet-Imaging-Setup. (A) Schalttafel zum Einschalten von Lightsheet, Computer und Inkubationseinheit. Die Zahlen geben die Reihenfolge der Operationen an. (B) Lightsheet-Objektivkammer. (C) Bildgebende Kammer. (D) Spritze und Schläuche, die mit der Bildgebungskammer verbunden werden. (E) Die Bildgebungskammer, die ordnungsgemäß in der Objektivkammer positioniert ist, wobei alle Röhren mit den entsprechenden Anschlüssen rechts verbunden sind. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig03.jpg"> Abbildung 3: Beispielpositionierung . (A) Suchen Sie die Schaltflächen Kapillare und Beispiel suchen in der Zen-Software, wie durch die Pfeile angegeben. (B) Die Positionierung auf der Glaskapillare. Der Pfeil zeigt die Kante der Glaskapillare an, die sich direkt über der Linse des Objektivs befindet. (C) Die Embryosuspension über die Glaskapillare hinaus. Der Pfeil zeigte den Embryo an, der in Agarose unter der Glaskapillare vor der Linse des Objektivs schwebte. (D) Blick auf den Embryo durch das Ziel. (E) Das Bedienfeld von ErgoDrive. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig04.jpg"> Abbildung 4: Wichtige Symbole für die Navigation in arivis Vison4D. In jedem Bereich ist die Symbolfunktion von links nach rechts gekennzeichnet. (a) Öffnen, Speichern, Schließen. (b) Analysebereich, Tabelle Objekte anzeigen, Track-Editor öffnen. (C) Kopieren Sie den aktuellen Viewer-Inhalt als Bild in die Zwischenablage, schalten Sie Lesezeichen ein, Erstellen Sie ein hochauflösendes Bild für die aktuelle Ansicht, Toggle Storyboard. (d) Maßfeld anzeigen, Orientierungskreuz anzeigen, Legende anzeigen, Maßstabsleiste anzeigen. (e) Als 2D-Betrachter anzeigen, als Galerie-Betrachter anzeigen, als 4D-Viewer anzeigen, als Info-Viewer anzeigen, als Projektions-Viewer anzeigen. F) Aktualisieren Sie alle Keyframes, fügen Sie einen Keyframe hinzu, fügen Sie eine Keyframe-Sequenz hinzu, fügen Sie einen Keyframe ein, entfernen Sie alle Keyframes, exportieren Sie den Film, laden Sie das Storyboard, speichern Sie das Storyboard, passen Sie die Zielzeit des gesamten Films an, erster Keyframe, Wiedergabe, Pause, Stopp, letzter Keyframe. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62296/62296fig05.jpg"> Abbildung 5: Hochauflösende Bilder und Augenfeldmasken. (A-M) Eine Reihe von hochauflösenden Bildern, die von den dorsalen Aussichtspunkten aus gerendert wurden; (A'-M') maskiert das Augenfeld für jeden entsprechenden Zeitpunkt. Jeder Bildsatz wird nach dem Zeitpunkt notiert, zu dem er ab Beginn der Bildgebung aufgenommen wurde, und dem entsprechenden Entwicklungsstadium entweder im Somitstadium (ss) oder Stunden nach der Befruchtung (hpf). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/62296fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Video 1: Zeitraffervideo des Tg(rx3:GFP)-Zebrafisch-Embryos von 1 ss-24 hpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video1_timelapse_rx3-GFP_1ss-24hpf%20MED%20RES.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).</a>
Video 2: Zeitraffer-Video des Tg(rx3:GFP)-Zebrafisch-Embryos von 1 ss-24 hpf mit dem von der arivis Vision4D-Pipeline identifizierten Augenfeld. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video2_timelapse_rx3-GFP_eyefieldmask_1ss-24hpf%20MED%20RES.mov" target="_blank">Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).</a> 
Video 3: 360° Drehung eines Tg(rx3:GFP) Zebrafisch-Embryos bei 1 ss. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video3_360-rotation_rx3-GFP_1ss(1).mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).</a> 
Video 4: 360° Drehung einer Tg(rx3:GFP) Zebrafisch Embryo Augenfeldmaske bei 1 SS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video4_360-rotation_rx3-GFP_eyefieldmask_1ss.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).</a> 
Video 5: 360°-Drehung eines Tg(rx3:GFP)-Zebrafischembryos bei 24 hpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video5_360-rotation_rx3-GFP_24hpf.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).</a> 
Video 6: 360° Drehung einer Tg(rx3:GFP) Zebrafisch Embryo Augenfeldmaske bei 24 Hpf. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Video6_360-rotation_rx3-GFP_eyefieldmask_24hpf.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie mit der rechten Maustaste hier, um das Video herunterzuladen (Link speichern unter).</a> 
Tabelle 1: arivis Vision4D Pipeline zur Volumenanalyse des sich entwickelnden Augenfeldes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Table1%20revised.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Tabelle 2: Volumen und Oberfläche des sich entwickelnden Augenfeldes, aufgenommen von arivis Vision4D. Die Reihen, die sich auf den präsumtiven Hypothalamus beziehen, sind gelb hervorgehoben, um sie von den optischen Vesikeln zu unterscheiden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62296/Table2(2).xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>

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Visualizing Ocular Morphogenesis by Lightsheet Microscopy Using rx3:GFP Transgenic Zebrafish

Hier wird ein Protokoll für die Zeitrafferbildgebung der Augenmorphogenese mit einem handelsüblichen Lightsheet-Mikroskop und einer Bildverarbeitungs-Workstation zur Analyse der resultierenden Daten bereitgestellt. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren für die Anästhesie des Embryos, die Einbettung in Agarose mit niedriger Schmelztemperatur, die Suspension in der Bildgebungskammer, die Einrichtung der Bildgebungsparameter und schließlich die Analyse der Bilddaten mithilfe von Bildanalysesoftware.

Visualisierung der Augenmorphogenese mittels Lightsheet-Mikroskopie mittels rx3:GFP Transgener Zebrafische

Vertebrate eye development is a complex process that begins near the end of embryo gastrulation and requires the precise coordination of cell migration, ...

Unser Protokoll liefert sowohl visuelle als auch Echtzeitinformationen darüber, wie der Prozess der Augenmorphogenese sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen abläuft. Unser Protokoll ermöglicht die schnelle Erfassung von Z-Stacks, wodurch die Zeit zwischen den einzelnen 3D-Bildern im Datensatz verringert wird. Dies bietet eine erhöhte zeitliche Auflösung der Art und Weise, wie die okuläre Morphogenese auftritt.Die Positionierung des Embryos innerhalb der Kapillare kann aufgrund seiner sphärischen Form im Einzelsomitestadium eine Herausforderung darstellen, daher ist es wichtig, mehrere Embryonen in die Kapillare zu laden, um sicherzustellen, dass mindestens einer in der richtigen Ausrichtung ist. Um 10 Stunden nach der Befruchtung auf das Vorhandensein von Somiten zu untersuchen, legen Sie die Embryonen unter ein Stereomikroskop und verwenden Sie einen Fluoreszenzadapter, um das Vorhandensein des rx3:GFP-Transgens zu bestätigen. Sobald drei bis fünf GFP-positive einzelne Somit-Embryonen identifiziert wurden, verwenden Sie eine feine Pinzette, um die Embryonen zu dekorieren.Um die Embryonen in Agarose einzubetten, übertragen Sie die Embryonen in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das 500 Mikroliter E3-Embryopuffer enthält, ergänzt um 168 Mikrogramm pro Milliliter Tricain, und geben Sie 500 Mikroliter gekühlte, aber flüssige 2% Agarose mit niedriger Schmelztemperatur und E3-Puffer mit sanftem Mischen in das Röhrchen. Verwenden Sie eine Ein-Millimeter-Glaskapillare mit einem PTFE-Kolben, um die in Agarose eingebetteten Embryonen in die Kapillare zu ziehen und die Agarose bei Raumtemperatur für 30 bis 60 Sekunden erstarren zu lassen. Legen Sie dann die Kapillare in ein Becherglas aus Tricain-ergänztem E3-Puffer.Um ein Lichtblattmikroskop für die Embryonenbildgebung einzurichten, legen Sie die Kapillare in den Kapillarprobenhalter und klicken Sie auf die Metallscheide in der Mitte der Metallscheibe des Halters. Legen Sie zwei Gummistopfen in die Scheide, wobei die Schlitze den Enden der Scheide zugewandt sind, und schieben Sie die Kapillare durch die Mitte der Gummistopfen. Sobald sich der Marker an der Basis der Metallhülle befindet, verwenden Sie die Metallkappe, um die Kapillare an Ort und Stelle zu befestigen und den Halter mit den weißen Markierungen auf die Oberseite des Mikroskops zu legen.Schließen Sie den Deckel des Probenhalters und klicken Sie auf die Schaltfläche Kapillare suchen in der Benutzeroberfläche der Mikroskopsoftware. Bewegen Sie die Kapillare über das Bedienfeld von Ergo Drive bis knapp über das Objektiv. Drücken Sie nach dem Öffnen des Deckels vorsichtig den Kolben, bis der Agaroseabschnitt, der den Embryo enthält, unter dem Kapillarboden vor dem Objektiv hängt.Deaktivieren Sie Kapillar suchen und klicken Sie auf Probe suchen, um die Ansicht von der Probenkammer-Webcam auf das Mikroskopobjektiv umzuschalten und diese Ansicht zu verwenden, um die Position der Probe genauer einzustellen. Schalten Sie dann die Suchprobe aus und wechseln Sie zur Registerkarte Erfassung. Aktivieren Sie die Kontrollkästchen z-stack und time series.Wählen Sie im Fenster mit den Parametern des Erfassungsmodus die Einstellung für das beidseitige Lichtblatt aus, und aktivieren Sie die Kontrollkästchen für die duale Online-Fusion und das Pivot-Scannen. Klicken Sie auf kontinuierlich, um eine Live-Ansicht des Embryos zu erhalten. Wählen Sie im Fenster des Kanals 488 Kanal und stellen Sie die Laserleistung auf eins und die Belichtungszeit auf 7,5 Millisekunden ein.Verwenden Sie das Bedienfeld von Ergo Drive, um die Position des Embryos anzupassen, bis das Augenfeld direkt zur Kamera zeigt, und passen Sie die linken und rechten Lichtblätter in den Kanalparametern an, bis das Augenfeld ausreichend scharf ist. Stellen Sie die erste und letzte Z-Position etwa 500 Mikrometer über das letzte detektierbare Fluoreszenzsignal hinaus ein und klicken Sie optimal, um die Schrittweite auf 0,477 Mikrometer einzustellen. Um die Inkubationsparameter einzustellen, aktivieren Sie das Kontrollkästchen für die Peltier-Einheit, um die Temperatur bei 28 Grad Celsius zu halten.Wählen Sie im Zeitreihenfenster die entsprechende experimentelle Frequenz und das Zeitintervall aus, um die Bilder zu erfassen. Klicken Sie auf Test starten. Wählen Sie den Ordner aus, in dem der Bildsatz gespeichert werden soll, und legen Sie das Bildpräfix fest, und klicken Sie dann auf Speichern, um das Imaging zu starten.Importieren Sie für die Bildanalyse die Bilddateien in ein geeignetes 4D-Bildanalyse-Softwareprogramm und klicken Sie auf den 4D-Viewer-Würfel, die Maßstabsleiste und das Videosymbol, um die Storyboard-Taskleiste zu öffnen. Wählen Sie Keyframe-Sequenz hinzufügen und geben Sie die Dauer des Videos in Sekunden an. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Drehung erstellen und aktivieren Sie den Zeitverlauf verwenden, um bestimmte Zeitpunkte in das Video aufzunehmen.Speichern Sie das Storyboard, um dieselben Parameter auf mehrere Bildsätze anzuwenden. Klicken Sie auf Film exportieren, um ein Video der Zeitrafferbildgebung zu speichern und die Filmexporteinstellungen anzugeben, einschließlich Dateiname und Speicherort, Videoformat, Videoauflösung, Bildrate und Datenauflösung. Fügen Sie bei Bedarf Zeitstempel hinzu und wählen Sie Datensatz aus.Um Drehvideos zu bestimmten Zeitpunkten zu erstellen, fügen Sie wie gerade gezeigt eine Keyframe-Sequenz hinzu, aktivieren Sie jedoch das Kontrollkästchen Drehung erstellen und deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Zeitfortschritt verwenden. Um ein hochauflösendes Bild in einer beliebigen Ausrichtung und zu einem beliebigen Zeitpunkt zu rendern, wählen Sie das Kamerasymbol im 4D-Viewer aus. Um eine Pipeline für die Analyse zu erstellen, wählen Sie Kolben, um auf das Analysefenster zuzugreifen, und öffnen Sie das Menü Analysevorgänge, um die Reihenfolge der gewünschten Vorgänge auszuwählen.Klicken Sie auf das blaue Dreieck, um die Pipeline zu starten. Klicken Sie am Ende des Laufs im Popupfenster auf Featurespalten, um eine Liste der Features anzuzeigen, die Informationen über das Objekt von Interesse bereitstellen können, und klicken Sie dann auf Exportieren, um die Daten in eine Tabelle zu exportieren. In dieser repräsentativen Analyse wurde ein transgener rx3:GFP-Embryo alle fünf Minuten vom einen Somite-Stadium bis 24 Stunden nach der Befruchtung für insgesamt 14 Stunden vom dorsalen Standpunkt aus abgebildet.Wie beobachtet, erleichterte die Durchführung eines Pipeline-Laufs der aus dieser Analyse aufgenommenen Bilder die Erzeugung einer Maske des sich entwickelnden Auges. Beachten Sie, dass, wenn das Augenfeld in zwei optische Vesikel getrennt wird, eine dritte rx3: GFP-positive Region im Vorderhirn beobachtet werden kann, die zum Hypothalamus beigetragen hat. Diese Information wurde auch in den Volumendaten beobachtet und kann leicht von den optischen Vesikeldaten getrennt werden, da sie im Volumen viel kleiner war als das für beide optischen Vesikel beobachtete.Diesem Verfahren können zusätzliche Analysen folgen, z. B. die Verfolgung einzelner Zellen im gesamten Bilddatensatz.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Ableiten Retinapigmentepithel (RPE) von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) von verschiedenen Größen von Embryoidkörpern

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Tracking-Zellen in GFP-transgenen Zebrafisch Mit dem Photokonvertierbare PSmOrange-System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Analysis of Zebrafish Kidney Development with Time-lapse Imaging Using a Dissecting Microscope Equipped for Optical Sectioning

Analyse von Zebrabärbling Nierenentwicklung mit Zeitraffer-Imaging einem Binokular Mit Ausgerüstet für Optische Schnitte

In order to understand organogenesis, the spatial and temporal alterations that occur during development of tissues need to be recorded. The method ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Mit Lichtblatt Fluoreszenzmikroskopie Bild Zebrabärbling Augenentwicklung

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

Visualisierung der Interrenal- Steroidogenic Gewebe und seine Vascular Mikromilieu in Zebrabärbling

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

Culture of Adult Transgenic Zebrafish Retinal Explants for Live-cell Imaging by Multiphoton Microscopy

Kultur von Adult transgener Zebrafische Retinal Explantate für das Live-Cell-Imaging von Multiphotonen-Mikroskopie

An endogenous regeneration program is initiated by M&#252;ller glia in the adult zebrafish (Danio rerio) retina following neuronal damage and death. The ...

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

Erzeugung von genetisch modifizierten Mäusen durch die Mikroinjektion von Oozyten

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

Korrelative Höchstauflösung und Elektronenmikroskopie Protein Lokalisierung im Zebrafisch Netzhaut zu lösen

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Whole-mount Confocal Microscopy for Adult Ear Skin: A Model System to Study Neuro-vascular Branching Morphogenesis and Immune Cell Distribution

Vollständig-hängen konfokalen Mikroskopie für Erwachsene Ohr Haut: ein Modellsystem, Neuro-vaskuläre Verzweigung Morphogenese und Immunzelle Verteilung zu studieren

Here, we present a protocol of a whole-mount adult ear skin imaging technique to study comprehensive three-dimensional neuro-vascular branching ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...