Name: directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi takker medlemmerne af 502 laboratoriet for deres tekniske støtte og nyttige kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev delvist støttet af Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) og National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).

Denne undersøgelse blev godkendt af den institutionelle etiske komité på Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESC'er blev opnået fra WiCell Research Institute og genetisk manipuleret til tdTomato-mærket cellelinje.
1. Generering af menneskelige RO'er
<ol><li>Kultur hESC'erne under feederfrie forhold.<ol><li>Overtræk en brønd af en 6-brønds plade med 1 ml 0,1 mg / ml reagens A (materialetabel) ved 37 ° C i mindst en halv time efter producentens a...

<ol>
	<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids.">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).</li><li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development.">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution.">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells.">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids.">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients.">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li><li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa.">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).</li><li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration.">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286 (2015).</li></ol>

Retinal organoid differentiering er en ønskelig metode til generering af rigelige funktionelle retinale celler. RO er en sammensætning af forskellige retinale celler, såsom ganglionceller, bipolære celler og fotoreceptorer, genereret af pluripotente stamceller mod den neurale nethinde 4,5,8,9. Selvom sammenflydende RO'er kan høstes, er det tidskrævende, hvilket kan kræve lange dyrkningsp...

Pluripotente stamceller (PSC'er) er kendetegnet ved deres selvfornyelse og evne til at differentiere sig i alle slags somatiske celler. Således er organoider afledt af PSC'er blevet en vigtig ressource inden for forskning i regenerativ medicin. Retinal degeneration er kendetegnet ved tab af fotoreceptorer (stænger og kegler) og retinal pigmentepitel. Udskiftning af retinale celler kan være en opmuntrende behandling af denne sygdom. Det er imidlertid ikke muligt at få humane nethinder til sygdomsforskning og -behandling. Derfor er retinale organoider (RO'er) afledt af PSC'er, som effektivt og med succes rekapitulerer flerlags native retinale celler, gavnlige for grundlæggende og translationel forskning 1,2,3. Vores forskning fokuserer på RO-differentiering for at give tilstrækkelige celler af høj kvalitet til at studere retinal degeneration4.
Metoder til differentiering af RO'er dukker løbende op med tredimensionel (3D) suspensionsdifferentiering, der blev banebrydende af Sasai-laboratoriet i 20125. Vi introducerede CRX-tdTomato-mærket i de humane embryonale stamceller (hESC'er) for specifikt at spore fotoreceptorforløbercellerne og ændrede metoden med tilføjelsen af COCO, en multifunktionel antagonist af Wnt-, TGF-β- og BMP-veje6. COCO har vist sig effektivt at forbedre differentieringseffektiviteten af fotoreceptorprækursorer og kegler 6,7.
Alt i alt har vi ved at ændre den klassiske differentieringsmetode udviklet en tilgængelig protokol til at høste rigelige fotoreceptorforstadier og kegler fra humane RO'er til analyse af nethindesygdommen forbundet med fotoreceptorerne gennem laboratorieundersøgelser og til yderligere klinisk anvendelse / transplantation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COCO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3047-CC-050</td>
			<td>DAN Domain family of BMP antagonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C141905005BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Biological Industry</td>
			<td>04-002-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement-Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3181502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primesurface 96 V-plate</td>
			<td>Sbio</td>
			<td>MS9096SZ</td>
			<td>Cell aggregation in 1.2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrigel in 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5990</td>
			<td>mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent C</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>TrypLE Express in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>DNase I , in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Enzo Life Science</td>
			<td>ALX-270-426-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>organoids dissociation in 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>681669</td>
			<td>Wnt inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells

Retinal celletransplantation er en lovende terapeutisk tilgang, som kan genoprette retinal arkitekturen og stabilisere eller endda forbedre de visuelle evner til den degenererede nethinden. Ikke desto mindre står fremskridt inden for celleudskiftningsterapi i øjeblikket over for udfordringerne ved at kræve en hyldevare med høj kvalitet og standardiserede menneskelige nethinder. Derfor er der brug for en nem og stabil protokol til eksperimenterne. Her udvikler vi en optimeret protokol baseret på en selvorganiserende metode med brug af eksogene molekyler og reagens A samt manuel excision til at generere de tredimensionelle humane nethindeorganoider (RO). Den humane pluripotente stamceller (PSC'er) -afledte RO udtrykker specifikke markører for fotoreceptorer. Med tilsætningen af COCO, en multifunktionel antagonist, øges differentieringseffektiviteten af fotoreceptorprækursorer og kegler signifikant. Den effektive anvendelse af dette system, som har fordelene ved cellelinjer og primære celler, og uden de indkøbsproblemer, der er forbundet med sidstnævnte, kunne producere sammenflydende retinale celler, især fotoreceptorer. Differentieringen af kvikskranker til RO giver således en optimal og biorelevant platform for sygdomsmodellering, lægemiddelscreening og celletransplantation.

Den skematiske illustration viser differentieringsprotokollen for at forbedre forløberceller med COCO (figur 1). Fra PSC til RO'er kan mange detaljer forårsage resultatvariationer. Det anbefales at registrere hvert trin og endda katalognummeret og partinummeret på hvert medium for at spore hele proceduren.
Heri leverer vi lyse feltbilleder til dag 6, 12, 18 og 45 (figur 2). På dag 6 er organoiderne normalt omkring 600 μm i diamet...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Ved hjælp af en selvorganiserende metode udvikler vi en protokol med tilføjelse af COCO, der kan øge dannelsen af fotoreceptorer betydeligt.

Rettet induktion af retinale organoider fra humane pluripotente stamceller

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Dette er en model for retinal sygdom og efterligner in vivo nethinden. Til en vis grad kunne det erstatte dyreforsøg. Protokollen er optimeret til kvaliteten og mængden af fotoreceptorforstadierne i retinale organoider, og fotoreceptoren er nøglen til flere irreversible blindhedstilstande.Begynd med at dyrke de menneskelige embryotiske stamceller eller hESC'er under fødefri forhold. For at gøre det skal du belægge en brønd af en seks-brøndplade med en milliliter 100 mikrogram pr. Milliliter reagens A og inkubere pladen ved 37 grader Celsius i mindst en halv time. Tø en aliquot på en million hESC'er op, og centrifuger den ved 200 xg i fem minutter.Efter fjernelse af supernatanten sås cellerne i den tidligere belagte plade sammen med to milliliter reagens B.Passage cellerne efter at have nået ca. 80% sammenløb på omkring fire dage. Efter at have nået sammenløb, vask cellerne med forvarmet DPBS, og overfør dem til 500 mikroliter frisklavet reagens. Derefter inkuberes cellerne i 3,5 minutter ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid.Fjern cellerne ved at svirpe siden og bunden af pladen i et par sekunder, og tilsæt 500 mikroliter forberedt medium en. Høst de løsrevne celler i et nyt 1,5 milliliter rør, og pipetter cellesuspensionen op og ned. Til celletælling tilsættes 100 mikroliter cellesuspension til 900 mikroliter DPBS.Fortynd de 900 mikroliter af den resterende cellesuspension med medium en i petriskålen for at opnå ni gange 10 til den fjerde kraftceller pr. Milliliter. Tilsæt 100 mikroliter fortyndet cellesuspension til hver brønd af en ikke-klæbende, V-bund, 96-brøndplade. Drej pladen let ned på en lavhastighedsryster i fem minutter, og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid indtil dag to.På dag to tilsættes 20 mikroliter 1% reagens A til hver brønd i 96-brøndspladen og pipetteres to gange i midten for at sprede de døde celler. Rengør bunden af pladen, før den inkuberes ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid indtil dag seks. På dag seks udskiftes 58 mikroliter af mediet med 60 mikroliter frisk medium en, og fortsæt inkubationen.På dag 12 høstes cellepillerne fra 96-brøndspladen i et 15 milliliter konisk rør, og lad pellets sætte sig naturligt i fem minutter ved stuetemperatur. Når pellets sætter sig, fjernes supernatanten uden at forstyrre organoiderne, og celleaggregaterne overføres til en 10 centimeter suspensionsskål indeholdende 18 ml medium to med reagens A.Inkuber skålen ved 37 grader Celsius og 5% kuldioxid indtil dag 18. På dag 18 skal du bekræfte dannelsen af en halvgennemsigtig optisk vesikel i skålen og skære de genererede organoider ved hjælp af en mikrokirurgisk kniv.Saml alle de skårne pellets til midten af skålen. Høst derefter cellerne i et 15 milliliter konisk Falcon-rør. Når cellerne sætter sig, skal du forsigtigt fjerne supernatanten og suspendere pellets i to 10 centimeter petriskåle med 18 ml medium, tre pr. Skål.Overfør forsigtigt opvasken til inkubatoren for at undgå celleaggregering. Fortsæt med at dyrke cellerne, skift mediet ugentligt. Analyser CRX-udtrykket efter dag 45 til dag 120.I denne repræsentative analyse vises forskellige stadier af menneskelig retinal generation. På dag seks optrådte organoider som et aggregat af tætte forbindelser inde i en lys rand med en diameter på omkring 600 mikrometer. På dag 12 fandt den første generation af de optiske vesikellignende strukturer sted.Organoiderne uden ordentlig vesikellignende arkitektur blev kasseret, før de blev dyrket i en petriskål på dag 18. På kulturens dag 30 var den vesikellignende arkitektur mere indlysende, og ringere RO'er kunne let skelnes og fjernes. Fra dag 45 udtrykte organoiderne forskellige markører for fotoreceptorprecursorer, såsom CRX, RCVRN og OTX2.Ved at spalte de overlegne retinale organoider forbedres differentieringseffektiviteten betydeligt, og mere end 100 overlegne organoider fra 96 plader kunne høstes.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolation, karakterisering og sammenlignende differentiering af humane Dental Pulp stamceller fra blivende tænder ved hjælp af to forskellige metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berigelse for kemoterapi kræft i æggestokkene stamceller fra humane cellelinier

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generation af induceret pluripotente stamceller fra Muskelsvindfonden Patienter: Effektiv Integration-fri Omprogrammering af urin afledte celler

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studere i bugspytkirtlen Kræft stamceller Karakteristik for udvikling af nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Induktion af accelereret åreforkalkning i Mus: Den "Wire-Skade" Model

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Hurtig og effektiv Generation af rekombinant human pluripotente stamceller ved rekombinase-medieret Cassette Exchange i<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolininduceret Hævelse i Intestinal Organoids: An<em&gt; In vitro</em&gt; Assay for Vurdering Drug respons i patienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo ekspansion af hæmatopoietisk stamceller fra menneskelige navlestrengen blod-afledte CD34+ celler ved hjælp af valproinsyre

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induktion og analyse af oxidativ stress i tornerose Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epitelceller

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...