Name: directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

502研究室のメンバーの技術サポートと原稿に関する有益なコメントに感謝します。この研究の一部は、北京市自然科学基金会(Z200014)および中国国家重点研究開発プログラム(2017YFA0105300)の支援を受けました。

この研究は、首都医科大学北京同仁病院の施設倫理委員会によって承認されました。H9 hESCはWiCell研究所から入手し、tdTomatoタグ付き細胞株に遺伝子操作しました。
1. ヒトROの生成
<ol><li>フィーダーフリー条件下でhESCを培養します。<ol><li>6ウェルプレートの1ウェルに1 mLの0.1 mg/mL試薬A(材料表)を37°Cでコーティングし、製造元の指示に従って少なくとも30分間?...

<ol>
	<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids.">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).</li><li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development.">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution.">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells.">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids.">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients.">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li><li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa.">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).</li><li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration.">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286 (2015).</li></ol>

網膜オルガノイドの分化は、十分な機能的な網膜細胞を生成するための望ましい方法です。このROは、神経網膜に向かう多能性幹細胞によって生成される神経節細胞、双極細胞、および光受容体などの異なる網膜細胞の複合体である4、5、8、9。コンフルエントなROを採取することはできますが、?...

多能性幹細胞(PSC)は、自己複製とあらゆる種類の体細胞への分化能力を特徴としています。このように、PSC由来のオルガノイドは再生医療研究において重要な資源となっています。網膜変性は、光受容体(桿体および錐体)および網膜色素上皮の喪失を特徴とする。網膜細胞置換は、この病気の有望な治療法になる可能性があります。しかし、疾患の研究や治療のためにヒト網膜を入手することは現実的ではありません。したがって、多層の天然網膜細胞を効果的かつ首尾よく再現するPSC由来の網膜オルガノイド(RO)は、基礎研究およびトランスレーショナル研究に有益です1,2,3。私たちの研究は、網膜変性を研究するための十分で質の高い細胞を提供するためにRO分化に焦点を当てています4。
ROを微分する方法は絶えず出現しており、2012年に笹井研究室によって3次元(3D)懸濁液分化が開拓されました5。ヒト胚性幹細胞(hESC)にCRX-tdTomatoタグを導入して視細胞前駆細胞を特異的に追跡し、Wnt、TGF-β、およびBMP経路の多機能アンタゴニストであるCOCOを添加して方法を変更しました6。COCOは、光受容体前駆体および錐体の分化効率を効率的に改善することが示されている6、7。
全体として、古典的な分化法を変更することにより、ヒトROから豊富な光受容体前駆体および錐体を収集し、実験室での調査を通じて光受容体に関連する網膜疾患を分析し、さらなる臨床応用/移植を行うためのアクセス可能なプロトコルを開発しました。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COCO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3047-CC-050</td>
			<td>DAN Domain family of BMP antagonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C141905005BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Biological Industry</td>
			<td>04-002-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement-Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3181502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primesurface 96 V-plate</td>
			<td>Sbio</td>
			<td>MS9096SZ</td>
			<td>Cell aggregation in 1.2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrigel in 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5990</td>
			<td>mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent C</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>TrypLE Express in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>DNase I , in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Enzo Life Science</td>
			<td>ALX-270-426-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>organoids dissociation in 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>681669</td>
			<td>Wnt inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells

網膜細胞移植は有望な治療アプローチであり、網膜構造を回復し、変性した網膜の視覚能力を安定または改善する可能性があります。それにもかかわらず、細胞補充療法の進歩は現在、高品質で標準化されたヒト網膜の既製の供給源を必要とするという課題に直面しています。したがって、実験には簡単で安定したプロトコルが必要です。ここでは、外因性分子と試薬Aを用いた自己組織化法と、3次元ヒト網膜オルガノイド(RO)を作製するための手動切除法に基づいて、最適化されたプロトコルを開発します。ヒト多能性幹細胞(PSC)由来のROは、光受容体に特異的なマーカーを発現します。多機能アンタゴニストであるCOCOを添加すると、視細胞前駆体および錐体の分化効率が大幅に向上します。細胞株と初代細胞の利点を持ち、後者に関連する調達の問題なしに、このシステムを効率的に使用することで、コンフルエントな網膜細胞、特に光受容体を生成することができます。したがって、PSCからROへの分化は、疾患モデリング、薬物スクリーニング、および細胞移植のための最適で生物学的に関連するプラットフォームを提供します。

模式図は、COCOで前駆細胞を改善するための分化プロトコルを示しています(図1)。PSCからROまで、多くの詳細が結果のばらつきを引き起こす可能性があります。手順全体を追跡するために、すべてのステップ、さらにはすべての媒体のカタログ番号とロット番号を記録することをお勧めします。
ここでは、6、12、18、および45日目の明視野画像を提供?...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

自己組織化法を用いて、光受容体の生成を大幅に増加させる可能性のあるCOCOを添加したプロトコルを開発します。

ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

これは網膜疾患のモデルであり、生体内網膜をエミュレートします。ある程度、それは動物実験に取って代わる可能性があります。このプロトコルは、網膜オルガノイド中の光受容体前駆体の質と量に最適化されており、光受容体はいくつかの不可逆的な失明状態の鍵となります。まず、ヒト胚性幹細胞(hESC)をフィーダーフリー条件下で培養します。これを行うには、6ウェルプレートの1ウェルに1ミリリットルの試薬Aあたり1ミリリットルの100マイクログラムをコーティングし、プレートを摂氏37度で少なくとも30分間インキュベートします。100万hESCのアリコートを解凍し、200 xgで5分間遠心分離します。上清を除去した後、約4日で約80%のコンフルエントに達した後、2ミリリットルの試薬B.Passageとともに、細胞を以前にコーティングしたプレートに播種します。コンフルエントに達した後、予熱したDPBSで細胞を洗浄し、500マイクロリットルの新たに調製した試薬に移します。次に、摂氏37度と5%二酸化炭素で3.5分間細胞をインキュベートします。プレートの側面と底面を数秒間フリックして細胞を剥離し、500マイクロリットルの準備した培地を加えます。剥離した細胞を新しい1.5ミリリットルのチューブに回収し、細胞懸濁液を上下にピペットで固定します。細胞計数のために、900マイクロリットルのDPBSに100マイクロリットルの細胞懸濁液を加える。残りの細胞懸濁液の900マイクロリットルをペトリ皿内の培地1で希釈して、ミリリットルあたり9倍の10〜4パワーセルを達成します。100マイクロリットルの希釈細胞懸濁液を、非接着性のV底96ウェルプレートの各ウェルに加える。低速シェーカーでプレートを5分間軽く回転させ、摂氏37度、二酸化炭素5%で2日目までインキュベートします。2日目に、96ウェルプレートの各ウェルに20マイクロリットルの1%試薬Aを加え、中央で2回ピペットで死細胞を散布します。プレートの底をきれいにしてから、摂氏37度と5%の二酸化炭素で6日目までインキュベートします。6日目に、58マイクロリットルの培地を60マイクロリットルの新しい培地1と交換し、インキュベーションを続けます。12日目に、15ミリリットルのコニカルチューブ内の96ウェルプレートから細胞ペレットを回収し、ペレットを室温で5分間自然に沈降させます。ペレットが落ち着いたら、オルガノイドを乱すことなく上清を取り除き、細胞凝集塊を試薬Aを含む18ミリリットルの培地2を含む10センチメートルの懸濁皿に移し、18日目まで摂氏37度、二酸化炭素5%で培養します。18日目に、ディッシュ内の半透明視神経小胞の生成を確認し、マイクロサージカルナイフを用いて生成したオルガノイドを切断した。カットしたペレットをすべて皿の中央に集約します。次に、細胞を15ミリリットルの円錐形のファルコンチューブに収穫します。細胞が落ち着いたら、上清を静かに取り除き、1皿あたり3つずつ、18ミリリットルの培地を入れた2つの10センチメートルペトリ皿にペレットを再懸濁します。細胞凝集を避けるために皿をインキュベーターにそっと移します。細胞を培養し続け、毎週培地を交換します。45日目から120日目までのCRX発現を分析します。この代表的な解析では、ヒト網膜生成の様々な段階が表示される。6日目に、オルガノイドは直径約600マイクロメートルの明るい縁の内側に密集した接続の集合体として現れました。12日目に、視神経小胞様構造の初期生成が起こった。適切な小胞様構造を持たないオルガノイドは、18日目にペトリ皿で培養する前に廃棄されました。培養の30日目までに、小胞のような構造はより明白になり、劣ったROは簡単に区別して除去することができました。45日目から、オルガノイドはCRX、RCVRN、OTX2などの光受容体前駆体のさまざまなマーカーを発現しました。優れた網膜オルガノイドを切断することにより、分化効率が大幅に向上し、96枚のプレートから100を超える優れたオルガノイドを回収することができました。

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

ヒト前立腺癌サンプルからがん幹細胞の単離

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

ヒト細胞株から化学療法抵抗性の卵巣がん幹細胞の濃縮

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

筋ジストロフィー患者から人工多能性幹細胞の生成：尿由来細胞の効率的な統合·フリーリプログラミング

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

新しい治療戦略を開発するための膵臓癌幹細胞特性を研究

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

マウスにおける加速アテローム性動脈硬化症の誘導:ワイヤー傷害モデル

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

中リコンビナーゼ媒介カセット交換による組換えヒト多能性幹細胞の迅速かつ効率的な生成<em&gt; AAVS1</em&gt;軌跡

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

フォルスコリン誘発性腸オルガノイドに腫れ：<em&gt;インビトロ</em&gt;アッセイ嚢胞性線維症患者における薬物反応を評価するための

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

ひと臍帯血由来 cd34 陽性造血幹細胞の体外増幅+細胞を用いたバルプロ酸

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

睡眠美容トランスポゾントランスポゾントランスフェクトヒト網膜色素上皮細胞における酸化ストレスの誘導と分析

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...