Name: directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00
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원고에 대한 기술 지원과 유용한 의견을 주신 502 연구소 회원들에게 감사드립니다. 이 연구는 Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014)과 National Key R & D Program of China (2017YFA0105300)의 지원을 부분적으로 받았습니다.

이 연구는 수도 의과 대학 베이징 퉁렌 병원의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. H9 hESC는 WiCell 연구소에서 얻었으며 td토마토 태그가 부착된 세포주로 유전자 조작되었습니다.
1. 인간 RO의 생성
<ol><li>피더가 없는 조건에서 hESC를 배양합니다.<ol><li>6웰 플레이트의 한 웰을 1mL의 0.1mg/mL 시약 A(재료 표)로 37°C에서 제조업체의 지침에 따라 최소 30분 동안 코팅합...

<ol>
	<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids.">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).</li><li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development.">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution.">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells.">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids.">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients.">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li><li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa.">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).</li><li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration.">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286 (2015).</li></ol>

망막 오가노이드 분화는 충분한 기능성 망막 세포의 생성을 위한 바람직한 방법이다. RO는 신경절 세포, 양극성 세포 및 광 수용체와 같은 다양한 망막 세포의 복합체로, 신경 망막 4,5,8,9쪽으로 다 능성 줄기 세포에 의해 생성됩니다. 합류 RO를 수확할 수 있지만 시간이 많이 걸리므로 긴 배양 기간(최?...

만능 줄기 세포 (PSC)는자가 재생과 모든 종류의 체세포로 분화하는 능력이 특징입니다. 따라서 PSC에서 파생된 오가노이드는 재생 의학 연구에서 중요한 자원이 되었습니다. 망막 변성은 광 수용체 (막대 및 원뿔)와 망막 색소 상피의 손실을 특징으로합니다. 망막 세포 대체는이 질병에 대한 고무적인 치료법이 될 수 있습니다. 그러나 질병 연구 및 치료를 위해 인간 망막을 얻는 것은 불가능합니다. 따라서 다층 천연 망막 세포를 효과적이고 성공적으로 재현하는 PSC에서 파생된 망막 오가노이드(RO)는 기초 및 중개 연구에 유익합니다1,2,3. 우리의 연구는 망막 변성4를 연구하기에 충분하고 양질의 세포를 제공하기 위해 RO 분화에 중점을 둡니다.
RO를 차별화하는 방법은 2012 년 Sasai 실험실에서 개척 한 3 차원 (3D) 서스펜션 차별화와 함께 지속적으로 등장하고 있습니다5. 광수용체 전구체 세포를 특이적으로 추적하기 위해 인간 배아 줄기세포(hESC)에 CRX-tdTomato 태그를 도입하고 Wnt, TGF-β 및 BMP 경로6의 다기능 길항제인 COCO를 추가하여 방법을 수정했습니다. COCO는 광수용체 전구체 및 원뿔 6,7의 분화 효율을 효율적으로 향상시키는 것으로 나타났습니다.
전체적으로 고전적인 분화 방법을 수정함으로써 실험실 조사를 통해 광 수용체와 관련된 망막 질환을 분석하고 추가 임상 적용 / 이식을 위해 인간 RO에서 풍부한 광 수용체 전구체 및 원뿔을 수확하는 접근 가능한 프로토콜을 개발했습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COCO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3047-CC-050</td>
			<td>DAN Domain family of BMP antagonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C141905005BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Biological Industry</td>
			<td>04-002-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement-Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3181502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primesurface 96 V-plate</td>
			<td>Sbio</td>
			<td>MS9096SZ</td>
			<td>Cell aggregation in 1.2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrigel in 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5990</td>
			<td>mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent C</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>TrypLE Express in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>DNase I , in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Enzo Life Science</td>
			<td>ALX-270-426-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>organoids dissociation in 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>681669</td>
			<td>Wnt inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells

망막 세포 이식은 망막 구조를 복원하고 퇴화 된 망막의 시각 능력을 안정화 시키거나 향상시킬 수있는 유망한 치료 접근법입니다. 그럼에도 불구하고 세포 대체 요법의 발전은 현재 고품질의 표준화 된 인간 망막의 기성품 공급원을 요구하는 문제에 직면 해 있습니다. 따라서 실험을 위해서는 쉽고 안정적인 프로토콜이 필요합니다. 여기에서 우리는 외인성 분자와 시약 A를 사용하는 자가 조직화 방법과 3차원 인간 망막 오가노이드(RO)를 생성하기 위한 수동 절제를 기반으로 최적화된 프로토콜을 개발합니다. 인간 만능 줄기 세포 (PSC) 유래 RO는 광 수용체에 대한 특정 마커를 발현합니다. 다기능 길항제 인 COCO를 첨가하면 광 수용체 전구체 및 원뿔의 분화 효율이 크게 증가합니다. 세포주와 일차 세포의 이점이 있고 후자와 관련된 소싱 문제 없이 이 시스템을 효율적으로 사용하면 합류성 망막 세포, 특히 광수용체를 생성할 수 있습니다. 따라서, RO로의 PSC의 분화는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 세포 이식을 위한 최적의 생체관련성 플랫폼을 제공한다.

개략도는 COCO로 전구체 세포를 개선하기 위한 분화 프로토콜을 보여줍니다(그림 1). PSC에서 RO에 이르기까지 수많은 세부 사항으로 인해 결과 변동이 발생할 수 있습니다. 전체 절차를 추적하기 위해 모든 단계와 모든 매체의 카탈로그 번호 및 로트 번호를 기록하는 것이 좋습니다.
여기에서는 6일, 12일, 18일 및 45일에 대한 명시야 이미지를 제공합니다(<st...

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Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

자기 조직화 방법을 사용하여 광 수용체의 생성을 크게 증가시킬 수있는 COCO를 첨가 한 프로토콜을 개발합니다.

인간 만능 줄기 세포에서 망막 오가노이드의 지시 유도

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

이것은 망막 질환에 대한 모델이며 생체 내 망막을 모방합니다. 어느 정도까지는 동물 실험을 대체 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 망막 오가노이드에서 광수용체 전구체의 품질과 양에 최적화되어 있으며, 광수용체는 여러 비가역적 실명 상태의 핵심입니다.피더가 없는 조건에서 인간 배아 줄기 세포 또는 hESC를 배양하는 것으로 시작합니다. 그렇게 하려면 6웰 플레이트의 한 웰을 시약 A 밀리리터당 100마이크로그램 1밀리리터로 코팅하고 플레이트를 섭씨 37도에서 최소 30분 동안 배양합니다. 백만 hESC의 분취량을 해동하고 200xg에서 5분 동안 원심분리합니다.상청액을 제거한 후, 2 밀리리터의 시약 B와 함께 이전에 코팅 된 플레이트에 세포를 시드합니다. 약 4 일에 약 80 % confluency에 도달 한 후 세포를 계대 히십시오. 컨플루언스에 도달하면 예열 된 DPBS로 세포를 세척하고 500 마이크로 리터의 새로 준비된 시약으로 옮깁니다. 그런 다음 세포를 섭씨 37도 및 5% 이산화탄소에서 3.5분 동안 배양합니다.플레이트의 측면과 바닥을 몇 초 동안 튕겨서 세포를 분리하고, 준비된 배지 중 500 마이크로리터를 첨가한다. 분리된 세포를 새로운 1.5밀리리터 튜브에 수확하고 세포 현탁액을 위아래로 피펫팅합니다. 세포 계수를 위해 100 마이크로리터의 세포 현탁액을 900 마이크로리터의 DPBS에 추가합니다.남은 세포 현탁액 900 마이크로리터를 배지 1로 희석하여 10 밀리리터당 4회 파워 셀을 달성한다. 100마이크로리터의 희석된 세포 현탁액을 비부착성 V-바닥, 96웰 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 저속 셰이커에서 접시를 5분 동안 가볍게 돌리고 둘째 날까지 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양합니다.둘째 날에는 96웰 플레이트의 각 웰에 20마이크로리터의 1% 시약 A를 추가하고 중앙에 두 번 피펫팅하여 죽은 세포를 분산시킵니다. 6일째까지 섭씨 37도 및 5%이산화탄소에서 배양하기 전에 접시 바닥을 청소합니다. 여섯째 날에, 58 마이크로리터의 배지를 60 마이크로리터의 신선한 배지 1로 교체하고, 배양을 계속한다.12일째에 15밀리리터 원추형 튜브의 96웰 플레이트에서 세포 펠릿을 수확하고 펠릿이 실온에서 5분 동안 자연적으로 침전되도록 합니다. 펠릿이 침전되면 유기체를 방해하지 않고 상청액을 제거하고 세포 응집체를 시약 A와 함께 배지 2 18ml가 들어있는 10cm 현탁액 접시에 옮깁니다. 18일째에, 접시에서 반투명 시신경 소포의 생성을 확인하고, 생성된 오가노이드를 미세수술용 칼을 사용하여 절단하였다.절단 된 모든 펠릿을 접시 중앙에 모으십시오. 그런 다음 세포를 15 밀리리터 원추형 팔콘 튜브로 수확합니다. 세포가 침전되면 상청액을 부드럽게 제거하고 접시 당 3 개씩 18ml의 배지가있는 2 개의 10cm 페트리 접시에 펠릿을 재현 탁합니다.세포 응집을 피하기 위해 접시를 인큐베이터로 부드럽게 옮깁니다. 세포를 계속 배양하고 매주 배지를 바꿉니다. 45일 후 120일까지 CRX 발현을 분석한다.이 대표적인 분석에서는 인간 망막 생성의 다양한 단계가 표시됩니다. 여섯째 날, 오가노이드는 직경이 약 600마이크로미터인 밝은 림 내부에 조밀한 연결의 집합체로 나타났습니다. 12 일째에, 시신경 소포 유사 구조의 초기 생성이 일어났다.적절한 소포-유사 구조가 없는 유기체는 18일에 페트리 접시에서 배양하기 전에 폐기되었다. 배양 30일째에는 소포와 같은 구조가 더 분명해졌고 열등한 RO를 쉽게 구별하고 제거할 수 있었습니다. 45일째부터 오가노이드는 CRX, RCVRN 및 OTX2와 같은 광수용체 전구체의 다양한 마커를 발현했습니다.우수한 망막 오가노이드를 절단함으로써 분화 효율이 크게 향상되고 96개의 플레이트에서 100개 이상의 우수한 오가노이드를 수확할 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

인간 치과 펄프의 줄기 세포의 분리, 특성화 및 비교 차별화 두 가지 방법을 사용하여 영구 치아에서 파생

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

연구

의학

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

인간의 전립선 암 샘플에서 암 줄기 세포의 분리

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

인간 세포주에서 Chemoresistant 난소 암 줄기 세포에 대한 심화 학습

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

근육 영양 장애 환자에서 유도 만능 줄기 세포의 생성 : 소변 유래 세포의 효율적인 통합이없는 프로그램을 다시

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

췌장암 새로운 치료 전략을 개발하기위한 전지 특성 줄기 공부

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

마우스에서 가속 죽상 경화증의 유도: "와이어 부상" 모델

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

에서 재조합 효소 중재 카세트 교환에 의해 재조합 인간 다 능성 줄기 세포의 신속하고 효율적인 생성<em&gt; AAVS1</em&gt; 로커스

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

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포스 콜린 유발 장내 Organoids에 붓기 일 :<em&gt; 체외</em&gt; 분석 낭포 성 섬유증 환자의 약물 반응을 평가하기위한

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

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인간 탯 줄 혈액 파생 CD34에서 조 혈 줄기 세포의 생체 내 확장 전+ 세포 Valproic 산 사용 하 여

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

수면 의 아름다움 트랜스포슨 - 전염 인간 망막 안료 상피 세포에서 산화 스트레스의 유도 및 분석

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...