Name: directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Vi takker medlemmer av 502 laboratorium for teknisk støtte og nyttige kommentarer angående manuskriptet. Dette arbeidet ble delvis støttet av Beijing Municipal Natural Science Foundation (Z200014) og National Key R&D Program of China (2017YFA0105300).

Denne studien ble godkjent av den institusjonelle etiske komiteen i Beijing Tongren Hospital, Capital Medical University. H9 hESCs ble hentet fra WiCell Research Institute og genetisk konstruert til tdTomato-merket cellelinje.
1. Generering av menneskelige ROer
<ol><li>Kultur hESCs under feeder-frie forhold.<ol><li>Belegg en brønn av en 6-brønns plate med 1 ml 0,1 mg / ml reagens A (materialtabell) ved 37 ° C i minst en halv time etter produsentens instruksjoner. Tine en ...

<ol>
	<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids.">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).</li><li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development.">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution.">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells.">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids.">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients.">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li><li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa.">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).</li><li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration.">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286 (2015).</li></ol>

Retinal organoid differensiering er en ønskelig metode for generering av rikelig funksjonelle retinale celler. RO er en sammensetning av forskjellige retinale celler, som ganglionceller, bipolare celler og fotoreceptorer, generert av pluripotente stamceller mot nevrale retina 4,5,8,9. Selv om sammenflytende ROs kan høstes, er det tidkrevende, noe som kan kreve lange dyrkingsperioder (opptil 1...

Pluripotente stamceller (PSC) er preget av deres selvfornyelse og evne til å differensiere til alle slags somatiske celler. Dermed har organoider avledet fra PSC blitt en viktig ressurs i regenerativ medisinforskning. Retinal degenerasjon er preget av tap av fotoreceptorer (stenger og kjegler) og retinal pigmentepitel. Retinal celle erstatning kan være en oppmuntrende behandling for denne sykdommen. Det er imidlertid ikke mulig å skaffe menneskelige netthinner for sykdomsforskning og terapi. Derfor er retinale organoider (ROs) avledet fra PSC, som effektivt og vellykket rekapitulerer flerlags innfødte retinale celler, gunstige for grunnleggende og translasjonell forskning 1,2,3. Vår forskning fokuserer på RO-differensiering for å gi tilstrekkelige og kvalitetsceller for å studere retinal degenerasjon4.
Metoder for differensiering av ROer dukker stadig opp, med tredimensjonal (3D) suspensjonsdifferensiering som ble utviklet av Sasai-laboratoriet i 20125. Vi introduserte CRX-tdTomato-taggen i humane embryonale stamceller (hESCs) for spesifikt å spore fotoreseptorforløpercellene og modifiserte metoden med tillegg av COCO, en multifunksjonell antagonist av Wnt-, TGF-β- og BMP-banene6. Kokos har vist seg å effektivt forbedre differensieringseffektiviteten til fotoreseptorforløpere og kjegler 6,7.
Til sammen, ved å modifisere den klassiske differensieringsmetoden, har vi utviklet en tilgjengelig protokoll for å høste rikelig fotoreceptorforløpere og kjegler fra humane ROs for å analysere retinal sykdom assosiert med fotoreceptorene gjennom laboratorieundersøkelser og for videre klinisk anvendelse / transplantasjon.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COCO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3047-CC-050</td>
			<td>DAN Domain family of BMP antagonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C141905005BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Biological Industry</td>
			<td>04-002-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement-Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3181502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primesurface 96 V-plate</td>
			<td>Sbio</td>
			<td>MS9096SZ</td>
			<td>Cell aggregation in 1.2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrigel in 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5990</td>
			<td>mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent C</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>TrypLE Express in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>DNase I , in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Enzo Life Science</td>
			<td>ALX-270-426-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>organoids dissociation in 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>681669</td>
			<td>Wnt inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells

Retinalcelletransplantasjon er en lovende terapeutisk tilnærming, som kan gjenopprette retinalarkitekturen og stabilisere eller til og med forbedre de visuelle evnene til den degenererte netthinnen. Likevel står fremgang i celleutskiftningsterapi for tiden overfor utfordringene ved å kreve en hyllevare kilde av høy kvalitet og standardiserte humane netthinner. Derfor er det nødvendig med en enkel og stabil protokoll for forsøkene. Her utvikler vi en optimalisert protokoll, basert på en selvorganiserende metode med bruk av eksogene molekyler og reagens A, samt manuell eksisjon for å generere tredimensjonale humane retinaorganoider (RO). Den humane Pluripotent Stem Cells (PSCs) -avledet RO uttrykker spesifikke markører for fotoreceptorer. Med tilsetning av COCO, en multifunksjonell antagonist, økes differensieringseffektiviteten til fotoreceptorforløpere og kjegler betydelig. Effektiv bruk av dette systemet, som har fordelene med cellelinjer og primære celler, og uten innkjøpsproblemer forbundet med sistnevnte, kan produsere sammenflytende retinale celler, spesielt fotoreceptorer. Dermed gir differensieringen av PSC til RO en optimal og biorelevant plattform for sykdomsmodellering, legemiddelscreening og celletransplantasjon.

Den skjematiske illustrasjonen viser differensieringsprotokollen for å forbedre forløperceller med kokos (figur 1). Fra PSC til ROer kan mange detaljer føre til resultatvariasjoner. Det anbefales å registrere hvert trinn og til og med katalognummeret og partinummeret til hvert medium for å spore hele prosedyren.
Her gir vi lyse feltbilder for dagene 6, 12, 18 og 45 (figur 2). På dag 6 er organoidene vanligvis rundt 600 μm i dia...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Ved hjelp av en selvorganiserende metode utvikler vi en protokoll med tillegg av kokos som kan øke genereringen av fotoreceptorer betydelig.

Rettet induksjon av retinale organoider fra humane pluripotente stamceller

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Dette er en modell for retinal sykdom og emulerer in vivo retina. Til en viss grad kan det erstatte dyreforsøk. Protokollen er optimalisert for kvaliteten og mengden av fotoreseptorforløperne i retinale organoider, og fotoreseptoren er nøkkelen til flere irreversible blindhetsforhold.Begynn med å dyrke de menneskelige embryotiske stamceller, eller hESCs, under materfrie forhold. For å gjøre det, belegg en brønn av en seksbrønnsplate med en milliliter 100 mikrogram per milliliter reagens A, og inkuber platen ved 37 grader Celsius i minst en halv time. Tin en aliquot på en million hESCs, og sentrifuger den ved 200 xg i fem minutter.Etter å ha fjernet supernatanten, frø cellene inn i den tidligere belagte platen, sammen med to milliliter reagens B.Passasje cellene etter å ha nådd omtrent 80% sammenløp på rundt fire dager. Etter å ha nådd konfluens, vask cellene med forvarmet DPBS, og overfør dem til 500 mikroliter nytilberedt reagens. Deretter inkuberer cellene i 3, 5 minutter ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid.Løsne cellene ved å bla på siden og bunnen av platen i noen sekunder, og tilsett 500 mikroliter tilberedt medium en. Høst de frittliggende cellene i et nytt 1,5 milliliter rør, og pipetter cellesuspensjonen opp og ned. For celletelling, tilsett 100 mikroliter cellesuspensjon til 900 mikroliter DPBS.Fortynn 900 mikroliter av den gjenværende cellesuspensjonen med medium en i petriskålen for å oppnå ni ganger 10 til fjerde kraftceller per milliliter. Tilsett 100 mikroliter fortynnet cellesuspensjon til hver brønn av en ikke-klebrig, V-bunn, 96-brønnplate. Spinn lett ned platen på en lavhastighets shaker i fem minutter, og inkuber ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til dag to.På dag to, tilsett 20 mikroliter 1% reagens A til hver brønn på 96-brønnplaten, og pipette to ganger i midten for å spre de døde cellene. Rengjør bunnen av platen før du inkuberer den ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til dag seks. På dag seks, erstatt 58 mikroliter av mediet med 60 mikroliter fersk medium en, og fortsett inkubasjonen.På dag 12, høst cellepellets fra 96-brønnplaten i et 15 milliliter konisk rør, og la pellets slå seg naturlig i fem minutter ved romtemperatur. Når pellets legger seg, fjern supernatanten uten å forstyrre organoider, og overfør celleaggregatene til en 10-centimeter suspensjonsskål som inneholder 18 milliliter medium to med reagens A.Inkuber parabolen ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid til dag 18. På dag 18, bekreft genereringen av en halvtransparent optisk vesikkel i parabolen, og kutt de genererte organoider ved hjelp av en mikrokirurgisk kniv.Samle alle kuttpellets til midten av parabolen. Høst deretter cellene i et 15 milliliter konisk Falcon-rør. Når cellene legger seg, fjern supernatanten forsiktig og resuspender pellets i to 10-centimeter petriskåler med 18 milliliter medium, tre per tallerken.Overfør oppvasken forsiktig til inkubatoren for å unngå celleaggregering. Fortsett å dyrke cellene, endre mediet ukentlig. Analyser CRX-uttrykket etter dag 45 til dag 120.I denne representative analysen vises ulike stadier av human retinal generasjon. På dag seks dukket organoider opp som et aggregat av tette forbindelser inne i en lys kant med en diameter på rundt 600 mikrometer. På dag 12 fant den første generasjonen av de optiske vesikkellignende strukturer sted.Organoidene uten skikkelig vesikkellignende arkitektur ble kastet før de dyrket i en petriskål på dag 18. På dag 30 av kulturen var den vesikkellignende arkitekturen mer åpenbar, og dårligere ROer kunne lett skilles og fjernes. Fra og med dag 45 uttrykte organoidene forskjellige markører for fotoreseptorforløpere, som CRX, RCVRN og OTX2.Ved å spalte de overlegne retinale organoider, er differensieringseffektiviteten betydelig forbedret, og mer enn 100 overlegne organoider fra 96 plater kan høstes.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Isolasjon, karakterisering og Comparative Differensiering av Human tannpulpa stamceller hentet fra permanente tenner ved hjelp av to ulike metoder

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Isolering av kreft stamceller fra menneskelige prostata kreft Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Berikelse for kjemoresistent eggstokkreft stamceller fra humane cellelinjer

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Generasjon av Induced Pluripotent Stamceller fra muskeldystrofi Pasienter: Effektiv integrasjon fritt Omprogrammering av urin Avledet Cells

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Studerer Bukspyttkjertelkreft Stem Cell Kjennetegn for å utvikle nye behandlingsstrategier

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Induksjon av akselerert aterosklerose hos mus: "Wire-Injury" Modell

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rask og effektiv produksjon av rekombinant humant Pluripotent stamceller ved rekombinase-mediert Cassette Exchange i den<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-indusert Hevelse i tarmen Organoids: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyse for å vurdere Drug Response i pasienter med cystisk fibrose

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo utvidelse av blodkreft stamceller fra menneskelige navlestreng blod-avledet CD34+ celler ved hjelp av Valproic Acid

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induksjon og analyse av oksidativt stress i sovende skjønnhet transposon-transfekterte humane retinal pigment epitelceller

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...