Name: directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Мы благодарим сотрудников лаборатории 502 за их техническую поддержку и полезные комментарии относительно рукописи. Эта работа была частично поддержана Пекинским муниципальным фондом естественных наук (Z200014) и Национальной ключевой программой исследований и разработок Китая (2017YFA0105300).

Это исследование было одобрено институциональным комитетом по этике Пекинской больницы Тунжэнь, Столичного медицинского университета. H9 hESCs были получены из Научно-исследовательского института WiCell и генетически модифицированы для клеточной линии, помеченной tdTomato.
1. Ге?...

<ol>
	<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids.">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).</li><li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development.">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution.">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells.">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids.">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients.">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li><li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa.">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).</li><li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration.">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286 (2015).</li></ol>

Дифференцировка органоидов сетчатки является желательным методом для генерации достаточных функциональных клеток сетчатки. RO представляет собой композит различных клеток сетчатки, таких как ганглиозные клетки, биполярные клетки и фоторецепторы, генерируемые плюрипотентными ствол?...

Плюрипотентные стволовые клетки (PSC) характеризуются их самообновлением и способностью дифференцироваться во все виды соматических клеток. Таким образом, органоиды, полученные из PSC, стали важным ресурсом в исследованиях регенеративной медицины. Дегенерация сетчатки характеризуется потерей фоторецепторов (палочек и колбочек) и пигментного эпителия сетчатки. Замена клеток сетчатки может быть обнадеживающим лечением этого заболевания. Тем не менее, невозможно получить сетчатку человека для исследования и терапии заболеваний. Таким образом, органоиды сетчатки (RO), полученные из PSC, которые эффективно и успешно рекапитулируют многослойные нативные клетки сетчатки, полезны для фундаментальных и трансляционных исследований 1,2,3. Наше исследование сосредоточено на дифференцировке РО для обеспечения достаточных и качественных клеток для изучения дегенерации сетчатки4.
Методы дифференциации РО постоянно появляются, с трехмерной (3D) дифференциацией суспензии, впервые предложенной лабораторией Sasai в 2012году 5. Мы ввели метку CRX-tdTomato в эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) для конкретного отслеживания клеток-предшественников фоторецепторов и модифицировали метод с добавлением COCO, многофункционального антагониста путей Wnt, TGF-β и BMP6. Было показано, что COCO эффективно повышает эффективность дифференцировки предшественников фоторецепторов и колбочек 6,7.
В целом, модифицируя классический метод дифференцировки, мы разработали доступный протокол для сбора обильных предшественников фоторецепторов и колбочек из ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ РО для анализа заболевания сетчатки, связанного с фоторецепторами, посредством лабораторных исследований и для дальнейшего клинического применения / трансплантации.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COCO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3047-CC-050</td>
			<td>DAN Domain family of BMP antagonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C141905005BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Biological Industry</td>
			<td>04-002-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement-Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3181502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primesurface 96 V-plate</td>
			<td>Sbio</td>
			<td>MS9096SZ</td>
			<td>Cell aggregation in 1.2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrigel in 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5990</td>
			<td>mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent C</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>TrypLE Express in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>DNase I , in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Enzo Life Science</td>
			<td>ALX-270-426-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>organoids dissociation in 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>681669</td>
			<td>Wnt inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells

Трансплантация клеток сетчатки является перспективным терапевтическим подходом, который может восстановить архитектуру сетчатки и стабилизировать или даже улучшить зрительные возможности дегенерированной сетчатки. Тем не менее, прогресс в клеточной заместительной терапии в настоящее время сталкивается с проблемами, связанными с необходимостью использования готового источника высококачественной и стандартизированной сетчатки человека. Поэтому для экспериментов необходим простой и стабильный протокол. Здесь мы разрабатываем оптимизированный протокол, основанный на самоорганизующемся методе с использованием экзогенных молекул и реагента А, а также ручного иссечения для генерации трехмерных органоидов сетчатки человека (RO). Ro, полученный из плюрипотентных стволовых клеток человека (PSC), экспрессирует специфические маркеры для фоторецепторов. С добавлением КОКО, многофункционального антагониста, эффективность дифференцировки предшественников и колбочек фоторецепторов значительно повышается. Эффективное использование этой системы, которая имеет преимущества клеточных линий и первичных клеток, и без проблем с источниками, связанных с последними, может производить сливающиеся клетки сетчатки, особенно фоторецепторы. Таким образом, дифференциация PSC в RO обеспечивает оптимальную и биорелевантную платформу для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и трансплантации клеток.

На схематической иллюстрации изображен протокол дифференцировки для улучшения клеток-предшественников с помощью COCO (рисунок 1). От PSC до RO, многочисленные детали могут привести к изменениям результатов. Рекомендуется записывать каждый шаг и даже каталожный номер и номе...

Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Используя самоорганизующийся метод, мы разрабатываем протокол с добавлением COCO, который может значительно увеличить генерацию фоторецепторов.

Направленная индукция органоидов сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Это модель заболевания сетчатки и эмулирует сетчатку in vivo. В какой-то степени он может заменить эксперименты на животных. Протокол оптимизирован для качества и количества предшественников фоторецепторов в органоидах сетчатки, а фоторецептор является ключом к нескольким необратимым состояниям слепоты.Начните с культивирования человеческих эмбриональных стволовых клеток, или hESCs, в условиях, свободных от кормушек. Для этого покройте одну лунку шестилуночной пластины одним миллилитом 100 микрограммов на миллилитр реагента А и инкубируйте пластину при 37 градусах Цельсия в течение не менее получаса. Разморозьте аликвоту в один миллион hESC и центрифугируйте ее при 200 xg в течение пяти минут.После удаления супернатанта засейте клетки в ранее покрытую пластину вместе с двумя миллилитрами реагента B.Проходя клетки после достижения примерно 80%-ной конфлюзии примерно через четыре дня. Достигнув слияния, промыть клетки предварительно подогретым DPBS, и переложить их в 500 микролитров свежеприготовленного реагента. Затем инкубируют клетки в течение 3,5 минут при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.Отсоедините ячейки, щелкнув боковой и нижней частью пластины на несколько секунд, и добавьте 500 микролитров подготовленной среды. Соберите отсоединенные ячейки в новую 1,5-миллилитровую трубку и пипетку клеточной суспензии вверх и вниз. Для подсчета клеток добавьте 100 микролитров клеточной суспензии к 900 микролитрам DPBS.Разбавьте 900 микролитров оставшейся клеточной суспензии средним в чашке Петри, чтобы достичь девятикратного 10-четвертого уровня мощности ячеек на миллилитр. Добавьте 100 микролитров разбавленной клеточной суспензии к каждой лунке неадгезионной пластины с V-образным дном, 96-луночной пластиной. Слегка вращайте пластину на низкоскоростном шейкере в течение пяти минут и насиживайте при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до второго дня.На второй день добавьте 20 микролитров 1% реагента А к каждой лунке 96-луночной пластины и пипетку дважды в центре, чтобы рассеять мертвые клетки. Очистите нижнюю часть пластины перед инкубацией при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до шестого дня. На шестой день замените 58 микролитров среды на 60 микролитров свежей среды и продолжите инкубацию.На 12-й день соберите гранулы клеток с 96-луночной пластины в 15-миллилитровой конической трубке и дайте гранулам естественным образом осесть в течение пяти минут при комнатной температуре. Когда гранулы осядут, удалите супернатант, не нарушая органоидов, и перенесите клеточные агрегаты в 10-сантиметровую суспензионную чашку, содержащую 18 миллилитров среды два с реагентом A.Инкубируйте блюдо при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа до 18 дня. На 18-й день подтвердите генерацию полупрозрачного зрительного пузырька в посуде и вырежьте сгенерированные органоиды с помощью микрохирургического ножа.Сложите все нарезанные гранулы к центру блюда. Затем соберите клетки в 15-миллилитровую коническую трубку Falcon. Когда клетки осядут, аккуратно удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в двух 10-сантиметровых чашках Петри с 18 миллилитрами среды, по три на чашку.Аккуратно перенесите посуду в инкубатор, чтобы избежать агрегации клеток. Продолжайте культивировать клетки, меняя среду еженедельно. Анализ экспрессии CRX после 45-го дня до 120-го дня.В этом репрезентативном анализе отображаются различные стадии генерации сетчатки человека. На шестой день органоиды появились в виде совокупности плотных соединений внутри яркого обода диаметром около 600 микрометров. На 12-й день произошло первоначальное поколение оптических пузырькообразных структур.Органоиды без надлежащей пузыреобразной архитектуры были выброшены перед культивированием в чашке Петри на 18-й день. К 30-му дню культуры архитектура, похожая на везикл, была более очевидной, и более низкие RO можно было легко различить и удалить. Начиная с 45-го дня, органоиды экспрессировали различные маркеры предшественников фоторецепторов, таких как CRX, RCVRN и OTX2.Путем расщепления высших органоидов сетчатки эффективность дифференцировки значительно улучшается, и можно извлечь более 100 высших органоидов из 96 пластин.

Research

JoVE Journal

Medicine

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Выделение, характеристика и сравнительный Дифференциация по правам зубных стволовых клеток, полученных из целлюлозы постоянных зубов с помощью двух различных методов

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

Выделение стволовых клеток рака из образцов предстательной железы человека

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Обогащение химиорезистентных рака яичников стволовых клеток из человеческих клеточных линиях

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Muscular Dystrophy Patients: Efficient Integration-free Reprogramming of Urine Derived Cells

Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки мышечной дистрофией пациентов: эффективная интеграция без перепрограммирования мочи клеток, полученных

Dystrophic cardiomyopathy is a poorly understood consequence of muscular dystrophy. Generating induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) from patients with ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

Изучение рака поджелудочной железы стволовых клеток Характеристики для разработки новых стратегий лечения

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Induction of Accelerated Atherosclerosis in Mice: The "Wire-Injury" Model

Индукция ускоренного атеросклероза у мышей: модель "Wire-Injury"

Atherosclerosis is a proliferative fibro-inflammatory disease developing in the arterial wall, inducing a deficient blood flow or a lack of blood flow. ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Быстрое и эффективное создание рекомбинантного человеческого плюрипотентных стволовых клеток с помощью рекомбинантному-опосредованной кассетные бирже в<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Forskolin-induced Swelling in Intestinal Organoids: An In Vitro Assay for Assessing Drug Response in Cystic Fibrosis Patients

Форсколин-индуцированной Отек в кишечном органоидов:<em&gt; In Vitro</em&gt; Анализ для оценки ответа на наркотики в больных муковисцидозом

Recently-developed cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)-modulating drugs correct surface expression and/or function of the mutant ...

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo Expansion of Hematopoietic Stem Cells from Human Umbilical Cord Blood-derived CD34+ Cells Using Valproic Acid

Ex Vivo расширение гемопоэтических стволовых клеток из человеческой пуповинной крови производные CD34+ клеток с помощью вальпроевая кислота

Umbilical cord blood (UCB) units provide an alternative source of human hematopoietic stem cells (HSCs) for patients who require allogeneic bone marrow ...

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Induction and Analysis of Oxidative Stress in Sleeping Beauty Transposon-Transfected Human Retinal Pigment Epithelial Cells

Индукция и анализ окислительного стресса в транспозонно-трансфектированных пигментных эпителиальных клетках сетчатки человека

Oxidative stress plays a critical role in several degenerative diseases, including age-related macular degeneration (AMD), a pathology that affects ~30 ...