Name: directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells
Uploaded: 2021-04-21T13:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells at JoVE.com

Agradecemos a los miembros del laboratorio 502 por sus apoyos técnicos y comentarios útiles sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Municipal de Ciencias Naturales de Beijing (Z200014) y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2017YFA0105300).

Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética institucional del Hospital Tongren de Beijing, Universidad Médica Capital. Las hESCs H9 se obtuvieron del Instituto de Investigación WiCell y se modificaron genéticamente para la línea celular marcada con tdTomato.
1. Generación de ROs humanas
<ol><li>Cultive los hESCs en condiciones libres de alimentador.<ol><li>Cubra un pocillo de una placa de 6 pocillos con 1 ml de 0,1 mg/ml de reactivo A (tabla de materiales) a 37 ?...

<ol>
	<li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+accessibility+analysis+reveals+regulatory+dynamics+of+developing+human+retina+and+hiPSC-derived+retinal+organoids.">Chromatin accessibility analysis reveals regulatory dynamics of developing human retina and hiPSC-derived retinal organoids.</a> Science Advances. 6 (6), 5247 (2020).</li><li>Lu, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-Cell+Analysis+of+Human+Retina+Identifies+Evolutionarily+Conserved+and+Species-Specific+Mechanisms+Controlling+Development.">Single-Cell Analysis of Human Retina Identifies Evolutionarily Conserved and Species-Specific Mechanisms Controlling Development.</a> Developmental Cell. 53 (4), 473-491 (2020).</li><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Types+of+the+Human+Retina+and+Its+Organoids+at+Single-Cell+Resolution.">Cell Types of the Human Retina and Its Organoids at Single-Cell Resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640 (2020).</li><li>Jin, Z. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stemming+retinal+regeneration+with+pluripotent+stem+cells.">Stemming retinal regeneration with pluripotent stem cells.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 69, 38-56 (2019).</li><li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs.">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li><li>Pan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=COCO+enhances+the+efficiency+of+photoreceptor+precursor+differentiation+in+early+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids.">COCO enhances the efficiency of photoreceptor precursor differentiation in early human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Stem Cell Research and Therapy. 11 (1), 366 (2020).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+cone+photoreceptors+through+simultaneous+inhibition+of+BMP,+TGFbeta+and+Wnt+signaling.">Differentiation of human embryonic stem cells into cone photoreceptors through simultaneous inhibition of BMP, TGFbeta and Wnt signaling.</a> Development. 142 (19), 3294-3306 (2015).</li><li>Deng, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Correction+Reverses+Ciliopathy+and+Photoreceptor+Loss+in+iPSC-Derived+Retinal+Organoids+from+Retinitis+Pigmentosa+Patients.">Gene Correction Reverses Ciliopathy and Photoreceptor Loss in iPSC-Derived Retinal Organoids from Retinitis Pigmentosa Patients.</a> Stem Cell Reports. 10 (4), 1267-1281 (2018).</li><li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patient-Specific+Retinal+Organoids+Recapitulate+Disease+Features+of+Late-Onset+Retinitis+Pigmentosa.">Patient-Specific Retinal Organoids Recapitulate Disease Features of Late-Onset Retinitis Pigmentosa.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 128 (2020).</li><li>Zhang, C. J., Ma, Y., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+road+to+restore+vision+with+photoreceptor+regeneration.">The road to restore vision with photoreceptor regeneration.</a> Experimental Eye Research. 202, 108283 (2020).</li><li>Reichman, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+confluent+human+iPS+cells+to+self-forming+neural+retina+and+retinal+pigmented+epithelium.">From confluent human iPS cells to self-forming neural retina and retinal pigmented epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the U. S. A. 111 (23), 8518-8523 (2014).</li><li>Kuwahara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+ciliary+margin-like+stem+cell+niche+from+self-organizing+human+retinal+tissue.">Generation of a ciliary margin-like stem cell niche from self-organizing human retinal tissue.</a> Nature Communications. 6, 6286 (2015).</li></ol>

La diferenciación de organoides retinianos es un método deseable para la generación de amplias células funcionales de la retina. La RO es un compuesto de diferentes células de la retina, como células ganglionares, células bipolares y fotorreceptores, generados por células madre pluripotentes hacia la retina neural 4,5,8,9. Aunque se pueden cosechar RO confluentes, lleva mucho tiempo, lo...

Las células madre pluripotentes (PSC) se caracterizan por su auto-renovación y capacidad para diferenciarse en todo tipo de células somáticas. Por lo tanto, los organoides derivados de PSC se han convertido en un recurso importante en la investigación de la medicina regenerativa. La degeneración retiniana se caracteriza por la pérdida de fotorreceptores (bastones y conos) y epitelio pigmentario de la retina. El reemplazo de células retinianas podría ser un tratamiento alentador para esta enfermedad. Sin embargo, no es factible obtener retinas humanas para la investigación y terapia de enfermedades. Por lo tanto, los organoides retinianos (RO) derivados de PSCs, que recapitulan de manera efectiva y exitosa las células retinianas nativas de múltiples capas, son beneficiosos para la investigación básica y traslacional 1,2,3. Nuestra investigación se centra en la diferenciación de RO para proporcionar células suficientes y de calidad para estudiar la degeneración retiniana4.
Los métodos para diferenciar las RO están surgiendo continuamente, con la diferenciación de suspensión tridimensional (3D) iniciada por el laboratorio Sasai en 20125. Introdujimos la etiqueta CRX-tdTomato en las células madre embrionarias humanas (hESCs) para rastrear específicamente las células precursoras de fotorreceptores y modificamos el método con la adición de COCO, un antagonista multifuncional de las vías Wnt, TGF-β y BMP6. Se ha demostrado que el COCO mejora eficientemente la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de los fotorreceptores 6,7.
En conjunto, al modificar el método clásico de diferenciación, hemos desarrollado un protocolo accesible para recolectar abundantes precursores y conos de fotorreceptores de RO humanos para analizar la enfermedad retiniana asociada con los fotorreceptores a través de investigaciones de laboratorio y para su posterior aplicación clínica / trasplante.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COCO</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3047-CC-050</td>
			<td>DAN Domain family of BMP antagonists</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>C141905005BT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>15575020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td>
			<td>Biological Industry</td>
			<td>04-002-1A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut Serum Replacement-Multi-Species</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3181502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-essential Amino Acid Solution (100X)</td>
			<td>sigma</td>
			<td>M7145</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primesurface 96 V-plate</td>
			<td>Sbio</td>
			<td>MS9096SZ</td>
			<td>Cell aggregation in 1.2.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyruvate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent A</td>
			<td>BD</td>
			<td>356231</td>
			<td>Matrigel in 1.1.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent B</td>
			<td>StemCell</td>
			<td>5990</td>
			<td>mTeSR- E8 , PSCs basal medium in 1.1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent C</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12563-011</td>
			<td>TrypLE Express in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagent D</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>DNase I , in 1.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Retinoic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2625-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAG</td>
			<td>Enzo Life Science</td>
			<td>ALX-270-426-M001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplement 1</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17502-048</td>
			<td>N-2 Supplement (100X), Liquid, supplemet in medum III</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200056</td>
			<td>organoids dissociation in 2.1.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wnt Antagonist I, IWR-1-endo - Calbiochem</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>681669</td>
			<td>Wnt inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 2HCl</td>
			<td>Selleck</td>
			<td>S1049</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells

El trasplante de células de la retina es un enfoque terapéutico prometedor, que podría restaurar la arquitectura de la retina y estabilizar o incluso mejorar las capacidades visuales de la retina degenerada. Sin embargo, el progreso en la terapia de reemplazo celular actualmente enfrenta los desafíos de requerir una fuente estándar de retinas humanas estandarizadas y de alta calidad. Por lo tanto, se necesita un protocolo fácil y estable para los experimentos. Aquí, desarrollamos un protocolo optimizado, basado en un método de autoorganización con el uso de moléculas exógenas y reactivo A, así como la escisión manual para generar los organoides tridimensionales de la retina humana (RO). La RO derivada de células madre pluripotentes humanas (PSC) expresa marcadores específicos para los fotorreceptores. Con la adición de COCO, un antagonista multifuncional, la eficiencia de diferenciación de los precursores y conos de fotorreceptores aumenta significativamente. El uso eficiente de este sistema, que tiene los beneficios de las líneas celulares y las células primarias, y sin los problemas de abastecimiento asociados con estas últimas, podría producir células retinianas confluentes, especialmente fotorreceptores. Por lo tanto, la diferenciación de PSC a RO proporciona una plataforma óptima y biorelevante para el modelado de enfermedades, la detección de fármacos y el trasplante celular.

La ilustración esquemática muestra el protocolo de diferenciación para mejorar las células precursoras con COCO (Figura 1). Desde PSC hasta ROs, numerosos detalles podrían causar variaciones en los resultados. Se recomienda registrar cada paso e incluso el número de catálogo y el número de lote de cada medio para rastrear todo el procedimiento.
En este documento, proporcionamos imágenes de campo brillante para los días 6, 12, 18 y 45 (<strong class="xfig...

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Directed Induction of Retinal Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

Utilizando un método de autoorganización, desarrollamos un protocolo con la adición de COCO que podría aumentar significativamente la generación de fotorreceptores.

Inducción dirigida de organoides retinianos a partir de células madre pluripotentes humanas

Retinal cell transplantation is a promising therapeutic approach, which could restore the retinal architecture and stabilize or even improve the visual ...

Este es un modelo para la enfermedad de la retina y emula la retina in vivo. Hasta cierto punto, podría reemplazar los experimentos con animales. El protocolo está optimizado para la calidad y cantidad de los precursores de fotorreceptores en los organoides de la retina, y el fotorreceptor es la clave para varias condiciones de ceguera irreversible.Comience cultivando las células madre embrionarias humanas, o hESCs, en condiciones libres de alimentador. Para hacerlo, cubra un pocillo de una placa de seis pocillos con un mililitro de 100 microgramos por mililitro de reactivo A, e incube la placa a 37 grados centígrados durante al menos media hora. Descongele una alícuota de un millón de hESCs y centrifugarla a 200 xg durante cinco minutos.Después de retirar el sobrenadante, siembre las células en la placa previamente recubierta, junto con dos mililitros de reactivo B.Pase las células después de alcanzar aproximadamente el 80% de confluencia alrededor de cuatro días. Después de alcanzar la confluencia, lave las células con DPBS precalentado y transfiéralas a 500 microlitros de reactivo recién preparado. Luego, incubar las células durante 3,5 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Separe las celdas moviendo el costado y la parte inferior de la placa durante unos segundos y agregue 500 microlitros de uno mediano preparado. Cosecha las células desprendidas en un nuevo tubo de 1,5 mililitros y pipeta la suspensión celular hacia arriba y hacia abajo. Para el recuento celular, agregue 100 microlitros de suspensión celular a 900 microlitros de DPBS.Diluir los 900 microlitros de la suspensión celular restante con uno mediano en la placa de Petri para lograr nueve veces 10 a la cuarta celdas de potencia por mililitro. Agregue 100 microlitros de suspensión celular diluida a cada pocillo de una placa no adherente, con fondo en V y de 96 pocillos. Gire ligeramente la placa en una agitadora de baja velocidad durante cinco minutos e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta el segundo día.En el segundo día, agregue 20 microlitros de reactivo A al 1% a cada pocillo de la placa de 96 pocillos y pipete dos veces en el centro para dispersar las células muertas. Limpie el fondo del plato antes de incubarlo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta el día seis. En el día seis, reemplace 58 microlitros del medio con 60 microlitros de medio fresco y continúe la incubación.El día 12, cosecha los gránulos celulares de la placa de 96 pocillos en un tubo cónico de 15 mililitros, y deja que los gránulos se asienten naturalmente durante cinco minutos a temperatura ambiente. Cuando los gránulos se asienten, retire el sobrenadante sin alterar los organoides y transfiera los agregados celulares a un plato de suspensión de 10 centímetros que contenga 18 mililitros de medio dos con reactivo A.Incubar el plato a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono hasta el día 18. El día 18, confirmar la generación de una vesícula óptica semitransparente en la placa, y cortar los organoides generados con un cuchillo microquirúrgico.Agregue todos los pellets cortados al centro del plato. Luego, cosecha las células en un tubo cónico Falcon de 15 mililitros. Cuando las células se asienten, retire suavemente el sobrenadante y resuspenda los gránulos en dos placas de Petri de 10 centímetros con 18 mililitros de medio, tres por plato.Transfiera suavemente los platos a la incubadora para evitar la agregación celular. Continuar cultivando las células, cambiando el medio semanalmente. Analizar la expresión de CRX desde el día 45 hasta el día 120.En este análisis representativo, se muestran varias etapas de la generación de la retina humana. En el sexto día, los organoides aparecieron como un agregado de conexiones densas dentro de un borde brillante con un diámetro de alrededor de 600 micrómetros. El día 12, tuvo lugar la generación inicial de las estructuras en forma de vesícula óptica.Los organoides sin una arquitectura adecuada similar a vesículas fueron descartados antes de cultivarse en una placa de Petri el día 18. Para el día 30 del cultivo, la arquitectura en forma de vesícula era más obvia, y las RO inferiores podían distinguirse y eliminarse fácilmente. A partir del día 45, los organoides expresaron varios marcadores de precursores de fotorreceptores, como CRX, RCVRN y OTX2.Al escindir los organoides retinianos superiores, la eficiencia de diferenciación se mejora significativamente y se podrían cosechar más de 100 organoides superiores de 96 placas.

Research

JoVE Journal

Medicine

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