Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

الكتاب أود أن أشكر الدكتور بيتر ديمبسي ومونيكا براون (جامعة كولورادو Anschutz الطبية الحرم الجامعي Organoid والأنسجة النمذجة الموارد المشتركة) لتوفير وسائل الإعلام WNR مشروطة ومناقشات قيمة. نشكر أيضا جامعة كولورادو تقنيات الخلايا مركز السرطان وتدفق الموارد المشتركة قياس الخلايا، وخاصة ديمتري باتورين، لخبرة فرز الخلايا. تم تمويل هذا العمل من قبل: NIH/NIDCD R01 DC012383، DC012383-S1، DC012383-S2، والمعاهد القومية للصحة/NCI R21 CA236480 إلى LAB، وR21DC016131 وR21DC016131-02S1 إلى DG، وF32 DC015958 إلى EJG.

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية في منشأة معتمدة من AAALAC وفقا لدليل رعاية واستخدام المختبر ، وقانون رعاية الحيوان ، وسياسة خدمة الصحة العامة ، ووافقت عليها اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه (IACUC) في حرم جامعة كولورادو أنشوتز الطبي. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 الفئران المستخدمة في هذا البروت...

<ol>
	<li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+renewal+in+gustation:+new+insights+into+taste+bud+development.">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li><li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+taste.">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li><li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).</li><li>Barlow, L. A., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+and+regenerating+a+sense+of+taste.">Developing and regenerating a sense of taste.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).</li><li>Yee, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5-EGFP+marks+taste+bud+stem/progenitor+cells+in+posterior+tongue.">Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue.</a> Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).</li><li>Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog-expressing+basal+cells+are+general+post-mitotic+precursors+of+functional+taste+receptor+cells.">Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).</li><li>Deshpande, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-related+alterations+of+taste+function+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+systematic+review.">Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review.</a> Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).</li><li>Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+changes+from+cancer+treatment+and+their+effects+on+patients'+food+behavior:+A+scoping+review.">Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review.</a> Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).</li><li>Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+taste+disorders.">Drug-induced taste disorders.</a> Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).</li><li>Kumari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+taste+organs+and+sensory+function+after+severe+loss+from+Hedgehog/Smoothened+inhibition+with+cancer+drug+sonidegib.">Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).</li><li>Ermilov, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+taste+organs+is+strictly+dependent+on+epithelial+hedgehog/gli+signaling.">Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling.</a> PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).</li><li>Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionated+head+and+neck+irradiation+impacts+taste+progenitors,+differentiated+taste+cells,+and+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+adult+mice.">Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/&#946;-catenin signaling in adult mice.</a> Scientific Reports. 9, 17934 (2019).</li><li>Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation.">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li><li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+taste:+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals.">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li><li>Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+taste.">The cell biology of taste.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).</li><li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+taste+perception.">Mammalian taste perception.</a> Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).</li><li>Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+stem/progenitor+cell+cycle+using+murine+circumvallate+papilla+taste+bud+organoid.">Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid.</a> Scientific Reports. 5, 17185 (2015).</li><li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem/progenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo.">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation.">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7, 4004 (2017).</li><li>Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+inflammatory+cytokine+expression+in+taste+organoids.">Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids.</a> Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin+substitutes+for+neuronal+input+for+taste+cell+regeneration+in+adult+mice.">R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li><li>Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples.">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li><li>Ekert, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommended+guidelines+for+developing,+qualifying,+and+implementing+complex+in+vitro+models+(CIVMs)+for+drug+discovery.">Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 25 (10), 1174-1190 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance.">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).</li><li>Vintschgau, M. v., H&#246;nigschmied, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervus+glossopharyngeus+und+schmeckbecher.">Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher.</a> Archiv f&#252;r die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).</li><li>Liu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Shh+signaling+centers+participate+in+fungiform+papilla+and+taste+bud+formation+and+maintenance.">Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance.</a> Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system.">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li><li>Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+organoids:+engineering+the+vasculature.">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li></ol>

وذكرت هنا هو وسيلة فعالة وقابلة للتكرار بسهولة لزراعة وصيانة ومعالجة organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار. ووجد أن استخدام ثلاثة CVPs من 8 إلى 20 أسبوعا Lgr5-فئران EGFP كافية للحصول على ~ 10000 GFP+ الخلايا للاستخدام التجريبي ، مما أدى إلى 50 بئرا مطلية بكثافة 200 خلية لك...

في القوارض ، يتم إيواء براعم الذوق اللغوي في حليمة فطرية موزعة بشكل مسبق ، حليمة مناجاة ثنائية الخلفي ، وكذلك حليمة محيطة واحدة (CVP) في خط الوسط الملصقات لللسان1. ويتكون كل برعم طعم من 50-100 قصيرة الأجل، وتجديد سريع خلايا مستقبلات الذوق (TRCs)، والتي تشمل نوع الأول مثل خلايا الدعم glial، نوع الخلايا الثانية التي تكشف الحلو، المر، وumami، والخلايا من النوع الثالث التي تكشف الحامض2،3،4. في CVP الماوس، LGR5+ الخلايا الجذعية على طول الصفيحة القاعدية تنتج جميع أنواع TRC وكذلك الخلايا الظهارية غير الذوق5. عند تجديد نسب الذوق ، يتم تحديد خلايا ابنة LGR5 لأول مرة كخلايا سلائف طعم ما بعد الميتوتيك (خلايا النوع الرابع) التي تدخل برعم الذوق وقادرة على التفريق في أي من أنواع TRCالثلاثة 6. دوران سريع من TRCs يجعل نظام الذوق عرضة للاضطراب من قبل العلاجات الطبية، بما في ذلك الإشعاع وبعض العلاجات الدوائية7،8،9،10،11،12،13. وبالتالي ، فإن دراسة نظام الذوق في سياق تنظيم الخلايا الجذعية الذوق والتمايز TRC أمر حيوي لفهم كيفية التخفيف من أو منع خلل الذوق.
الفئران هي نموذج تقليدي لدراسات الجسم الحي في علم الذوق حيث أن لديها نظام الذوق نظمت على نحو مماثل للبشر14،15،16. ومع ذلك ، فإن الفئران ليست مثالية لدراسات الإنتاجية العالية ، لأنها مكلفة للحفاظ عليها وتستغرق وقتا طويلا للعمل معها. للتغلب على ذلك، تم تطوير أساليب في المختبر زراعة الجهازية في السنوات الأخيرة. يمكن أن تولد الأجهزة العضوية الذوق من الأنسجة CVP الأصلية، وهي العملية التي الأجهزة برعم قبالة من ظهارة CVP الماوس معزولة مثقف ex vivo17. هذه organoids عرض ظهارة متعددة الطبقات تتفق مع نظام الذوق في الجسم الحي. تم تطوير طريقة أكثر كفاءة لتوليد organoids التي لا تتطلب ثقافة CVP الجسم الحي السابق من قبل رين وآخرون. تكييف أساليب والثقافة وسائل الإعلام وضعت لأول مرة لتنمو organoids المعوية، فإنها عزل Lgr5-GFP واحد+ خلايا السلف من CVP الماوس ومطلي لهم في هلام مصفوفة19. ولدت هذه الخلايا وحيدة organoids اللغوية التي تتكاثر خلال الأيام ال 6 الأولى من الثقافة، وتبدأ في التفريق حول اليوم 8، وبحلول نهاية فترة الثقافة تحتوي على خلايا الظهارية غير الذوق وجميع أنواع TRCالثلاثة 18،20. حتى الآن، وقد نشرت دراسات متعددة باستخدام نظام نموذج organoid لغوي17،18،20،21،22؛ ومع ذلك، تختلف الأساليب والظروف الثقافية المستخدمة لتوليد هذه الأجهزة العضوية عبر المنشورات(الجدول التكميلي 1). وهكذا، تم تعديل هذه الأساليب وتحسينها هنا لتقديم بروتوكول موحد مفصل لثقافة organoids اللغوية المستمدة من LGR5+ السلف من CVP الماوس الكبار.
توفر الأجهزة العضوية اللغوية نموذجا فريدا لدراسة العمليات البيولوجية للخلايا التي تقود تطور خلايا الذوق وتجديدها. مع توسع تطبيقات الأجهزة العضوية اللغوية والتحرك نحو استخدام المزيد من المختبرات في نماذج الجهازية المختبرية ، من المهم أن يسعى المجال إلى تطوير واعتماد بروتوكولات موحدة لتحسين القابلية للاستنساخ. إن إنشاء أعضاء لغوية كأداة قياسية في علم الذوق من شأنه أن يمكن دراسات الإنتاجية العالية التي تتباعد كيف تولد الخلايا الجذعية المفردة الخلايا المتمايزة لنظام ذوق البالغين. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام الأجهزة اللغوية لفحص الأدوية بسرعة للتأثيرات المحتملة على التوازن الذوقي ، والتي يمكن بعد ذلك التحقيق فيها بشكل أكثر شمولا في النماذج الحيوانية. وسيعزز هذا النهج في نهاية المطاف الجهود الرامية إلى ابتكار علاجات تحسن نوعية حياة متلقي الأدوية في المستقبل.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

يتم التوسط في حاسة الذوق من قبل براعم الذوق على اللسان ، والتي تتكون من خلايا مستقبلات الذوق المتجددة بسرعة (TRCs). هذا الدوران المستمر مدعوم من خلايا السلف المحلية ويجعل وظيفة الذوق عرضة للاضطراب من قبل العديد من العلاجات الطبية ، والتي بدورها تؤثر بشدة على نوعية الحياة. وبالتالي، فإن دراسة هذه العملية في سياق العلاج من المخدرات أمر حيوي لفهم ما إذا كانت وظيفة سلف الذوق وإنتاج TRC تتأثر وكيفية ذلك. وبالنظر إلى المخاوف الأخلاقية والتوافر المحدود لأنسجة الذوق البشري ، فإن نماذج الماوس ، التي لديها نظام طعم مشابه للبشر ، تستخدم عادة. بالمقارنة مع أساليب الجسم الحي ، والتي تستغرق وقتا طويلا ومكلفة وغير قابلة للدراسات عالية الإنتاجية ، يمكن أن تمكن الأجهزة اللغوية المورين من تشغيل التجارب بسرعة مع العديد من التكرارات وعدد أقل من الفئران. هنا، تم تكييف البروتوكولات المنشورة سابقا ويتم تقديم طريقة موحدة لتوليد الأجهزة العضوية الذوق من خلايا السلف الذوق معزولة عن الحليمة المحيطة (CVP) من الفئران البالغة. خلايا السلف الذوق في CVP التعبير LGR5 ويمكن عزلها عن طريق EGFP تفلور تنشيط فرز الخلايا (FACS) من الفئران التي تحمل Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 أليل. يتم صفيحة الخلايا المفرزة على نظام ثقافة ثلاثي الأبعاد قائم على هلام المصفوفة ومثقفة لمدة 12 يوما. الأجهزة العضوية توسيع لأول 6 أيام من فترة الثقافة عن طريق الانتشار ومن ثم الدخول في مرحلة التمايز، والتي تولد جميع أنواع الخلايا طعم ثلاثة جنبا إلى جنب مع الخلايا الظهارية غير الذوق. يمكن حصاد الأجهزة العضوية عند النضج في اليوم 12 أو في أي وقت أثناء عملية النمو للتعبير عن الحمض النووي الريبي والتحليل الكيميائي المناعي. توحيد أساليب الثقافة لإنتاج organoids لغوية من الخلايا الجذعية الكبار سوف يحسن استنساخ وتقدم organoids اللغوية كأداة قوية لفحص المخدرات في الكفاح من أجل مساعدة المرضى الذين يعانون من خلل الذوق.

الفئران لديها CVP واحد، وتقع الخلفي على اللسان، والتي يمكن عزل LGR5+ الخلايا الجذعية (الشكل 1A،الصندوق الأسود). حقن محلول إنزيم تحت وحول CVP(الشكل 1B)يؤدي إلى تورم طفيف في الظهارة وهضم النسيج الضام. يتم تحقيق هضم كاف بعد حضانة 33 دقيقة ، مما يسمح بفصل ?...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

يقدم البروتوكول طريقة لزراعة ومعالجة الأجهزة العضوية اللغوية المشتقة من الخلايا الجذعية المذاق المعزولة عن حليمة الذوق الخلفي للفئران البالغة.

جيل وثقافة Organoids اللغوية المستمدة من الخلايا الجذعية طعم الماوس الكبار

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Organoids هي قوية في تكنولوجيا المختبر المستخدمة لفحص المخدرات وفهم العمليات البيولوجية. لذلك ، فإن توليد الأجهزة العضوية التي نموذج اللسان أمر بالغ الأهمية لدراسة تطور خلية الذوق وتجديدها. يمكن أن تكون الدراسات التقليدية في الذوق الحي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا.يقدم هذا البروتوكول العضوي بديلا موحدا قابلا للاستنساخ يقلل من تلك التحديات مع السماح بتجارب إنتاجية أعلى. بعد القتل الرحيم فأرة الكبار، استخدم مقص تشريح معقم كبير لقطع الخدين وكسر الفك. ثم ارفع اللسان وقطع الفرينوم اللغوي لفصل اللسان عن أرضية التجويف الفموي.قطع اللسان وجمعه في dPBS الجليد الباردة العقيمة مع الكالسيوم والمغنيسيوم. تحت المجهر تشريح، وإزالة والتخلص من اللسان الأمامي عن طريق قطع فقط الأمامية من سماحة بين مالار مع شفرة حلاقة. ثم باستخدام مسح مهمة حساسة لإزالة أي شعر والسائل الزائد من اللسان الخلفي.بعد ذلك، ملء حقنة ملليلتر واحد مع 200 إلى 300 ميكرولتر من محلول إنزيم الحقن وإدراج إبرة نصف بوصة قياس 30 فقط فوق سماحة بين الملار حتى مجرد الأمامي من الحليمة circumvallate، أو CVP. حقن محلول الانزيم تحت وعلى الحواف الجانبية للCVP بين الظهارة والأنسجة الكامنة. سحب الحقنة ببطء وباستمرار من اللسان كما يتم حقن الحل.احتضان اللسان والكالسيوم المعقم خالية من المغنيسيوم dPBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 33 دقيقة على وجه التحديد. باستخدام مقص تشريح خارج غرامة، وجعل تخفيضات صغيرة في الظهارة ثنائيا وفقط الأمامية من CVP. ثم قشر بلطف الظهارة عن طريق رفعه مع ملقط غرامة.بمجرد أن تكون ظهارة الخندق خالية من النسيج الضام الأساسي ، ضعه في أنبوبين ميكروسينتر الطرد المركزي ملليلتر ، المغلفة مسبقا مع FBS. أضف كوكتيل إنزيم التفكك إلى الأنابيب التي تحتوي على ظهارة CVP المقشرة واحتضانها في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة مع دوامة قصيرة كل 15 دقيقة. خلال الدقائق ال 15 الأخيرة من الحضانة، قبل الحرب 0.25٪ تريبسين-EDTA في حمام الماء.بعد الحضانة، دوامة الأنابيب في triturate مع ماصة باستور الزجاج لمدة دقيقة واحدة. بعد قطع الأنسجة تسوية، ماصة supernatant تحتوي على المجموعة الأولى من الخلايا المفككة في FBS جديدة مغلفة أنابيب الطرد المركزي الدقيق 1.5 ملليلتر. تدور supernatant لمدة خمس دقائق في 370 مرة G وأربع درجات مئوية لبيليه الخلايا.إزالة supernatant الناتجة، ثم resuspend بيليه الخلية في العازلة FACS ويبقيه على الجليد. لتفكيك قطع الأنسجة المتبقية في أنابيب الطرد المركزي الدقيق الأصلية مليلتر، إضافة مسبقا 0.25٪ تريبسين-EDTA واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع دوامة قصيرة كل 10 دقائق. ثم، تريتورات قطع الأنسجة مع ماصة باستور الزجاج لمدة دقيقة واحدة.بعد أن تستقر قطع الأنسجة ، قم بتنقية الماصة الفائقة في أنابيب الطرد الدقيق 1.5 ملليلتر التي تحتوي على الخلايا المفككة التي تم جمعها سابقا في العازلة FACS. تدور الأنابيب مع الخلايا المفككة. بعد إزالة supernatant، resuspend الكريات الخلية في العازلة FACS والاحتفاظ بها على الجليد.ثم قم بعزل الخلايا الإيجابية Lgr5-GFP عبر FACS باستخدام قناة البروتين الفلوري الأخضر كما هو موضح في مخطوطة النص. نقل العدد المطلوب من Lgr5 الخلايا المعلقة إيجابية في أنبوب جديد microcentrifuge. تدور الأنبوب لمدة خمس دقائق في 370 مرة G وأربع درجات مئوية لبيليه الخلايا.إزالة supernatant ووضع الأنبوب على الجليد. إعادة إنفاق بلطف بيليه الخلية في الكمية المناسبة من هلام مصفوفة مع pipetting لطيف. ثم احتفظ بأنبوب الطرد المركزي الدقيق على الجليد في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر لمنع هلام المصفوفة من التبلور.إضافة 15 ميكرولتر من هلام مصفوفة في خليط الخلية في وسط كل بئر من لوحة 48 جيدا. لضمان توزيع الخلايا حتى، اخلطي جل المصفوفة وخليط الخلية عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا بعد طلاء كل ثلاثة آبار. ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و5٪ من ثاني أكسيد الكربون و95٪ رطوبة لمدة 10 دقائق للسماح بجل المصفوفة.ثم، إضافة 300 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة WENRAS وسائل الإعلام تكملها مع مثبط الصخور، Y27632، إلى كل بئر والعودة لوحة إلى الحاضنة. بعد يومين من الطلاء، قم بإزالة الوسائط من كل بئر باستخدام ماصة ملليلتر واحد أو عن طريق الشفط الفراغي، مما يضمن عدم وجود تلوث متقاطع بين الظروف. إضافة 300 ميكرولتر من وسائل الإعلام WENRAS أسفل الجانب من البئر، مع الحرص على عدم تعطيل هلام مصفوفة وإعادة لوحة إلى الحاضنة.عندما يتم استزراع الأجهزة اللغوية باستخدام وسائط WENR ، فإنها لا تنمو بكفاءة. ومع ذلك ، بعد إضافة A 83-01 ، مثبط إشارات TGF-beta ، وSB202190 ، P-38 خريطة كيناز إشارة المانع ، لوحظ نمو قوي. ومن المثير للاهتمام، وإزالة هذه المثبطات من وسائل الإعلام بعد ستة أيام يؤدي إلى ارتفاع التعبير عن علامة الخلية مستقبلات الذوق العام، Kcnq1، مما يشير إلى أن A 83-01 و SB-202190 تعوق التمايز خلية الذوق.وهكذا، يتم الحصول على النمو الأمثل والتمايز عن طريق زرع organoids في وسائل الإعلام WENRAS من اليوم صفر إلى ستة وسائل الإعلام و WENR من اليوم السادس إلى 12. تحتوي الأجهزة العضوية الناضجة على خلايا طعم تتميز بالكيراتين-8 والخلايا الظهارية غير المذاق التي تتميز بالكيراتين-13. علاوة على ذلك ، يتم التعبير عن الكيراتين-13 بمستويات أعلى من جميع علامات خلايا مستقبلات الذوق الثلاثة ، مما يشير إلى أن الأجهزة العضوية تتكون في الغالب من خلايا ظهارية غير مذوق.الأجهزة العضوية تعبر عن جميع أنواع الخلايا مستقبلات الذوق. يتم التعبير عن الخلايا من النوع الأول التي تتميز Entpd2 والنوع المر بخلايا اثنين تميزت Gnat3 بشكل كبير في الأجهزة العضوية الذوق ، في حين أن نوع الاستشعار الحامض ثلاث خلايا تميزت Car4 أقل شيوعا. يتم توزيع خلايا مستقبلات الذوق عشوائيا في organoids بدلا من هياكل برعم الذوق منفصلة لوحظ في الجسم الحي.تأكد من تضمين بعض الأنسجة الخلفية إلى CVP عند تشريح اللسان من تجويف الفم. بالإضافة إلى ذلك، تأكد من كلا الخنادق البوب ويتم الحصول عليها عند تقشير الظهارة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

العزلة وثقافة Neurospheres المستمدة الدماغ الكبار الزرد

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

إنتاج واسع النطاق العضلية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية باستخدام تكرار للغاية الصغيرة وبناء جزيء بروتوكول التمايز

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويدس الدماغي موحدة واستنساخه من نوع فوريبرين من الإنسان فعل الخلايا الجذعية Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

بالعزلة وثقافة الخلايا Epicardial الأولية المستمدة من عينات من قلب الكبار والأجنة البشرية

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

جيل أورجانويد الجلد 3D من سلك المستمدة من الدم الناجم عن الخلايا الجذعية Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

في المختبر توليد المشتقات سميط من البشرية التي يسببها الخلايا الجذعية Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

جيل أورجانويدس من القنوات الصفراوية اكستراهيباتيك الماوس

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

إعداد مكتبات RNA الصغيرة لتسلسل من أجنة الماوس المبكر

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

تعداد دقيق للجريب في مبايض الفئران للبالغين

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

جيل من 3D الجهازيات الرئة الكاملة من الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات لنمذجة البيولوجيا التنموية الرئة والمرض

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...