Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le Dr Peter Dempsey et Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) pour avoir fourni des médias conditionnés WNR et des discussions précieuses. Nous remercions également le Centre de cancérologie de l’Université du Colorado Cell Technologies et Flow Cytometry Shared Resources, en particulier Dmitry Baturin, pour son expertise en tri cellulaire. Ce travail a été financé par : NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, et NIH/NCI R21 CA236480 à LAB, et R21DC016131 et R21DC016131-02S1 à DG, et F32 DC015958 à EJG.

Toutes les procédures animales ont été effectuées dans un établissement accrédité par l’AAALAC conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, à la Loi sur le bien-être des animaux et à la Politique des services de santé publique, et ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) du campus médical Anschutz de l’Université du Colorado. Les souris Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 utilisées dans ce protocole proviennent...

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	<li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+renewal+in+gustation:+new+insights+into+taste+bud+development.">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li><li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+taste.">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li><li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).</li><li>Barlow, L. A., Klein, O. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation.">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li><li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+taste:+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals.">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li><li>Chaudhari, N., Roper, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples.">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+organoids:+engineering+the+vasculature.">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li></ol>

Il est rapporté ici une méthode efficace et facilement reproductible pour la culture, le maintien et le traitement des organoïdes linguaux dérivés de cellules souches de goût de souris adultes. Il a été constaté que l’utilisation de trois CV de souris Lgr5-EGFP âgées de 8 à 20 semaines est suffisante pour obtenir environ 10 000 cellules GFP+ à usage expérimental, ce qui donne 50 puits plaqués à une densité de 200 cellules par puits dans des plaques de 48 puits. L’élimination de l...

Chez les rongeurs, les papilles gustatives linguales sont logées dans des papilles fongiformes réparties antérieurement, des papilles foliées bilatérales postérieures, ainsi que dans une papille circumvallate unique (CVP) à la ligne médiane postodorale de la langue1. Chaque papille gustative est composée de 50 à 100 cellules réceptrices du goût (CRT) à courte durée de vie et à renouvellement rapide, qui comprennent des cellules de soutien de type I gliales, des cellules de type II qui détectent les cellules douces, amères et umami, et des cellules de type III qui détectent les cellulesacides 2,3,4. Chez la souris CVP, les cellules souches LGR5+ le long de la lame basale produisent tous les types de TRC ainsi que des cellules épithéliales sans goût5. Lors du renouvellement de la lignée gustative, les cellules filles LGR5 sont d’abord spécifiées comme des cellules précurseurs du goût post-mitotique (cellules de type IV) qui pénètrent dans une papille gustative et sont capables de se différencier dans l’un des trois types de TRC6. Le renouvellement rapide des CT rend le système gustatif sensible à la perturbation par les traitements médicaux, y compris les radiations et certaines pharmacothérapies7,8,9,10,11,12,13. Ainsi, l’étude du système gustatif dans le contexte de la régulation des cellules souches du goût et de la différenciation de la CVR est essentielle pour comprendre comment atténuer ou prévenir le dysfonctionnement du goût.
Les souris sont un modèle traditionnel pour les études in vivo en science du goût car elles ont un système gustatif organisé de la même manière que les humains14,15,16. Cependant, les souris ne sont pas idéales pour les études à haut débit, car elles sont coûteuses à entretenir et prennent beaucoup de temps à travailler. Pour surmonter ce problème, des méthodes de culture organoïde in vitro ont été développées ces dernières années. Les organoïdes gustatifs peuvent être générés à partir de tissu CVP natif, un processus dans lequel les organoïdes bourgeonnent à partir de l’épithélium CVP isolé de souris cultivé ex vivo17. Ces organoïdes présentent un épithélium multicouche compatible avec le système gustatif in vivo. Un moyen plus efficace de générer des organoïdes qui ne nécessitent pas de culture ex vivo de CVP a été développé par Ren etal. en 201418. Adaptant les méthodes et les milieux de culture d’abord développés pour développer des organoïdes intestinaux, ils ont isolé des cellules progéniatrices Lgr5-GFP+ uniques de souris CVP et les ont plaquées dans un gel matriciel19. Ces cellules uniques ont généré des organoïdes linguaux qui prolifèrent au cours des 6 premiers jours de culture, commencent à se différencier vers le jour 8 et, à la fin de la période de culture, contiennent des cellules épithéliales sans goût et les trois types de CCR18,20. À ce jour, de multiples études utilisant le système de modèle organoïde lingual ont été publiées17,18,20,21,22; toutefois, les méthodes et les conditions de culture utilisées pour générer ces organoïdes varient d’une publication à l’autre(tableau supplémentaire 1). Ainsi, ces méthodes ont été ajustées et optimisées ici pour présenter un protocole standardisé détaillé pour la culture d’organoïdes linguaux dérivés de LGR5+ progéniteurs de CVP de souris adultes.
Les organoïdes linguaux fournissent un modèle unique pour l’étude des processus biologiques cellulaires qui stimulent le développement et le renouvellement des cellules gustatives. Alors que les applications des organoïdes linguaux se développent et que de plus en plus de laboratoires s’orientent vers l’utilisation de modèles organoïdes in vitro, il est important que le domaine s’efforce de développer et d’adopter des protocoles standardisés pour améliorer la reproductibilité. L’établissement des organoïdes linguaux en tant qu’outil standard dans la science du goût permettrait des études à haut débit qui démêlent comment les cellules souches uniques génèrent les cellules différenciées du système gustatif adulte. De plus, des organoïdes linguaux pourraient être utilisés pour dépister rapidement les médicaments pour les impacts potentiels sur l’homéostasie du goût, qui pourraient ensuite être étudiés plus en profondeur dans des modèles animaux. En fin de compte, cette approche renforcera les efforts visant à concevoir des thérapies qui améliorent la qualité de vie des futurs receveurs de médicaments.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

Le sens du goût est médié par les papilles gustatives sur la langue, qui sont composées de cellules réceptrices du goût (CRT) qui se renouvellent rapidement. Ce renouvellement continu est alimenté par des cellules progénigènes locales et rend la fonction gustative sujette à la perturbation par une multitude de traitements médicaux, ce qui à son tour affecte gravement la qualité de vie. Ainsi, l’étude de ce processus dans le contexte du traitement médicamenteux est essentielle pour comprendre si et comment la fonction progéniteur du goût et la production de CCR sont affectées. Compte tenu des préoccupations éthiques et de la disponibilité limitée des tissus du goût humain, les modèles murins, qui ont un système gustatif similaire à celui des humains, sont couramment utilisés. Par rapport aux méthodes in vivo, qui prennent beaucoup de temps, sont coûteuses et ne se prêtent pas à des études à haut débit, les organoïdes linguaux murins peuvent permettre d’exécuter rapidement des expériences avec de nombreux répliquants et moins de souris. Ici, des protocoles précédemment publiés ont été adaptés et une méthode standardisée pour générer des organoïdes du goût à partir de cellules progénitres du goût isolées de la papille circumvallate (CVP) de souris adultes est présentée. Les cellules progénitaires du CVP expriment LGR5 et peuvent être isolées via le tri cellulaire activé par fluorescence EGFP (FACS) de souris porteuses d’un allèleLgr5 EGFP-IRES-CreERT2. Les cellules triées sont plaquées sur un système de culture 3D à base de gel matriciel et cultivées pendant 12 jours. Les organoïdes se développent pendant les 6 premiers jours de la période de culture par prolifération, puis entrent dans une phase de différenciation, au cours de laquelle ils génèrent les trois types de cellules gustatives ainsi que des cellules épithéliales sans goût. Les organoïdes peuvent être prélevés à maturation au jour 12 ou à tout moment pendant le processus de croissance pour l’expression de l’ARN et l’analyse immunohistochimique. La normalisation des méthodes de culture pour la production d’organoïdes linguaux à partir de cellules souches adultes améliorera la reproductibilité et fera progresser les organoïdes linguaux en tant qu’outil puissant de dépistage des médicaments dans la lutte contre les patients souffrant de dysfonctionnement du goût.

Les souris ont un CVP, situé postérieurement sur la langue, à partir duquel les cellules souches LGR5+ peuvent être isolées (Figure 1A, boîte noire). L’injection d’une solution enzymatique sous et autour du CVP(Figure 1B)entraîne un léger gonflement de l’épithélium et la digestion du tissu conjonctif. Une digestion suffisante est obtenue après une incubation de 33 minutes, ce qui permet de séparer facilement l’épi...

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Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Le protocole présente une méthode de culture et de traitement des organoïdes linguaux dérivés de cellules souches gustatives isolées de la papille gustative postérieure de souris adultes.

Génération et culture d’organoïdes linguals dérivés de cellules souches du goût de souris adultes

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Les organoïdes sont une technologie in vitro puissante utilisée pour le dépistage des médicaments et la compréhension des processus biologiques. Ainsi, la génération d’organoïdes qui modélisent la langue est cruciale pour étudier le développement et la régénération des cellules gustatives. Les études gustatives in vivo traditionnelles peuvent être coûteuses et prendre beaucoup de temps.Ce protocole organoïde offre une alternative standardisée et reproductible qui minimise ces défis tout en permettant des expériences à plus haut débit. Après avoir euthanasié une souris adulte, utilisez de gros ciseaux à dissection stériles pour couper les joues et casser la mâchoire. Ensuite, soulevez la langue et coupez le frein linguale pour séparer la langue du sol de la cavité buccale.Coupez la langue et recueillez-la dans du dPBS stérile glacé avec du calcium et du magnésium. Sous un microscope à dissection, retirez et jetez la langue antérieure en coupant juste avant l’éminence inter malaire avec une lame de rasoir. Ensuite, en utilisant une tâche délicate essuyez pour enlever les poils et l’excès de liquide de la langue postérieure.Ensuite, remplissez une seringue d’un millilitre avec 200 à 300 microlitres de solution enzymatique injectable et insérez une aiguille d’un demi-pouce de calibre 30 juste au-dessus de l’éminence intermalaire jusqu’à juste avant les papilles circumvallates, ou CVP. Injecter la solution enzymatique sous et sur les bords latéraux du CVP entre l’épithélium et les tissus sous-jacents. Retirez la seringue lentement et continuellement de la langue pendant l’injection de la solution.Incuber la langue et le dPBS stérile sans calcium et magnésium à température ambiante pendant 33 minutes précises. À l’aide de ciseaux à dissection extra-fins, faites de petites coupures dans l’épithélium bilatéralement et juste avant le CVP. Ensuite, pelez doucement l’épithélium en le soulevant avec une pince fine.Une fois que l’épithélium de la tranchée est libre du tissu conjonctif sous-jacent, placez-le dans un tube de microcentrifugation de deux millilitres, pré-enduit de FBS. Ajouter le cocktail d’enzymes de dissociation aux tubes contenant l’épithélium CVP pelé et les incuber dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 45 minutes avec un bref vortex toutes les 15 minutes. Au cours des 15 dernières minutes d’incubation, pré-pré-température 0,25% trypsine-EDTA au bain-marie.Après l’incubation, vortex les tubes en trituration avec une pipette Pasteur en verre pendant une minute. Une fois les morceaux de tissus réglés, pipettez le surnageant contenant la première collection de cellules dissociées dans de nouveaux tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre revêtus de FBS. Faites tourner le surnageant pendant cinq minutes à 370 fois G et quatre degrés Celsius pour granuler les cellules.Retirez le surnageant résultant, puis ressuspendez la pastille de cellule dans un tampon FACS et conservez-la sur la glace. Pour dissocier les morceaux de tissu restants dans les tubes de microcentrifugation d’origine de deux millilitres, ajoutez de la trypsine-EDTA préchauffée à 0,25% et incubez à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes avec un bref vortex toutes les 10 minutes. Ensuite, triturez les morceaux de tissu avec une pipette Pasteur en verre pendant une minute.Une fois les morceaux de tissus réglés, pipettez le surnageant dans les tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant les cellules dissociées précédemment collectées dans un tampon FACS. Faites tourner les tubes avec les cellules dissociées. Après avoir retiré le surnageant, ressuspendez les pastilles cellulaires dans un tampon FACS et conservez-les sur la glace.Ensuite, isolez les cellules Lgr5-GFP positives via FACS en utilisant le canal de protéine fluorescente verte comme décrit dans le manuscrit du texte. Transférer le nombre souhaité de cellules en suspension Lgr5 positives dans un nouveau tube de microcentrifugation. Faites tourner le tube pendant cinq minutes à 370 fois G et quatre degrés Celsius pour granuler les cellules.Retirez le surnageant et placez le tube sur de la glace. Remettez doucement en charge la pastille de cellule dans la quantité appropriée de gel matriciel avec un pipetage doux. Ensuite, gardez le tube de microcentrifugation sur de la glace dans un tube conique de 50 millilitres pour empêcher le gel matriciel de geler.Ajouter 15 microlitres du gel matriciel dans un mélange cellulaire au centre de chaque puits d’une plaque de 48 puits. Pour assurer une distribution uniforme des cellules, mélangez le gel matriciel et le mélange cellulaire en pipetant de haut en bas après le placage tous les trois puits. Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius, 5% de dioxyde de carbone et 95% d’humidité pendant 10 minutes pour permettre la gélification du gel matriciel.Ensuite, ajoutez 300 microlitres de milieu WENRAS à température ambiante complétés par l’inhibiteur de roche, Y27632, à chaque puits et retournez la plaque à l’incubateur. Deux jours après le placage, retirez le média de chaque puits à l’aide d’une pipette d’un millilitre ou par aspiration sous vide, en veillant à ce qu’il n’y ait pas de contamination croisée entre les conditions. Ajouter 300 microlitres de support WENRAS sur le côté du puits, en prenant soin de ne pas perturber le gel matriciel et de renvoyer la plaque à l’incubateur.Lorsque les organoïdes linguaux sont cultivés à l’aide de milieux WENR, ils ne se développent pas efficacement. Cependant, après avoir ajouté A 83-01, un inhibiteur de signalisation TGF-bêta, et SB202190, inhibiteur de signalisation de la carte kinase P-38, une croissance robuste est observée. Fait intéressant, l’élimination de ces inhibiteurs du milieu après six jours entraîne une expression plus élevée du marqueur général des cellules réceptrices du goût, Kcnq1, ce qui suggère que A 83-01 et SB-202190 entravent la différenciation des cellules gustatives.Ainsi, une croissance et une différenciation optimales sont obtenues en cultivant des organoïdes dans des milieux WENRAS du jour zéro au sixième jour et des milieux WENR du sixième au 12e jour. Les organoïdes matures contiennent à la fois des cellules gustatives marquées par la kératine-8 et des cellules épithéliales non gustatives marquées par la kératine-13. En outre, la kératine-13 est exprimée à des niveaux plus élevés que les trois marqueurs des cellules réceptrices du goût, ce qui suggère que les organoïdes sont principalement composés de cellules épithéliales sans goût.Les organoïdes expriment tous les types de cellules réceptrices du goût. Les cellules de type un marquées par Entpd2 et les cellules amères de type deux marquées par Gnat3 sont fortement exprimées en organoïdes gustatifs, tandis que les cellules de type trois à détection aigre marquées par Car4 sont moins courantes. Les cellules réceptrices du goût sont réparties aléatoirement dans les organoïdes plutôt que dans des structures discrètes des papilles gustatives observées in vivo.Assurez-vous d’inclure un peu de tissu postérieur au CVP lorsque vous disséquez la langue de la cavité buccale. De plus, assurez-vous que les deux tranchées sortent et sont obtenues lors du pelage de l’épithélium.

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Developmental Biology

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