Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

Die Autoren danken Dr. Peter Dempsey und Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) für die Bereitstellung von WNR-konditionierten Medien und wertvollen Diskussionen. Wir danken auch dem University of Colorado Cancer Center Cell Technologies und Flow Cytometry Shared Resources, insbesondere Dmitry Baturin, für die Expertise in der Zellsortierung. Diese Arbeit wurde finanziert durch: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 und NIH/NCI R21 CA236480 an LAB und R21DC016131 und R21DC016131-02S1 an DG und F32 DC015958 an EJG.

Alle Tierversuche wurden in einer AAALAC-akkreditierten Einrichtung in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren, dem Tierschutzgesetz und der Richtlinie des öffentlichen Gesundheitsdienstes durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Anschutz Medical Campus der University of Colorado genehmigt. Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 Mäuse, die in diesem Protokoll verwendet werden, stammen vom Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
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Hier wird eine effiziente und leicht wiederholbare Methode zur Kultivierung, Aufrechterhaltung und Verarbeitung von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen berichtet. Es wurde festgestellt, dass die Verwendung von drei CVPs von 8 bis 20 Wochen alten Lgr5 -EGFP-Mäusen ausreicht, um ~ 10.000 GFP+ -Zellen für den experimentellen Einsatz zu erhalten, was zu 50 Wells mit einer Dichte von 200 Zellen pro Well in 48-Well-Platten führt. Die Entfernung von CVP-Grabenepithelien wird optimie...

Bei Nagetieren sind linguale Geschmacksknospen in fungiformen Papillen untergebracht, die anterior verteilt sind, bilaterale Blattpapillen nach dem Hinterteil sowie eine einzelne zirkumvallate Papille (CVP) an der posterodorsalen Mittellinie der Zunge1. Jede Geschmacksknospen besteht aus 50-100 kurzlebigen, sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs), zu denen gliaartige Unterstützungszellen vom Typ I, Zellen vom Typ II, die süße, bittere und Umami erkennen, und Typ III-Zellen, die saure2,3,4erkennen , umfassen. Im CVP der Maus produzieren LGR5+ Stammzellen entlang der Basallamina alle TRC-Typen sowie Nicht-Geschmacksepithelzellen5. Bei der Erneuerung der Geschmackslinie werden LGR5-Tochterzellen zunächst als postmiotische Geschmacksvorläuferzellen (Typ IV-Zellen) spezifiziert, die in eine Geschmacksknospen eintreten und in der Lage sind, sich in einen der drei TRC-Typen6 zudifferenzieren. Der schnelle Umsatz von TRCs macht das Geschmackssystem anfällig für Störungen durch medizinische Behandlungen, einschließlich Bestrahlung und bestimmter medikamentöser Therapien7,8,9,10,11,12,13. Daher ist die Untersuchung des Geschmackssystems im Kontext der Regulierung von Geschmacksstammzellen und der TRC-Differenzierung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, wie Geschmacksstörungen gemildert oder verhindert werden können.
Mäuse sind ein traditionelles Modell für In-vivo-Studien in der Geschmackswissenschaft, da sie ein Geschmackssystem haben, das ähnlich wie Menschen organisiert ist14,15,16. Mäuse sind jedoch nicht ideal für Studien mit hohem Durchsatz, da sie teuer in der Wartung und zeitaufwendig in der Arbeit sind. Um dies zu überwinden, wurden in den letzten Jahren in vitro Organoidkulturmethoden entwickelt. Geschmacksorganoide können aus nativem CVP-Gewebe erzeugt werden, einem Prozess, bei dem Organoide aus isoliertem Maus-CVP-Epithel abknabknabken, das ex vivo17kultiviert wird. Diese Organoide zeigen ein mehrschichtiges Epithel, das mit dem In-vivo-Geschmackssystem übereinstimmt. Ein effizienterer Weg zur Erzeugung von Organoiden, die keine Ex-vivo-CVP-Kultur erfordern, wurde von Ren etal. im Jahr 201418entwickelt. Sie adaptierten Methoden und Nährmedien, die zuerst entwickelt wurden, um Darmorganoide zu züchten, isolierten einzelne Lgr5-GFP+ Vorläuferzellen aus Maus-CVP und plattierten sie mit Matrixgel19. Diese einzelnen Zellen erzeugten linguale Organoide, die sich während der ersten 6 Tage der Kultur vermehren, beginnen sich um Tag 8 zu differenzieren und enthalten am Ende der Kulturperiode nicht schmeckende Epithelzellen und alle drei TRC-Typen18,20. Bis heute wurden mehrere Studien veröffentlicht, die das linguale Organoidmodellsystem verwenden17,18,20,21,22; Die Methoden und Kulturbedingungen, die zur Erzeugung dieser Organoide verwendet werden, variieren jedoch je nach Veröffentlichung (Ergänzende Tabelle 1). Daher wurden diese Methoden hier angepasst und optimiert, um ein detailliertes standardisiertes Protokoll für die Kultur von lingualen Organoiden zu präsentieren, die von LGR5+ Vorläufern der adulten Maus CVP abgeleitet sind.
Linguale Organoide bieten ein einzigartiges Modell für die Untersuchung der zellbiologischen Prozesse, die die Entwicklung und Erneuerung von Geschmackszellen vorantreiben. Da sich die Anwendungen von lingualen Organoiden ausweiten und immer mehr Labore sich der Verwendung von In-vitro-Organoidmodellen zuwenden, ist es wichtig, dass das Feld bestrebt ist, standardisierte Protokolle zu entwickeln und einzuführen, um die Reproduzierbarkeit zu verbessern. Die Etablierung von lingualen Organoiden als Standardwerkzeug in der Geschmackswissenschaft würde Hochdurchsatzstudien ermöglichen, die auseinandernehmen, wie einzelne Stammzellen die differenzierten Zellen des adulten Geschmackssystems erzeugen. Darüber hinaus könnten linguale Organoide eingesetzt werden, um Medikamente schnell auf mögliche Auswirkungen auf die Geschmacksöostase zu untersuchen, die dann in Tiermodellen gründlicher untersucht werden könnten. Dieser Ansatz wird letztendlich die Bemühungen verstärken, Therapien zu entwickeln, die die Lebensqualität zukünftiger Arzneimittelempfänger verbessern.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

Der Geschmackssinn wird durch Geschmacksknospen auf der Zunge vermittelt, die sich aus sich schnell erneuernden Geschmacksrezeptorzellen (TRCs) zusammensetzen. Dieser kontinuierliche Umsatz wird von lokalen Vorläuferzellen angetrieben und macht die Geschmacksfunktion anfällig für Störungen durch eine Vielzahl von medizinischen Behandlungen, was wiederum die Lebensqualität stark beeinträchtigt. Daher ist die Untersuchung dieses Prozesses im Kontext der medikamentösen Behandlung von entscheidender Bedeutung, um zu verstehen, ob und wie die Funktion des Geschmacksvorläufers und die TRC-Produktion beeinflusst werden. Angesichts der ethischen Bedenken und der begrenzten Verfügbarkeit von menschlichem Geschmacksgewebe werden häufig Mausmodelle verwendet, die ein ähnliches Geschmackssystem wie der Mensch haben. Im Vergleich zu In-vivo-Methoden, die zeitaufwendig, teuer und für Hochdurchsatzstudien nicht nutzbar sind, können murine linguale Organoide experimente mit vielen Replikaten und weniger Mäusen schnell durchführen. Hier wurden zuvor veröffentlichte Protokolle angepasst und eine standardisierte Methode zur Erzeugung von Geschmacksorganoiden aus Geschmacksvorläuferzellen vorgestellt, die aus der Circumvallat-Papille (CVP) erwachsener Mäuse isoliert wurden. Geschmacksvorläuferzellen im CVP exprimieren LGR5 und können mittels EGFP-Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) von Mäusen isoliert werden, die ein Lgr5EGFP-IRES-CreERT2-Allel tragen. Sortierte Zellen werden auf ein Matrix-Gel-basiertes 3D-Kultursystem auf plattiert und 12 Tage lang kultiviert. Organoide dehnen sich für die ersten 6 Tage der Kulturperiode durch Proliferation aus und treten dann in eine Differenzierungsphase ein, in der sie alle drei Geschmackszelltypen zusammen mit Nicht-Geschmacksepithelzellen erzeugen. Organoide können bei der Reifung am Tag 12 oder jederzeit während des Wachstumsprozesses für die RNA-Expression und immunhistochemische Analyse entnommen werden. Die Standardisierung von Kulturmethoden zur Herstellung von lingualen Organoiden aus adulten Stammzellen wird die Reproduzierbarkeit verbessern und linguale Organoide als leistungsfähiges Arzneimittel-Screening-Werkzeug im Kampf gegen Patienten mit Geschmacksstörungen fördern.

Mäuse haben ein CVP, das sich posterior auf der Zunge befindet, aus dem LGR5+ Stammzellen isoliert werden können (Abbildung 1A, Black Box). Die Injektion einer Enzymlösung unter und um das CVP (Abbildung 1B) führt zu einer leichten Schwellung des Epithels und einer Verdauung des Bindegewebes. Eine ausreichende Verdauung wird nach einer 33-minütigen Inkubation erreicht, die eine einfache Trennung des CVP-Epithels vom darunter lieg...

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Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Das Protokoll stellt eine Methode zur Kultivierung und Verarbeitung von lingualen Organoiden vor, die aus Geschmacksstammzellen gewonnen werden, die aus der hinteren Geschmackspapille erwachsener Mäuse isoliert wurden.

Erzeugung und Kultur von lingualen Organoiden aus adulten Mausgeschmacksstammzellen

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Organoide sind eine leistungsstarke In-vitro-Technologie, die für das Screening von Medikamenten und das Verständnis biologischer Prozesse verwendet wird. Daher ist die Erzeugung von Organoiden, die die Zunge modellieren, entscheidend für die Untersuchung der Entwicklung und Regeneration von Geschmackszellen. Traditionelle In-vivo-Geschmacksstudien können teuer und zeitaufwendig sein.Dieses Organoidprotokoll bietet eine standardisierte, reproduzierbare Alternative, die diese Herausforderungen minimiert und gleichzeitig Experimente mit höherem Durchsatz ermöglicht. Nachdem Sie eine erwachsene Maus eingeschläfert haben, verwenden Sie eine große sterile Dissektionsschere, um die Wangen zu schneiden und den Kiefer zu brechen. Heben Sie dann die Zunge an und schneiden Sie das linguale Frenulum, um die Zunge vom Boden der Mundhöhle zu trennen.Schneiden Sie die Zunge aus und sammeln Sie sie in sterilen eiskalten dPBS mit Kalzium und Magnesium. Entfernen und entsorgen Sie unter einem Seziermikroskop die vordere Zunge, indem Sie nur die vordere der intermalaren Eminenz mit einer Rasierklinge schneiden. Dann verwenden Sie ein zartes Aufgabentuch, um Haare und überschüssige Flüssigkeit von der hinteren Zunge zu entfernen.Als nächstes füllen Sie eine Ein-Milliliter-Spritze mit 200 bis 300 Mikrolitern Injektionsenzymlösung und führen Sie eine 30-Gauge-Halbzollnadel direkt über der Intermalar-Eminenz ein, bis sie nur vor den zirkumvallaten Papillen oder CVP liegt. Injizieren Sie die Enzymlösung unter und an den seitlichen Rändern des CVP zwischen dem Epithel und den darunter liegenden Geweben. Ziehen Sie die Spritze langsam und kontinuierlich aus der Zunge, während die Lösung injiziert wird.Inkubieren Sie die Zunge und steriles calciummagnesiumfreies dPBS bei Raumtemperatur für genau 33 Minuten. Machen Sie mit einer extrafeinen Dissektionsschere kleine Schnitte im Epithel bilateral und nur vor dem CVP. Dann schälen Sie das Epithel vorsichtig, indem Sie es mit einer feinen Zette anheben.Sobald das Grabenepithel frei vom darunter liegenden Bindegewebe ist, legen Sie es in zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, die mit FBS vorbeschichtet sind. Fügen Sie den Dissoziationsenzymcocktail zu den Röhrchen hinzu, die das geschälte CVP-Epithel enthalten, und inkubieren Sie sie in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad für 45 Minuten mit einem kurzen Wirbel alle 15 Minuten. Während der letzten 15 Minuten der Inkubation 0,25% Trypsin-EDTA im Wasserbad vorwärmen.Nach der Inkubation die Rohre in Triturate mit einer Glas-Pasteur-Pipette für eine Minute vortexen. Nachdem sich die Gewebestücke absetzen, pipetieren Sie den Überstand, der die erste Sammlung dissoziierter Zellen enthält, in neue FBS-beschichtete 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie den Überstand fünf Minuten lang bei 370 mal G und vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.Entfernen Sie den resultierenden Überstand, schalten Sie das Zellpellet im FACS-Puffer wieder auf und halten Sie es auf Eis. Um die verbleibenden Gewebestücke in den ursprünglichen zwei Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu dissoziieren, fügen Sie vorgewärmte 0,25% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten mit kurzem Wirbeln alle 10 Minuten. Dann triturieren Sie die Gewebestücke mit einer Pasteur-Pipette aus Glas für eine Minute.Nachdem sich die Gewebestücke absetzen, pipetieren Sie den Überstand in die 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen, die die zuvor gesammelten dissoziierten Zellen im FACS-Puffer enthalten. Drehen Sie die Röhrchen mit den dissoziierten Zellen. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, resuspendieren Sie die Zellpellets im FACS-Puffer und halten Sie sie auf Eis.Isolieren Sie dann die Lgr5-GFP-positiven Zellen über FACS mit dem grün fluoreszierenden Proteinkanal, wie im Textmanuskript beschrieben. Übertragen Sie die gewünschte Anzahl von Lgr5-positiven suspendierten Zellen in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen. Drehen Sie das Röhrchen fünf Minuten lang bei 370 mal G und vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.Entfernen Sie den Überstand und legen Sie das Rohr auf Eis. Das Zellpellet in der entsprechenden Menge Matrixgel mit schonender Pipetierung vorsichtig wieder aufregen. Halten Sie dann das Mikrozentrifugenrohr in einem 50 Milliliter konischen Röhrchen auf Eis, um zu verhindern, dass das Matrixgel geliert.Fügen Sie 15 Mikroliter des Matrixgels in Zellmischung in der Mitte jeder Vertiefung einer 48-Well-Platte hinzu. Um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten, mischen Sie das Matrixgel und die Zellmischung durch Pipettieren nach dem Galvanisieren alle drei Vertiefungen. Legen Sie die Platte für 10 Minuten in einen Inkubator bei 37 Grad Celsius, 5% Kohlendioxid und 95% Luftfeuchtigkeit, um das Gelier des Matrixgels zu ermöglichen.Dann fügen Sie 300 Mikroliter WENRAS-Medien bei Raumtemperatur, ergänzt mit dem Gesteinsinhibitor Y27632, zu jeder Vertiefung hinzu und geben Sie die Platte in den Inkubator zurück. Entfernen Sie das Medium zwei Tage nach dem Plattieren mit einer Ein-Milliliter-Pipette oder per Vakuumaspiration aus jeder Vertiefung, um sicherzustellen, dass keine Kreuzkontamination zwischen den Bedingungen erfolgt. Fügen Sie 300 Mikroliter WENRAS-Medien an der Seite des Brunnens hinzu, achten Sie darauf, das Matrixgel nicht zu stören und die Platte in den Inkubator zurückzusenden.Wenn linguale Organoide mit WENR-Medien kultiviert werden, wachsen sie nicht effizient. Nach Zugabe von A 83-01, einem TGF-beta-Signalinhibitor, und SB202190, P-38-Map-Kinase-Signalinhibitor, wird jedoch ein robustes Wachstum beobachtet. Interessanterweise führt das Entfernen dieser Inhibitoren aus dem Medium nach sechs Tagen zu einer höheren Expression des allgemeinen Geschmacksrezeptorzellmarkers Kcnq1, was darauf hindeutet, dass A 83-01 und SB-202190 die Differenzierung von Geschmackszellen behindern.So wird ein optimales Wachstum und eine optimale Differenzierung erreicht, indem Organoide in WENRAS-Medien von Tag Null bis Sechs und WENR-Medien von Tag sechs bis 12 Kultivierungen erhalten werden. Reife Organoide enthalten sowohl Geschmackszellen, die durch Keratin-8 gekennzeichnet sind, als auch Nicht-Geschmacksepithelzellen, die durch Keratin-13 gekennzeichnet sind. Darüber hinaus wird Keratin-13 in höheren Konzentrationen exprimiert als alle drei Geschmacksrezeptorzellmarker, was darauf hindeutet, dass Organoide überwiegend aus nicht schmeckenden Epithelzellen bestehen.Die Organoide exprimiert alle Geschmacksrezeptorzelltypen. Typ-eins-Zellen, die durch Entpd2 gekennzeichnet sind, und bittere Typ-Zwei-Zellen, die durch Gnat3 gekennzeichnet sind, werden in Geschmacksorganoiden stark exprimiert, während sauer schmeckende Typ-Drei-Zellen, die durch Car4 markiert sind, seltener sind. Die Geschmacksrezeptorzellen sind zufällig in den Organoiden verteilt und nicht in diskreten Geschmacksknospenstrukturen, die in vivo beobachtet werden.Stellen Sie sicher, dass Sie etwas Gewebe posterior in das CVP aufnehmen, wenn Sie die Zunge aus der Mundhöhle sezieren. Stellen Sie außerdem sicher, dass beide Gräben herausspringen und beim Schälen des Epithels erhalten werden.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Die Großproduktion von Kardiomyozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen hochreproduzierbarer Kleinmolekül-basierte Differenzierung Protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von standardisierten und reproduzierbaren Vorderhirn-Typ zerebralen Organellen aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Die Isolation und die Kultur der primären Epicardial Zellen aus menschlichen Erwachsenen und fetalen Herzens Exemplare

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generation von 3D Haut organoide aus Cord Blood-abgeleitete induzierte pluripotente Stammzellen

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In vitro-Generation der Somiten Derivate aus menschlichen induzierten Zellen pluripotenten Stammzellen

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generation von Organellen von Maus extrahepatische Gallenwege

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Vorbereitung kleiner RNA-Bibliotheken für die Sequenzierung von frühen Mausembryonen

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Genaue Follikel-Aufzählung in adulten Maus-Ovarien

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generierung von 3D-Ganzlungenorganoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen zur Modellierung der Lungenentwicklungsbiologie und -krankheit

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...