Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לד"ר פיטר דמפסי ומוניקה בראון (אוניברסיטת קולורדו Anschutz קמפוס רפואי Organoid ורקמות מודל משאב משותף) על מתן מדיה מותנית WNR ודיונים יקרי ערך. אנו מודים גם לטכנולוגיות התאים של מרכז הסרטן של אוניברסיטת קולורדו ולמשאבים משותפים של Cytometry זרימה, במיוחד דמיטרי בטורין, על מומחיות במיון תאים. עבודה זו מומנה על-ידי: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, ו- NIH/NCI R21 CA236480 ל- LAB, ו- R21DC016131 ו- R21DC016131-02S1 ל- DG, ו- F32 DC015958 ל- EJG.

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו במתקן מוסמך AAALAC בהתאם למדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה, חוק רווחת בעלי חיים ומדיניות שירות בריאות הציבור, ואושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) בקמפוס הרפואי של אוניברסיטת קולורדו Anschutz. עכברי Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 המשמשים בפרוטוקול זה הם ממעבד...

<ol>
	<li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+renewal+in+gustation:+new+insights+into+taste+bud+development.">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li><li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+taste.">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li><li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).</li><li>Barlow, L. A., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+and+regenerating+a+sense+of+taste.">Developing and regenerating a sense of taste.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).</li><li>Yee, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5-EGFP+marks+taste+bud+stem/progenitor+cells+in+posterior+tongue.">Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue.</a> Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).</li><li>Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog-expressing+basal+cells+are+general+post-mitotic+precursors+of+functional+taste+receptor+cells.">Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).</li><li>Deshpande, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-related+alterations+of+taste+function+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+systematic+review.">Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review.</a> Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).</li><li>Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+changes+from+cancer+treatment+and+their+effects+on+patients'+food+behavior:+A+scoping+review.">Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review.</a> Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).</li><li>Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+taste+disorders.">Drug-induced taste disorders.</a> Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).</li><li>Kumari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+taste+organs+and+sensory+function+after+severe+loss+from+Hedgehog/Smoothened+inhibition+with+cancer+drug+sonidegib.">Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).</li><li>Ermilov, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+taste+organs+is+strictly+dependent+on+epithelial+hedgehog/gli+signaling.">Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling.</a> PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).</li><li>Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionated+head+and+neck+irradiation+impacts+taste+progenitors,+differentiated+taste+cells,+and+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+adult+mice.">Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/&#946;-catenin signaling in adult mice.</a> Scientific Reports. 9, 17934 (2019).</li><li>Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation.">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li><li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+taste:+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals.">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li><li>Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+taste.">The cell biology of taste.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).</li><li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+taste+perception.">Mammalian taste perception.</a> Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).</li><li>Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+stem/progenitor+cell+cycle+using+murine+circumvallate+papilla+taste+bud+organoid.">Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid.</a> Scientific Reports. 5, 17185 (2015).</li><li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem/progenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo.">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation.">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7, 4004 (2017).</li><li>Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+inflammatory+cytokine+expression+in+taste+organoids.">Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids.</a> Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin+substitutes+for+neuronal+input+for+taste+cell+regeneration+in+adult+mice.">R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li><li>Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples.">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li><li>Ekert, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommended+guidelines+for+developing,+qualifying,+and+implementing+complex+in+vitro+models+(CIVMs)+for+drug+discovery.">Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 25 (10), 1174-1190 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance.">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).</li><li>Vintschgau, M. v., H&#246;nigschmied, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervus+glossopharyngeus+und+schmeckbecher.">Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher.</a> Archiv f&#252;r die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).</li><li>Liu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Shh+signaling+centers+participate+in+fungiform+papilla+and+taste+bud+formation+and+maintenance.">Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance.</a> Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system.">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li><li>Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+organoids:+engineering+the+vasculature.">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li></ol>

דיווח כאן היא שיטה יעילה וניתן לחזור בקלות עבור culturing, תחזוקה, ועיבוד organoids לשוני נגזר מתאי גזע טעם עכבר למבוגרים. נמצא כי שימוש בשלושה CVPs מ Lgr5 בן 8 עד 20 שבועות-עכברי EGFP מספיק כדי להשיג ~ 10,000 GFP+ תאים לשימוש ניסיוני, וכתוצאה מכך 50 בארות מצופות בצפיפות של 200 תאים לבאר בלוחות 48-well. הסרת א?...

במכרסמים, בלוטות טעם לשוניות שוכנות בפפילות פטריות המופצות בחלק הקדמי, פפילאות עלווה דו-צדדיות אחוריות, כמו גם פפילה אחת (CVP) בקו האמצע posterodorsal של הלשון1. כל בלוטות טעם מורכבת מ-50-100 תאי קולטן טעם קצרי מועד המתחדשים במהירות (TRCs), הכוללים תאי תמיכה דמויי גליה מסוג I, תאי סוג II המזהים מתוקים, מרירים ואומאמי, ותאי סוג III המזהים חמוצים2,3,4. ב- CVP העכבר, LGR5+ תאי גזע לאורך הלמינה הבזלת מייצרים את כל סוגי ה- TRC, כמו גם תאים אפיתל שאינםטעם 5. בעת חידוש שושלת הטעם, תאי הבת של LGR5 מצוינים לראשונה כתאי מבשר טעם פוסט-מיוטי (תאי IV מסוג) המוזנים לבלוטות טעם ומסוגלים להבדיל לכל אחד משלושת סוגי TRC6. המחזור המהיר של TRCs הופך את מערכת הטעם רגישה לשיבושים על ידי טיפולים רפואיים, כולל קרינה וטיפולים תרופתיים מסוימים7,8,9,10,11,12,13. לכן, לימוד מערכת הטעם בהקשר של ויסות תאי גזע טעם ובידול TRC חיוני להבנת כיצד להקל או למנוע תפקוד לקוי של הטעם.
עכברים הם מודל מסורתי למחקרי in vivo במדעי הטעם שכן יש להם מערכת טעם מאורגנת בדומה לבני אדם14,15,16. עם זאת, עכברים אינם אידיאליים עבור מחקרים תפוקה גבוהה, כפי שהם יקרים לתחזוקה זמן רב לעבוד עם. כדי להתגבר על זה, שיטות תרבות האורגנויד במבחנה פותחו בשנים האחרונות. אורגנוידים טעם יכול להיווצר מרקמת CVP מקורית, תהליך שבו organoids ניצן מן האפיתל CVP עכבר מבודד תרבית ex vivo17. אורגנוידים אלה מציגים אפיתל רב שכבתי העולה בקנה אחד עם מערכת הטעם של in vivo. דרך יעילה יותר ליצור organoids שאינו דורש תרבות CVP ex vivo פותחה על ידי רן ואח'בשנת 201418. התאמת שיטות ומדיה תרבית שפותחה לראשונה כדי לגדל organoids מעיים, הם בודדו Lgr5-GFP+ תאי אבות יחידים מ CVP העכבר וציפו אותם בג'ל מטריצה19. תאים בודדים אלה יצרו אורגנוידים לשוניים המתרבים במהלך 6 הימים הראשונים של התרבות, מתחילים להבדיל סביב יום 8, ועד סוף תקופת התרבות מכילים תאים אפיתל שאינם טעם וכל שלושת סוגי TRC18,20. עד כה פורסמו מחקרים רבים המשתמשים במערכת מודל האורגנויד הלינגואלי17,18,20,21,22; עם זאת, שיטות ותנאי תרבות המשמשים ליצירת organoids אלה משתנים בין פרסומים (טבלה משלימה 1). לכן, שיטות אלה הותאמו ומותאמו כאן כדי להציג פרוטוקול סטנדרטי מפורט לתרבות האורגנוידים הלשויים הנגזרים מ- LGR5+ אבות של CVP עכבר מבוגר.
אורגנוידים לשוניים מספקים מודל ייחודי לחקר התהליכים הביולוגיים של התא המניעים את התפתחות והתחדשות תאי הטעם. ככל שהיישומים של אורגנוידים לשוניים מתרחבים ומעבדות נוספות נעות לכיוון ניצול מודלים אורגנוידים במבחנה, חשוב שהתחום ישאף לפתח ולאמץ פרוטוקולים סטנדרטיים לשיפור יכולת הרבייה. הקמת organoids לשוני ככלי סטנדרטי במדעי הטעם תאפשר מחקרי תפוקה גבוהה להקניט לגזרים כיצד תאי גזע בודדים ליצור את התאים המובחנים של מערכת הטעם הבוגרת. בנוסף, אורגנוידים לשוניים יכולים להיות מועסקים כדי לסנן במהירות תרופות עבור השפעות פוטנציאליות על הומאוסטזיס טעם, אשר לאחר מכן ניתן לחקור ביסודיות רבה יותר במודלים בעלי חיים. גישה זו בסופו של דבר תגביר את המאמצים לתכנן טיפולים שישפרו את איכות החיים של מקבלי תרופות עתידיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

חוש הטעם מתווך על ידי בלוטות טעם על הלשון, אשר מורכבים תאים קולטן טעם מתחדש במהירות (TRCs). מחזור מתמשך זה מופעל על ידי תאי אבות מקומיים והופך את תפקוד הטעם נוטה לשיבוש על ידי שפע של טיפולים רפואיים, אשר בתורו משפיע קשות על איכות החיים. לכן, לימוד תהליך זה בהקשר של טיפול תרופתי חיוני כדי להבין אם וכיצד תפקוד אבות הטעם וייצור TRC מושפעים. בהתחשב בדאגות האתיות ובזמינות המוגבלת של רקמת הטעם האנושית, מודלים של עכברים, שיש להם מערכת טעם דומה לבני אדם, נמצאים בשימוש נפוץ. בהשוואה לשיטות ויוו, שגוזלות זמן רב, יקרות, ולא נוחות למחקרי תפוקה גבוהים, אורגנוידים לשוניים של מורין יכולים לאפשר ניסויים להתנהל במהירות עם שכפולים רבים ופחות עכברים. כאן, פרוטוקולים שפורסמו בעבר הותאמו וגישה שיטה סטנדרטית ליצירת אורגנוידים של טעם מתאי אבות טעם המבודדים מהפאפילה המקיפה (CVP) של עכברים בוגרים. טעם תאי אבות ב- CVP אקספרס LGR5 וניתן לבודדם באמצעות מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS) מעכברים הנושאים אלל Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. תאים ממוינים מצופים במערכת תרבית תלת-ממדית מבוססת ג'ל מטריצה ומתרבתים במשך 12 יום. Organoids להרחיב במשך 6 הימים הראשונים של תקופת התרבות באמצעות התפשטות ולאחר מכן להיכנס לשלב בידול, שבמהלכו הם מייצרים את כל שלושת סוגי תאי הטעם יחד עם תאים אפיתל שאינם טעם. אורגנוידים ניתן לקצור עם ההתבגרות ביום 12 או בכל עת במהלך תהליך הצמיחה עבור ביטוי RNA וניתוח אימונוהיסטוכימי. סטנדרטיזציה של שיטות תרבות לייצור אורגנוידים לשוניים מתאי גזע בוגרים תשפר את הרבייה ותקדם אורגנוידים לשוניים ככלי סינון תרופות רב עוצמה במאבק כדי לעזור לחולים חווים תפקוד לקוי של הטעם.

לעכברים יש CVP אחד, הממוקם בחלק האחורי של הלשון, שממנו ניתן לבודד תאי LGR5+ גזע(איור 1A, קופסהשחורה). הזרקת תמיסת אנזימים מתחת ל- CVP ובסביבתהגורמתלנפיחות קלה של האפיתל והעיכול של רקמת החיבור. עיכול מספיק מושגת לאחר דגירה של 33 דקות, המאפשרת הפרדה קלה ...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

הפרוטוקול מציג שיטה לפולחן ועיבוד אורגנוידים לשוניים הנגזרים מתאי גזע טעם מבודדים מהטעם האחורי של עכברים בוגרים.

דור ותרבות של אורגנוידים לשוניים המופקים מתאי גזע של טעם עכבר בוגר

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Organoids הם טכנולוגיית במבחנה רבת עוצמה המשמשת לבדיקת תרופות והבנת תהליכים ביולוגיים. לכן, יצירת אורגנוידים שמדגמים את הלשון חיונית לחקר התפתחות תאי הטעם והתחדשות. מחקרי טעם מסורתיים ב-vivo יכולים להיות יקרים וגוזלי זמן רב.פרוטוקול organoid זה מציע חלופה סטנדרטית, לשחזור הממזערת אתגרים אלה תוך מתן אפשרות לניסויי תפוקה גבוהים יותר. לאחר המתת חסד עכבר מבוגר, להשתמש מספריים גדולים סטריליים לחתוך את הלחיים ולשבור את הלסת. לאחר מכן, להרים את הלשון לחתוך את frenulum לשוני להפריד את הלשון מרצפת חלל הפה.חותכים את הלשון ולאסוף אותו ב- dPBS קר כקרח סטרילי עם סידן ומגנזיום. תחת מיקרוסקופ מנתח, להסיר ולהשליך את הלשון השמאלית על ידי חיתוך רק קה-ביניים של הוד מוהר הבין-מאלי עם סכין גילוח. לאחר מכן באמצעות מנגב משימה עדין כדי להסיר כל שיער ונוזל עודף מן הלשון האחורית.לאחר מכן, מלא מזרק מיליליטר אחד עם 200 עד 300 microliters של פתרון אנזימי הזרקה ולהכניס מחט 30 מד חצי אינץ 'רק מעל המעמד הבין מלרי עד רק קהור של papillae circumlate, או CVP. הזריקו את תמיסת האנזים מתחת ובקצוות לרוחב של ה- CVP בין האפיתל לרקמות הבסיסיות. למשוך את המזרק לאט וברצף מן הלשון כמו הפתרון מוזרק.לדגור על הלשון ואת ה- dPBS נטול מגנזיום סטרילי בטמפרטורת החדר למשך 33 דקות בדיוק. באמצעות מספריים חתך דק במיוחד, לעשות חתכים קטנים אפיתל דו-צדדית רק קהורי של CVP. ואז בעדינות לקלף את האפיתל על ידי הרמתו עם מלקחיים עדינים.ברגע שאפיתל התעלה הוא ללא רקמת החיבור הבסיסית, למקם אותו לתוך שני מיליליטר צינור microcentrifuge, מצופה מראש עם FBS. מוסיפים את קוקטייל אנזימי הדיסוציאציה לצינורות המכילים את אפיתליה CVP קלופה ודגר אותם באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עם מערבולת קצרה כל 15 דקות. במהלך 15 הדקות האחרונות של הדגירה, לפני המלחמה 0.25%טריפסין-EDTA באמבט המים.לאחר הדגירה, מערבולת הצינורות טריטוראט עם פיפטה פסטר זכוכית במשך דקה אחת. לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, פיפטה הסופר-טבעית המכילה את האוסף הראשון של תאים מנותקים לצינורות מיקרוצנטריפוגה חדשים מצופים FBS של 1.5 מיליליטר. סובבו את הסופר-נט במשך חמש דקות ב-370 פעמים G ו-4 מעלות צלזיוס כדי לגלגל את התאים.הסר את supernatant וכתוצאה מכך, ולאחר מכן resuspend גלולה התא במאגר FACS ולשמור אותו על קרח. כדי לנתק את חתיכות הרקמה הנותרות בצינורות המיקרו-צנטריפוגה המקוריים של שני מיליליטר, הוסיפו 0.25% טריפסין-EDTA 10 דקות ודגרו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות עם מערבולת קצרה כל 10 דקות. לאחר מכן, טריטוריאט את חתיכות הרקמה עם פיפטת פסטר מזכוכית למשך דקה אחת.לאחר שחתיכות הרקמה מתיישבות, pipette את supernatant לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 מיליליטר המכיל את התאים מנותקים שנאספו בעבר במאגר FACS. סובב את הצינורות עם התאים המנותנים. לאחר הסרת supernatant, resuspend כדורי התא במאגר FACS ולשמור אותם על קרח.לאחר מכן, לבודד את התאים החיוביים Lgr5-GFP באמצעות FACS באמצעות ערוץ חלבון פלואורסצנטי ירוק כמתואר בכתב היד טקסט. העבר את המספר הרצוי של Lgr5 חיובי מושעה לתוך צינור microcentrifuge חדש. לסובב את הצינור במשך חמש דקות ב 370 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס כדי כדורי התאים.הסר את supernatant ומניחים את הצינור על קרח. יש להצמיד בעדינות את גלולה התא בכמות המתאימה של ג'ל מטריצה עם צנרת עדינה. ואז לשמור את צינור microcentrifuge על קרח בצינור חרוט 50 מיליליטר כדי למנוע את ג'ל מטריצה מג'ל.מוסיפים 15 מיקרוליטרים של ג'ל המטריצה בתערובת התאים במרכז כל באר של צלחת 48-well. כדי להבטיח חלוקה אחידה של תאים, מערבבים את ג'ל המטריצה ותערובת התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה לאחר ציפוי כל שלוש בארות. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו 95% לחות במשך 10 דקות כדי לאפשר gelling של ג'ל מטריצה.לאחר מכן, להוסיף 300 microliters של טמפרטורת החדר WENRAS מדיה בתוספת מעכב הסלע, Y27632, לכל באר ולהחזיר את הצלחת לאינקובטור. יומיים לאחר ה ציפוי, להסיר את המדיה מכל באר באמצעות pipette אחד מיליליטר או באמצעות שאיפה ואקום, להבטיח לא זיהום צולב בין התנאים. הוסף 300 מיקרוליטרים של מדיה WENRAS בצד של הבאר, דואג לא לשבש את ג'ל מטריצה ולהחזיר את הצלחת לחממה.כאשר אורגנוידים לשוניים מתורבתים באמצעות מדיה WENR, הם אינם גדלים ביעילות. עם זאת, לאחר הוספת A 83-01, מעכב איתות TGF-בטא, ו SB202190, מעכב איתות מפת P-38, צמיחה חזקה נצפתה. מעניין, הסרת מעכבים אלה מהתקשורת לאחר שישה ימים גורמת לביטוי גבוה יותר של סמן תא קולטן טעם כללי, Kcnq1, מה שמרמז כי A 83-01 ו- SB-202190 לעכב את בידול תאי הטעם.לכן, צמיחה אופטימלית ובידול מתקבלים על ידי organoids culturing במדיה WENRAS מהיום אפס עד שש ומדיה WENR מהיום השישי עד 12. אורגנוידים בוגרים מכילים הן תאי טעם המסומנים על ידי קרטין-8 ותאי אפיתל שאינם בעלי טעם המסומנים על ידי קרטין-13. יתר על כן, קרטין-13 מתבטא ברמות גבוהות יותר מכל שלושת סמני תא קולטן הטעם, דבר המצביע על כך שאורגנואידים מורכבים בעיקר מתאי אפיתל שאינם בעלי טעם.האורגנוידים מבטאים את כל סוגי תאי קולטן הטעם. סוג אחד תאים המסומנים על ידי Entpd2 וסוג מר שני תאים המסומנים על ידי Gnat3 באים לידי ביטוי מאוד באורגנוידים של טעם, בעוד חישה חמוצה סוג שלושה תאים המסומנים על ידי Car4 הם פחות נפוצים. תאי קולטן הטעם מופצים באופן אקראי באורגנוידים ולא במבני בלוטות טעם נפרדים שנצפו ב- vivo.הקפד לכלול כמה רקמה אחורית ל- CVP בעת ניתוח הלשון מחלל הפה. בנוסף, ודא את שתי החפירות לקפוץ החוצה מתקבלים בעת קילוף האפיתל.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

בידוד והתרבות של דג זברה למבוגרי מוח נגזר Neurospheres

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

ייצור בקנה מידה גדולה של cardiomyocytes מתאי גזע פלוריפוטנטיים אדם באמצעות פרוטוקול בידול מולקולה קטן המבוססת לשחזור ביותר

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

דור של Organoids מוחי סטנדרטית ו לשחזור הקדמי-סוג של האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

הבידוד והתרבות של תאי Epicardial הראשית נגזר מן הלב האנושי למבוגרים ו עוברית דגימות

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

דור של תא צורב עור תלת-ממד של כבל דם-derived המושרה בתאי גזע Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

בדור חוץ גופית של Somite נגזרים מן האדם המושרה בתאי גזע Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

דור של Organoids של צינורות המרה Extrahepatic העכבר

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

ספירה מדויקת של זקיקים בשחלות עכברים למבוגרים

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

ייצור אורגנוידים של ריאות שלמות תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למידול ביולוגיה התפתחותית של ריאות ומחלות

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...