Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

लेखक WNR वातानुकूलित मीडिया और मूल्यवान चर्चा प्रदान करने के लिए डॉ पीटर डेम्पसे और मोनिका ब्राउन (कोलोराडो Anschutz मेडिकल कैंपस ऑर्गेनॉइड और ऊतक मॉडलिंग साझा संसाधन) के विश्वविद्यालय का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं । हम सेल छंटाई विशेषज्ञता के लिए यूनिवर्सिटी ऑफ कोलोराडो कैंसर सेंटर सेल टेक्नोलॉजीज और फ्लो साइटोमेट्री साझा संसाधनों, विशेष रूप से दिमित्री बैटुरिन को भी धन्यवाद देते हैं। इस काम के द्वारा वित्त पोषित किया गया था: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, और NIH/NCI R21 CA21 CA236480 लैब के लिए, और R21DC016131 और R21DC016131-02S1 डीजी के लिए, और F32 DC015958 EJG के लिए ।

सभी पशु प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं, पशु कल्याण अधिनियम, और सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति के उपयोग के लिए गाइड के अनुपालन में एक AAALAC-मान्यता प्राप्त सुविधा में प्रदर्शन किया गया, और संस्थ...

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	<li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+renewal+in+gustation:+new+insights+into+taste+bud+development.">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li><li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+taste.">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li><li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).</li><li>Barlow, L. A., Klein, O. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+taste+organs+is+strictly+dependent+on+epithelial+hedgehog/gli+signaling.">Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling.</a> PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).</li><li>Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionated+head+and+neck+irradiation+impacts+taste+progenitors,+differentiated+taste+cells,+and+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+adult+mice.">Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/&#946;-catenin signaling in adult mice.</a> Scientific Reports. 9, 17934 (2019).</li><li>Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommended+guidelines+for+developing,+qualifying,+and+implementing+complex+in+vitro+models+(CIVMs)+for+drug+discovery.">Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 25 (10), 1174-1190 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance.">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).</li><li>Vintschgau, M. v., H&#246;nigschmied, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervus+glossopharyngeus+und+schmeckbecher.">Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher.</a> Archiv f&#252;r die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).</li><li>Liu, H. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+organoids:+engineering+the+vasculature.">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li></ol>

यहां रिपोर्ट वयस्क माउस स्वाद स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड को बनाने, बनाए रखने और प्रसंस्करण के लिए एक कुशल और आसानी से दोहराने योग्य विधि है। यह पाया गया कि 8 से 20 सप्ताह पुराने Lgr5-EGFP चूहों स...

कृंतकों में, भाषाई स्वाद कलियों को फंगसफॉर्म पैपिली में रखा जाता है जो पूर्वकाल में वितरित होता है, द्विपक्षीय पत्ते papillae पीछे, साथ ही जीभ1के पोस्टरोडर्सल मिडलाइन पर एक एकल परिधीय पैपिला (सीवीपी) । प्रत्येक स्वाद कली 50-100 अल्पकालिक, तेजी से नवीनीकरण स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं (टीआरसी) से बना है, जिसमें टाइप आई ग्लियल जैसी समर्थन कोशिकाएं, प्रकार II कोशिकाएं शामिल हैं जो मीठे, कड़वे और उमामी का पता लगाती हैं, और टाइप III कोशिकाएं जो खट्टे2,3,4का पता लगाती हैं। माउस सीवीपी में, बेसल लैमिना के साथ एलजीआर 5+ स्टेम सेल सभी टीआरसी प्रकारों के साथ-साथ गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं5। स्वाद वंश का नवीनीकरण करते समय, एलजीआर 5 बेटी कोशिकाओं को पहले पोस्ट-मिटोटिक स्वाद अग्रदूत कोशिकाओं (टाइप IV कोशिकाओं) के रूप में निर्दिष्ट किया जाता है जो स्वाद की कली में प्रवेश करते हैं और तीन टीआरसी प्रकार6में से किसी में अंतर करने में सक्षम हैं। टीआरसी का तेजी से कारोबार चिकित्सा उपचारों द्वारा व्यवधान के लिए अतिसंवेदनशील स्वाद प्रणाली को प्रस्तुत करता है, जिसमें विकिरण और कुछदवा उपचार7,8,9,10, 11,12,13शामिल हैं। इस प्रकार, स्वाद स्टेम सेल विनियमन और टीआरसी भेदभाव के संदर्भ में स्वाद प्रणाली का अध्ययन यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्वाद की शिथिलता को कम या कैसे रोका जाए।
चूहे स्वाद विज्ञान में वीवो अध्ययन के लिए एक पारंपरिक मॉडल हैं क्योंकि उनके पास मनुष्यों के समान ही स्वाद प्रणाली है14,15,16. हालांकि, चूहों उच्च थ्रूपुट अध्ययनों के लिए आदर्श नहीं हैं, क्योंकि वे काम करने के लिए बनाए रखने और समय लेने वाले महंगे हैं। इसे दूर करने के लिए, हाल के वर्षों में इन विट्रो ऑर्गेनॉइड संस्कृति विधियों का विकास किया गया है। स्वाद ऑर्गेनॉइड देशी सीवीपी ऊतक से उत्पन्न किया जा सकता है, एक प्रक्रिया जिसमें ऑर्गेनॉइड अलग माउस सीवीपी एपिथेलियम सुसंस्कृत पूर्व वीवो17से बंद हो जाते हैं। ये ऑर्गेनॉइड वीवो स्वाद प्रणाली के अनुरूप एक बहुस्तरीय एपिथेलियम प्रदर्शित करते हैं। ऑर्गेनॉइड उत्पन्न करने का एक अधिक कुशल तरीका जिसे पूर्व वीवो सीवीपी संस्कृति की आवश्यकता नहीं होती है , रेन एटअल द्वारा 201418में विकसित किया गया था। अनुकूल तरीकों और संस्कृति मीडिया पहले आंतों के ऑर्गेनॉइड विकसित करने के लिए विकसित, वे माउस सीवीपी से एकल Lgr5-GFP+ जनक कोशिकाओं को अलग और उन्हें मैट्रिक्स जेल19में चढ़ाया । इन एकल कोशिकाओं ने भाषाई ऑर्गेनॉइड उत्पन्न किए जो संस्कृति के पहले 6 दिनों के दौरान पैदा होते हैं, 8 दिन के आसपास अंतर करना शुरू कर देते हैं, और संस्कृति अवधि के अंत तक गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाएं और सभी तीन टीआरसी प्रकार18,20होते हैं। आज तक, भाषाई ऑर्गेनॉइड मॉडल प्रणाली का उपयोग करने वाले कई अध्ययन17,18,20,21, 22प्रकाशित किए गए हैं। हालांकि, इन ऑर्गेनॉइड को उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाले तरीके और संस्कृति की स्थिति प्रकाशनों(अनुपूरक तालिका 1)में भिन्न होती है। इस प्रकार, इन तरीकों को वयस्क माउस सीवीपी के एलजीआर 5+ जनक से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड की संस्कृति के लिए एक विस्तृत मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए यहां समायोजित और अनुकूलित किया गया है।
भाषाई ऑर्गेनॉइड स्वाद सेल विकास और नवीकरण ड्राइविंग सेल जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक अनूठा मॉडल प्रदान करते हैं। चूंकि भाषाई ऑर्गेनॉइड के अनुप्रयोगों का विस्तार होता है और अधिक प्रयोगशालाएं इन विट्रो ऑर्गेनॉइड मॉडल का उपयोग करने की ओर बढ़ती हैं, इसलिए यह महत्वपूर्ण है कि क्षेत्र प्रजनन क्षमता में सुधार के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल विकसित करने और अपनाने का प्रयास करे। स्वाद विज्ञान के भीतर एक मानक उपकरण के रूप में भाषाई ऑर्गेनॉइड की स्थापना उच्च थ्रूपुट अध्ययनों को सक्षम करेगी जो अलग-अलग चिढ़ाती है कि एकल स्टेम कोशिकाएं वयस्क स्वाद प्रणाली की विभेदित कोशिकाओं को कैसे उत्पन्न करती हैं। इसके अतिरिक्त, भाषाई ऑर्गेनॉइड को स्वाद होमोस्टेसिस पर संभावित प्रभावों के लिए तेजी से स्क्रीन दवाओं के लिए नियोजित किया जा सकता है, जिसकी जांच पशु मॉडलों में अधिक अच्छी तरह से की जा सकती है। यह दृष्टिकोण अंततः उन उपचारों को ईजाद करने के प्रयासों में वृद्धि करेगा जो भविष्य के दवा प्राप्तकर्ताओं के लिए जीवन की गुणवत्ता में सुधार करते हैं ।

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	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

स्वाद की भावना जीभ पर स्वाद कलियों द्वारा मध्यस्थता की जाती है, जो तेजी से नवीनीकरण स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं (टीआरसी) से बना होते हैं। यह नित्य कारोबार स्थानीय जनक कोशिकाओं द्वारा संचालित होता है और चिकित्सा उपचारों की एक भीड़ द्वारा व्यवधान से ग्रस्त स्वाद कार्य प्रदान करता है, जो बदले में जीवन की गुणवत्ता को गंभीर रूप से प्रभावित करता है। इस प्रकार, दवा उपचार के संदर्भ में इस प्रक्रिया का अध्ययन यह समझने के लिए महत्वपूर्ण है कि स्वाद जनक समारोह और टीआरसी उत्पादन कैसे प्रभावित होते हैं। नैतिक चिंताओं और मानव स्वाद ऊतक की सीमित उपलब्धता को देखते हुए, माउस मॉडल, जो मनुष्यों के समान एक स्वाद प्रणाली है, आमतौर पर उपयोग किया जाता है । वीवो विधियों की तुलना में, जो समय लेने वाले, महंगे हैं, और उच्च थ्रूपुट अध्ययनों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं, मुरीन भाषाई ऑर्गेनॉइड कई प्रतिकृति और कम चूहों के साथ तेजी से चलाने के लिए प्रयोगों को सक्षम कर सकते हैं। यहां, पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया गया है और वयस्क चूहों के परिष्कार पैपिला (सीवीपी) से अलग स्वाद जनक कोशिकाओं से स्वाद ऑर्गेनॉइड पैदा करने के लिए एक मानकीकृत विधि प्रस्तुत की गई है। सीवीपी एक्सप्रेस एलजीआर 5 में प्रोजेनिटर कोशिकाओं का स्वाद लें और एलजीआर 5ईजीएफपी-आईईईएस-क्रेर्ट2 एलील ले जाने वाले चूहों से ईजीएफपी फ्लोरेसेंस-एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग (FACS) के माध्यम से अलग किया जा सकता है। सॉर्ट कोशिकाओं को मैट्रिक्स जेल-आधारित 3 डी संस्कृति प्रणाली पर चढ़ाया जाता है और 12 दिनों के लिए सुसंस्कृत किया जाता है। ऑर्गेनॉइड प्रसार के माध्यम से संस्कृति अवधि के पहले 6 दिनों के लिए विस्तार करते हैं और फिर एक भेदभाव चरण में प्रवेश करते हैं, जिसके दौरान वे गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं के साथ सभी तीन स्वाद सेल प्रकार उत्पन्न करते हैं। ऑर्गेनॉइड को आरएनए अभिव्यक्ति और इम्यूनोहिस्टोकेमिकल विश्लेषण के लिए विकास प्रक्रिया के दौरान 12 दिन या किसी भी समय परिपक्वता पर काटा जा सकता है। वयस्क स्टेम कोशिकाओं से भाषाई ऑर्गेनॉइड के उत्पादन के लिए संस्कृति विधियों का मानकीकरण प्रजनन क्षमता में सुधार करेगा और स्वाद की शिथिलता का सामना करने वाले रोगियों की मदद करने के लिए लड़ाई में एक शक्तिशाली दवा स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में भाषाई ऑर्गेनॉइड को आगे बढ़ाएगा।

चूहों में एक सीवीपी होता है, जो जीभ पर पीछे स्थित होता है, जिसमें से एलजीआर 5+ स्टेम कोशिकाओं को अलग किया जासकता है (चित्रा 1A,ब्लैक बॉक्स)। सीवीपी(चित्रा 1 B)के तहत और उसके आस?...

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Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

प्रोटोकॉल वयस्क चूहों के पीछे के स्वाद पपीला से अलग स्वाद स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड को बनाने और प्रसंस्करण के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है।

वयस्क माउस स्वाद स्टेम सेल से प्राप्त भाषाई ऑर्गेनॉइड की पीढ़ी और संस्कृति

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

ऑर्गेनॉइड दवा स्क्रीनिंग और जैविक प्रक्रियाओं को समझने के लिए उपयोग की जाने वाले इन विट्रो तकनीक शक्तिशाली हैं। इसलिए, स्वाद कोशिका विकास और उत्थान का अध्ययन करने के लिए जीभ को मॉडल करने वाले ऑर्गेनॉइड पैदा करना महत्वपूर्ण है। वीवो स्वाद अध्ययन में पारंपरिक महंगा और समय लेने वाला हो सकता है।यह ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल एक मानकीकृत, प्रजनन योग्य विकल्प प्रदान करता है जो उच्च थ्रूपुट प्रयोगों की अनुमति देते हुए उन चुनौतियों को कम करता है। वयस्क माउस को इच्छामृत्यु के बाद, गालों को काटने और जबड़े को तोड़ने के लिए बड़े बाँझ विच्छेदन कैंची का उपयोग करें। इसके बाद जीभ को उठाएं और जीभ को मौखिक गुहा के फर्श से अलग करने के लिए भाषाई फ्रेनलम काट लें।जीभ को काटकर कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ बाँझ बर्फ से ठंडे डीपीबीएस में इकट्ठा करें। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, एक रेजर ब्लेड के साथ अंतर मलार श्रेष्ठता के बस पूर्वकाल को काटकर पूर्वकाल जीभ को हटा दें और त्यागें। फिर पीछे की जीभ से किसी भी बाल और अतिरिक्त तरल को हटाने के लिए एक नाजुक कार्य पोंछ का उपयोग करना।इसके बाद, इंजेक्शन एंजाइम समाधान के 200 से 300 माइक्रोलीटर के साथ एक मिलीलीटर सिरिंज भरें और एक 30 गेज आधा इंच सुई को इंटर मलार श्रेष्ठता के ठीक ऊपर डालें, जब तक कि परिष्कार पैपिली, या सीवीपी के पूर्वकाल तक। एपिथेलियम और अंतर्निहित ऊतकों के बीच सीवीपी के पार्श्व किनारों के नीचे और पार्श्व किनारों पर एंजाइम समाधान इंजेक्ट करें। सिरिंज को धीरे-धीरे और लगातार जीभ से हटा दें क्योंकि समाधान इंजेक्ट किया जा रहा है।ठीक 33 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जीभ और बाँझ कैल्शियम मैग्नीशियम मुक्त dPBS इनक्यूबेट। अतिरिक्त ठीक विच्छेदन कैंची का उपयोग करना, एपीथिलियम में द्विपक्षीय और सीवीपी के सिर्फ पूर्वकाल में छोटे कटौती करें। फिर धीरे-धीरे एपिथेलियम को बारीक संदंश से उठाकर छील लें।एक बार जब ट्रेंच एपिथेलियम अंतर्निहित कनेक्टिव ऊतक से मुक्त हो जाता है, तो इसे दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में रखें, जो एफबीएस के साथ पूर्व-लेपित है। खुली सीवीपी एपिथेलिया युक्त ट्यूबों में वियोजन एंजाइम कॉकटेल जोड़ें और उन्हें हर 15 मिनट में संक्षिप्त भंवर के साथ 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के अंतिम 15 मिनट के दौरान, पानी के स्नान में 0.25% ट्रिप्पसिन-ईडीटीए प्रीवार्म करें।इनक्यूबेशन बाद, एक मिनट के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ ट्राइट्यूरेट में ट्यूबों को भंवर करें। ऊतक के टुकड़ों के बसने के बाद, नए एफबीएस लेपित 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में अलग कोशिकाओं के पहले संग्रह वाले सुपरनेट को पिपेट करें। कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 370 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए सुपरनेट स्पिन करें।परिणामी सुपरनेट निकालें, फिर कोशिका गोली को FACS बफर में फिर से खर्च करें और इसे बर्फ पर रखें। मूल दो मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में शेष ऊतक टुकड़ों को अलग करने के लिए, पूर्व-गर्म 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए जोड़ें और हर 10 मिनट में संक्षिप्त भंवर के साथ 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, ऊतक के टुकड़ों को एक मिनट के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट के साथ ट्राय करें।ऊतक के टुकड़ों के बसने के बाद, सुपरनेट को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में पिपेट करें जिसमें पहले से एकत्र किए गए वियोजन कोशिकाओं को FACS बफर में शामिल किया गया है। ट्यूबों को अलग कोशिकाओं के साथ स्पिन करें। सुपरनिट को हटाने के बाद, कोशिका छर्रों को FACS बफर में फिर से रखें और उन्हें बर्फ पर रखें।फिर, पाठ पांडुलिपि में वर्णित हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन चैनल का उपयोग करके FACS के माध्यम से Lgr5-GFP सकारात्मक कोशिकाओं को अलग करें। Lgr5 सकारात्मक निलंबित कोशिकाओं की वांछित संख्या को एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। कोशिकाओं को गोली मारने के लिए 370 बार जी और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ट्यूब स्पिन करें।सुपरनेट निकालें और ट्यूब को बर्फ पर रखें। कोमल पिपटिंग के साथ मैट्रिक्स जेल की उचित मात्रा में सेल पेलेट को धीरे-धीरे फिर से खर्च करें। इसके बाद मैट्रिक्स जेल को जेलिंग से रोकने के लिए 50 मिलीलीटर शंकु नली में बर्फ पर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब रखें।48-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं के केंद्र में सेल मिश्रण में मैट्रिक्स जेल के 15 माइक्रोलीटर जोड़ें। कोशिकाओं का एक भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए, हर तीन कुओं चढ़ाना के बाद ऊपर और नीचे पाइपिंग द्वारा मैट्रिक्स जेल और सेल मिश्रण मिश्रण । मैट्रिक्स जेल के जेलिंग की अनुमति देने के लिए 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% कार्बन डाइऑक्साइड और 95% आर्द्रता पर एक इनक्यूबेटर में प्लेट रखें।फिर, कमरे के तापमान WENRAS मीडिया के 300 माइक्रोलीटर जोड़ें रॉक अवरोधक, Y27632 के साथ पूरक, प्रत्येक अच्छी तरह से और इनक्यूबेटर के लिए थाली वापस। चढ़ाना के दो दिन बाद, एक मिलीलीटर पिपेट का उपयोग करके या वैक्यूम आकांक्षा के माध्यम से प्रत्येक अच्छी तरह से मीडिया को हटा दें, शर्तों के बीच कोई क्रॉस-संदूषण सुनिश्चित न करें। वेन्रास मीडिया के 300 माइक्रोलीटर को कुएं के किनारे से जोड़ें, इस बात का ध्यान रखें कि मैट्रिक्स जेल को बाधित न करें और प्लेट को इनक्यूबेटर में वापस करें।जब भाषाई ऑर्गेनॉइड WENR मीडिया का उपयोग करके सुसंस्कृत होते हैं, तो वे कुशलता से विकसित नहीं होते हैं। हालांकि, एक 83-01, एक TGF-बीटा सिग्नलिंग अवरोधक, और SB202190, पी-३८ नक्शा kinase संकेत अवरोधक जोड़ने के बाद, मजबूत विकास देखा जाता है । दिलचस्प बात यह है कि छह दिनों के बाद मीडिया से इन अवरोधकों को हटाने के परिणामस्वरूप सामान्य स्वाद रिसेप्टर सेल मार्कर, Kcnq1 की उच्च अभिव्यक्ति होती है, यह सुझाव देते हुए कि एक 83-01 और एसबी-202190 स्वाद सेल भेदभाव में बाधा डालते हैं।इस प्रकार, इष्टतम विकास और भेदभाव वेनरास मीडिया में ऑर्गेनॉइड को दिन शून्य से छह और वेनआर मीडिया में छह से 12 दिन तक प्राप्त किया जाता है। परिपक्व ऑर्गेनॉइड में केराटिन-8 द्वारा चिह्नित दोनों स्वाद कोशिकाएं होती हैं और केराटिन-13 द्वारा चिह्नित गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाएं होती हैं। इसके अलावा, केराटिन-13 को तीनों स्वाद रिसेप्टर सेल मार्कर की तुलना में उच्च स्तर पर व्यक्त किया जाता है, जिसमें यह सुझाव दिया जाता है कि ऑर्गेनॉइड मुख्य रूप से गैर-स्वाद एपिथेलियल कोशिकाओं से बना होते हैं।ऑर्गेनॉइड सभी स्वाद रिसेप्टर सेल प्रकारों को व्यक्त करते हैं। टाइप एक कोशिकाओं Entpd2 द्वारा चिह्नित और कड़वा प्रकार Gnat3 द्वारा चिह्नित दो कोशिकाओं अत्यधिक स्वाद ऑर्गेनॉइड में व्यक्त कर रहे हैं, जबकि खट्टा संवेदन प्रकार तीन Car4 द्वारा चिह्नित कोशिकाओं को कम आम हैं । स्वाद रिसेप्टर कोशिकाओं को वीवो में मनाए जाने वाले असतत स्वाद कली संरचनाओं के बजाय ऑर्गेनॉइड में बेतरतीब ढंग से वितरित किया जाता है।मौखिक गुहा से जीभ विच्छेदन करते समय सीवीपी के पीछे कुछ ऊतकों को शामिल करना सुनिश्चित करें। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि दोनों खाइयां बाहर निकलते हैं और एपिथेलियम छीलते समय प्राप्त किए जाते हैं।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

अलगाव और वयस्क Zebrafish मस्तिष्क व्युत्पन्न Neurospheres की संस्कृति

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

मानव स्टेम कोशिकाओं से cardiomyocytes के बड़े पैमाने पर उत्पादन के लिए एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत छोटे अणु आधारित भेदभाव प्रोटोकॉल का उपयोग

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम कोशिकाओं से मानकीकृत और प्रतिलिपि Forebrain-प्रकार सेरेब्रल Organoids की पीढ़ी

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

मानव वयस्क और भ्रूण दिल नमूनों से व्युत्पंन प्राथमिक Epicardial कोशिकाओं के अलगाव और संस्कृति

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

गर्भनाल रक्त से 3 डी त्वचा Organoid का उत्पादन-व्युत्पन्न प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल से Somite डेरिवेटिव के विट्रो पीढ़ी में

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

माउस बहिर्यकृत पित्त नलिकाओं से ऑर्गेनॉइड का उत्पादन

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

प्रारंभिक माउस भ्रूण से अनुक्रमण के लिए छोटे आरएनए पुस्तकालयों की तैयारी

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

वयस्क माउस अंडाशय में सटीक कूप गणना

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

मॉडलिंग फेफड़े के विकास जीव विज्ञान और रोग के लिए प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल से 3 डी पूरे फेफड़ों Organoids की पीढ़ी

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...