Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Peter Dempsey e Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) per aver fornito media condizionati WNR e preziose discussioni. Ringraziamo anche l'Università del Colorado Cancer Center Cell Technologies and Flow Cytometry Shared Resources, in particolare Dmitry Baturin, per l'esperienza nello smistamento cellulare. Questo lavoro è stato finanziato da: NIH /NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, e NIH/NCI R21 CA236480 a LAB, e R21DC016131 e R21DC016131-02S1 a DG, e F32 DC015958 a EJG.

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in una struttura accreditata AAALAC in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, la legge sul benessere degli animali e la politica del servizio sanitario pubblico e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) presso l'Università del Colorado Anschutz Medical Campus. I topi Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 utilizzati in questo protocollo provengono da The Jackson Laboratory, Stock No. 00887...

<ol>
	<li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+renewal+in+gustation:+new+insights+into+taste+bud+development.">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li><li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+taste.">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li><li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).</li><li>Barlow, L. A., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+and+regenerating+a+sense+of+taste.">Developing and regenerating a sense of taste.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).</li><li>Yee, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5-EGFP+marks+taste+bud+stem/progenitor+cells+in+posterior+tongue.">Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue.</a> Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).</li><li>Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog-expressing+basal+cells+are+general+post-mitotic+precursors+of+functional+taste+receptor+cells.">Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).</li><li>Deshpande, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-related+alterations+of+taste+function+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+systematic+review.">Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review.</a> Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).</li><li>Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemosensory+changes+from+cancer+treatment+and+their+effects+on+patients'+food+behavior:+A+scoping+review.">Chemosensory changes from cancer treatment and their effects on patients' food behavior: A scoping review.</a> Nutrients. 11 (10), 2285 (2019).</li><li>Doty, R. L., Shah, M., Bromley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-induced+taste+disorders.">Drug-induced taste disorders.</a> Drug Safety. 31 (3), 199-215 (2008).</li><li>Kumari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+taste+organs+and+sensory+function+after+severe+loss+from+Hedgehog/Smoothened+inhibition+with+cancer+drug+sonidegib.">Recovery of taste organs and sensory function after severe loss from Hedgehog/Smoothened inhibition with cancer drug sonidegib.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (48), 10369-10378 (2017).</li><li>Ermilov, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+taste+organs+is+strictly+dependent+on+epithelial+hedgehog/gli+signaling.">Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling.</a> PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).</li><li>Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionated+head+and+neck+irradiation+impacts+taste+progenitors,+differentiated+taste+cells,+and+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+adult+mice.">Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/&#946;-catenin signaling in adult mice.</a> Scientific Reports. 9, 17934 (2019).</li><li>Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation.">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li><li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+taste:+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals.">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li><li>Chaudhari, N., Roper, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cell+biology+of+taste.">The cell biology of taste.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 285-296 (2010).</li><li>Breslin, P. A., Spector, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+taste+perception.">Mammalian taste perception.</a> Current Biology: CB. 18 (4), 148-155 (2008).</li><li>Aihara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+stem/progenitor+cell+cycle+using+murine+circumvallate+papilla+taste+bud+organoid.">Characterization of stem/progenitor cell cycle using murine circumvallate papilla taste bud organoid.</a> Scientific Reports. 5, 17185 (2015).</li><li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lgr5-+or+Lgr6-expressing+taste+stem/progenitor+cells+generate+taste+bud+cells+ex+vivo.">Single Lgr5- or Lgr6-expressing taste stem/progenitor cells generate taste bud cells ex vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (46), 16401-16406 (2014).</li><li>Sato, T., Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+mouse+small+intestinal+epithelial+cell+cultures.">Primary mouse small intestinal epithelial cell cultures.</a> Methods in Molecular Biology. 945, 319-328 (2013).</li><li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analyses+of+taste+organoids+reveal+multiple+pathways+involved+in+taste+cell+generation.">Transcriptome analyses of taste organoids reveal multiple pathways involved in taste cell generation.</a> Scientific Reports. 7, 4004 (2017).</li><li>Feng, S., Achoute, L., Margolskee, R. F., Jiang, P., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide-induced+inflammatory+cytokine+expression+in+taste+organoids.">Lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine expression in taste organoids.</a> Chemical Senses. 45 (3), 187-194 (2020).</li><li>Lin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=R-spondin+substitutes+for+neuronal+input+for+taste+cell+regeneration+in+adult+mice.">R-spondin substitutes for neuronal input for taste cell regeneration in adult mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 2001833118 (2021).</li><li>Miyoshi, H., Stappenbeck, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+and+genetic+modification+of+gastrointestinal+stem+cells+in+spheroid+culture.">In vitro expansion and genetic modification of gastrointestinal stem cells in spheroid culture.</a> Nature Protocols. 8 (12), 2471-2482 (2013).</li><li>Staats, J., Divekar, A., McCoy, J. P., Maecker, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunophenotyping: Methods and Protocols. , 81-104 (2019).</li><li>Perfetto, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples.">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li><li>Ekert, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommended+guidelines+for+developing,+qualifying,+and+implementing+complex+in+vitro+models+(CIVMs)+for+drug+discovery.">Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 25 (10), 1174-1190 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance.">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).</li><li>Vintschgau, M. v., H&#246;nigschmied, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervus+glossopharyngeus+und+schmeckbecher.">Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher.</a> Archiv f&#252;r die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).</li><li>Liu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Shh+signaling+centers+participate+in+fungiform+papilla+and+taste+bud+formation+and+maintenance.">Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance.</a> Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system.">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li><li>Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+organoids:+engineering+the+vasculature.">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li></ol>

Riportato qui è un metodo efficiente e facilmente ripetibile per la coltivazione, il mantenimento e l'elaborazione di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto di topo adulto. È stato scoperto che l'utilizzo di tre CVP da 8 a 20 settimane di topi Lgr5-EGFP è sufficiente per ottenere ~ 10.000 cellule GFP+ per uso sperimentale, con il risultato di 50 pozzetti placcati ad una densità di 200 cellule per pozzo in piastre a 48 pozzetti. La rimozione degli epiteli della trincea CVP è ot...

Nei roditori, le papille gustative linguali sono alloggiate in papille fungiformi distribuite anteriormente, papille fogliate bilaterali posteriormente, nonché una singola papilla circumvallata (CVP) sulla linea mediana posterodorsale della lingua1. Ogni papille gustatica è composta da 50-100 cellule recettrici del gusto (TRC) di breve durata e in rapido rinnovamento, che includono cellule di supporto gliali di tipo I, cellule di tipo II che rilevano dolci, amare e umami e cellule di tipo III che rilevano acido2,3,4. Nel topo CVP, le cellule staminali LGR5+ lungo la lamina basale producono tutti i tipi di TRC e le cellule epiteliali non gustative5. Quando si rinnova il lignaggio del gusto, le cellule figlie LGR5 vengono prima specificate come cellule precursori del gusto post-mitotico (cellule di tipo IV) che entrano in una papille gustatica e sono in grado di differenziarsi in uno qualsiasi dei tre tipi TRC6. Il rapido turnover dei TRC rende il sistema gustatico suscettibile di perturbazioni da parte di trattamenti medici, tra cui radiazioni e alcune terapie farmacologiche7,8,9,10,11,12,13. Pertanto, studiare il sistema del gusto nel contesto della regolazione delle cellule staminali del gusto e della differenziazione TRC è vitale per capire come mitigare o prevenire la disfunzione del gusto.
I topi sono un modello tradizionale per studi in vivo nella scienza del gusto poiché hanno un sistema del gusto organizzato in modo simile agli esseri umani14,15,16. Tuttavia, i topi non sono ideali per studi ad alto rendimento, in quanto sono costosi da mantenere e richiedono molto tempo per lavorare. Per ovviare a questo, negli ultimi anni sono stati sviluppati metodi di coltura organoide in vitro. Gli organoidi gustazionali possono essere generati dal tessuto CVP nativo, un processo in cui gli organoidi germogliano dall'epitelio CVP di topo isolato coltivato ex vivo17. Questi organoidi mostrano un epitelio multistrato coerente con il sistema di gusto in vivo. Un modo più efficiente per generare organoidi che non richiedono la coltura CVP ex vivo è stato sviluppato da Ren et al. nel 201418. Adattando metodi e mezzi di coltura sviluppati per la prima volta per far crescere organoidi intestinali, hanno isolato singole cellule progenitrici Lgr5-GFP+ da CVP di topo e le hanno placcate in gel di matrice19. Queste singole cellule hanno generato organoidi linguali che proliferano durante i primi 6 giorni di coltura, iniziano a differenziarsi intorno al giorno 8 e alla fine del periodo di coltura contengono cellule epiteliali non gustative e tutti e tre i tipi di TRC18,20. Ad oggi, sono stati pubblicati diversi studi che utilizzano il sistema di modelli organoidi linguali17,18,20,21,22; tuttavia, i metodi e le condizioni di coltura utilizzati per generare questi organoidi variano da una pubblicazione all'altra (Tabella supplementare 1). Pertanto, questi metodi sono stati adattati e ottimizzati qui per presentare un protocollo standardizzato dettagliato per la coltura di organoidi linguali derivati da LGR5+ progenitori di CVP di topo adulto.
Gli organoidi linguali forniscono un modello unico per lo studio dei processi biologici cellulari che guidano lo sviluppo e il rinnovamento delle cellule del gusto. Man mano che le applicazioni degli organoidi linguali si espandono e sempre più laboratori si spostano verso l'utilizzo di modelli organoidi in vitro, è importante che il campo si sforzi di sviluppare e adottare protocolli standardizzati per migliorare la riproducibilità. Stabilire gli organoidi linguali come strumento standard all'interno della scienza del gusto consentirebbe studi ad alto rendimento che separano il modo in cui le singole cellule staminali generano le cellule differenziate del sistema del gusto adulto. Inoltre, gli organoidi linguali potrebbero essere impiegati per esaminare rapidamente i farmaci per potenziali impatti sull'omeostasi del gusto, che potrebbero quindi essere studiati in modo più approfondito in modelli animali. Questo approccio alla fine migliorerà gli sforzi per ideare terapie che migliorino la qualità della vita per i futuri destinatari di farmaci.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

Il senso del gusto è mediato dalle papille gustative sulla lingua, che sono composte da cellule recettrici del gusto (TRC) che si rinnovano rapidamente. Questo continuo turnover è alimentato da cellule progenitrici locali e rende la funzione del gusto soggetta a interruzioni da parte di una moltitudine di trattamenti medici, che a loro volta hanno un grave impatto sulla qualità della vita. Pertanto, studiare questo processo nel contesto del trattamento farmacologico è vitale per capire se e come la funzione progenitrice del gusto e la produzione di TRC sono influenzate. Date le preoccupazioni etiche e la limitata disponibilità di tessuto gustatico umano, i modelli murini, che hanno un sistema di gusto simile agli esseri umani, sono comunemente usati. Rispetto ai metodi in vivo, che richiedono molto tempo, sono costosi e non suscettibili di studi ad alto rendimento, gli organoidi linguali murini possono consentire di eseguire rapidamente esperimenti con molte repliche e meno topi. Qui, i protocolli precedentemente pubblicati sono stati adattati e viene presentato un metodo standardizzato per generare organoidi del gusto da cellule progenitrici del gusto isolate dalla papilla circumvallata (CVP) di topi adulti. Le cellule progenitrici del gusto nel CVP esprimono LGR5 e possono essere isolate tramite lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza EGFP (FACS) da topi portatori di un allele Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. Le cellule ordinate vengono placcate su un sistema di coltura 3D a base di gel a matrice e coltivate per 12 giorni. Gli organoidi si espandono per i primi 6 giorni del periodo di coltura attraverso la proliferazione e poi entrano in una fase di differenziazione, durante la quale generano tutti e tre i tipi di cellule del gusto insieme alle cellule epiteliali non gustative. Gli organoidi possono essere raccolti al momento della maturazione al giorno 12 o in qualsiasi momento durante il processo di crescita per l'espressione dell'RNA e l'analisi immunoistochimica. Standardizzare i metodi di coltura per la produzione di organoidi linguali da cellule staminali adulte migliorerà la riproducibilità e farà progredire gli organoidi linguali come un potente strumento di screening farmacologico nella lotta per aiutare i pazienti che soffrono di disfunzione del gusto.

I topi hanno un CVP, situato posteriormente sulla lingua, da cui possono essere isolate le cellule staminali LGR5+ (Figura 1A, scatola nera). L'iniezione di una soluzione enzimatica sotto e intorno al CVP (Figura 1B) provoca un leggero gonfiore dell'epitelio e la digestione del tessuto connettivo. Una digestione sufficiente si ottiene dopo un'incubazione di 33 minuti, che consente una facile separazione dell'epitelio CVP dal tessuto s...

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

Il protocollo presenta un metodo per la coltivazione e l'elaborazione di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto isolate dalla papilla del gusto posteriore di topi adulti.

Generazione e coltura di organoidi linguali derivati da cellule staminali del gusto del topo adulto

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Gli organoidi sono una potente tecnologia in vitro utilizzata per lo screening dei farmaci e la comprensione dei processi biologici. Quindi, generare organoidi che modellano la lingua è fondamentale per studiare lo sviluppo e la rigenerazione delle cellule del gusto. I tradizionali studi sul gusto in vivo possono essere costosi e richiedere molto tempo.Questo protocollo organoide offre un'alternativa standardizzata e riproducibile che riduce al minimo tali sfide consentendo al contempo esperimenti di throughput più elevato. Dopo l'eutanasia di un topo adulto, utilizzare grandi forbici di dissezione sterili per tagliare le guance e rompere la mascella. Quindi, sollevare la lingua e tagliare il frenulo linguale per separare la lingua dal pavimento della cavità orale.Tagliare la lingua e raccoglierla in dPBS sterile ghiacciato con calcio e magnesio. Sotto un microscopio sezionante, rimuovere e scartare la lingua anteriore tagliando appena anteriore dell'eminenza inter malar con una lama di rasoio. Quindi utilizzando una delicata pulizia per rimuovere eventuali peli e liquidi in eccesso dalla lingua posteriore.Quindi, riempire una siringa da un millilitro con 200-300 microlitri di soluzione enzimatica per iniezione e inserire un ago da mezzo pollice da 30 gauge appena sopra l'eminenza inter malar fino a poco prima delle papille circumvallate o CVP. Iniettare la soluzione enzimatica sotto e ai bordi laterali del CVP tra l'epitelio e i tessuti sottostanti. Prelevare la siringa lentamente e continuamente dalla lingua mentre la soluzione viene iniettata.Incubare la lingua e il calcio sterile privo di magnesio dPBS a temperatura ambiente per esattamente 33 minuti. Usando forbici di dissezione extra-fini, fare piccoli tagli nell'epitelio bilateralmente e appena anteriormente al CVP. Quindi sbucciare delicatamente l'epitelio sollevandolo con una pinza fine.Una volta che l'epitelio della trincea è libero dal tessuto connettivo sottostante, posizionarlo in un tubo microcentrifuga da due millilitro, pre-rivestito con FBS. Aggiungere il cocktail dell'enzima di dissociazione ai tubi contenenti gli epiteli CVP sbucciati e incubarli a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 45 minuti con brevi vortici ogni 15 minuti. Durante gli ultimi 15 minuti di incubazione, pre-guerra 0,25% Tripsina-EDTA a bagnomaria.Dopo l'incubazione, vorticizzare i tubi in triturato con una pipetta pasteur di vetro per un minuto. Dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati, pipettare il surnatante contenente la prima raccolta di cellule dissociate in nuovi tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro rivestiti fbS. Ruotare il surnatante per cinque minuti a 370 volte G e quattro gradi Celsius per pellettare le cellule.Rimuovere il surnatante risultante, quindi risusediare il pellet cellulare nel tampone FACS e tenerlo sul ghiaccio. Per dissociare i restanti pezzi di tessuto nei tubi microcentrifuga originali da due millilitro, aggiungere lo 0,25% di tripsina-EDTA preriscaldato e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti con un breve vortice ogni 10 minuti. Quindi, triturare i pezzi di tessuto con una pipetta Pasteur di vetro per un minuto.Dopo che i pezzi di tessuto si sono depositati, pipettare il surnatante nei tubi microcentrifuga da 1,5 millilitro contenenti le cellule dissociate precedentemente raccolte nel tampone FACS. Ruotare i tubi con le cellule dissociate. Dopo aver rimosso il surnatante, risusedere i pellet cellulari nel tampone FACS e tenerli sul ghiaccio.Quindi, isolare le cellule positive Lgr5-GFP tramite FACS utilizzando il canale proteico fluorescente verde come descritto nel manoscritto di testo. Trasferire il numero desiderato di cellule sospese Lgr5 positive in un nuovo tubo microcentrifuga. Ruotare il tubo per cinque minuti a 370 volte G e quattro gradi Celsius per pellettare le celle.Rimuovere il surnatante e posizionare il tubo sul ghiaccio. Risuscisciare delicatamente il pellet cellulare nella quantità appropriata di gel della matrice con un delicato pipettaggio. Quindi mantenere il tubo microcentrifuga sul ghiaccio in un tubo conico da 50 millilitro per evitare che il gel della matrice si gelifichi.Aggiungere 15 microlitri del gel della matrice nella miscela cellulare al centro di ciascun pozzettino di una piastra a 48 pozzetti. Per garantire una distribuzione uniforme delle cellule, mescolare il gel della matrice e la miscela cellulare tubando su e giù dopo la placcatura ogni tre pozzi. Posizionare la piastra in un'incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 95% di umidità per 10 minuti per consentire la gelificazione del gel della matrice.Quindi, aggiungere 300 microlitri di media WENRAS a temperatura ambiente integrati con l'inibitore della roccia, Y27632, a ciascun pozzo e restituire la piastra all'incubatore. Due giorni dopo la placcatura, rimuovere il materiale da ciascun pozzo utilizzando una pipetta da un millilitro o tramite aspirazione sotto vuoto, assicurando che non ci sia contaminazione incrociata tra le condizioni. Aggiungere 300 microlitri di media WENRAS lungo il lato del pozzo, facendo attenzione a non interrompere il gel della matrice e restituire la piastra all'incubatore.Quando gli organoidi linguali vengono coltivati utilizzando mezzi WENR, non crescono in modo efficiente. Tuttavia, dopo aver aggiunto A 83-01, un inibitore della segnalazione TGF-beta, e SB202190, inibitore della segnalazione della chinasi della mappa P-38, si osserva una crescita robusta. È interessante notare che la rimozione di questi inibitori dai media dopo sei giorni si traduce in una maggiore espressione del marcatore cellulare del recettore del gusto generale, Kcnq1, suggerendo che A 83-01 e SB-202190 ostacolano la differenziazione delle cellule del gusto.Pertanto, la crescita e la differenziazione ottimali si ottengono coltivando organoidi nei media WENRAS dal giorno zero al sesto e nei media WENR dal sesto al 12° giorno. Gli organoidi maturi contengono sia cellule gustative marcate da cheratina-8 che cellule epiteliali non gustative marcate da cheratina-13. Inoltre, la cheratina-13 è espressa a livelli più elevati rispetto a tutti e tre i marcatori cellulari del recettore del gusto, suggerendo che gli organoidi sono prevalentemente composti da cellule epiteliali non gustative.Gli organoidi esprimono tutti i tipi di cellule del recettore del gusto. Le cellule di tipo uno contrassegnate da Entpd2 e le cellule di tipo amaro due contrassegnate da Gnat3 sono altamente espresse in organoidi di gusto, mentre le cellule di tipo acido tre contrassegnate da Car4 sono meno comuni. Le cellule del recettore del gusto sono distribuite in modo casuale negli organoidi piuttosto che in discrete strutture di papille gustative osservate in vivo.Assicurati di includere un po 'di tessuto posteriore al CVP quando seziona la lingua dalla cavità orale. Inoltre, assicurarsi che entrambe le trincee sbuccino e si ottengono quando si sbuccia l'epitelio.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolamento e la coltura di Neurosfere Zebrafish adulti Brain-derived

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Produzione su larga scala dei cardiomiociti da cellule staminali umane pluripotenti usando un altamente riproducibile piccole molecole-Based Differenziazione protocollo

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di standardizzato e riproducibile del Forebrain-tipo Organoids cerebrale da umani cellule staminali pluripotenti indotte

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

L'isolamento e coltura di cellule primarie dell'epicardio ricavate da campioni di cuore umano adulto e fetale

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione di pelle 3D Organoid dal cordone emoderivati indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generazione in Vitro di Somite derivati da umani indotta da cellule staminali pluripotenti indotte

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generazione dei Organoids da dotti biliari Extrahepatic Mouse

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Enumerazione accurata del follicolo nelle ovaie di topo adulto

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generazione di organoidi polmonari interi 3D da cellule staminali pluripotenti indotte per la modellazione della biologia e della malattia dello sviluppo polmonare

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...