Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
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著者らは、WNR条件付きメディアと貴重な議論を提供してくれたピーター・デンプシー博士とモニカ・ブラウン(コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスオルガノイドと組織モデリング共有リソース)に感謝したいと考えています。また、コロラド大学がんセンターの細胞技術とフローサイトメトリー共有リソース、特にドミトリー・バトゥリンの細胞選別の専門知識に感謝します。この作品は、次の資金を提供しました: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1、DC012383-S2、NIH/NCI R21 CA236480からLABへ、R21DC016131およびR21DC016131-02S1からDG、およびF32 DC015958からEJGへ。

すべての動物の手順は、実験動物のケアと使用ガイド、動物福祉法、公衆衛生サービスポリシーに従ってAAALAC認定施設で行われ、コロラド大学アンシュッツ医療キャンパスの施設動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。このプロトコルで使用されるLgr5EGFP-IRES-CreERT2 マウスは、ジャクソン研究所、ストック第008875からである。
注:プロトコルのスムー...

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation.">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li><li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+taste:+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals.">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li><li>Chaudhari, N., Roper, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples.">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance.">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).</li><li>Vintschgau, M. v., H&#246;nigschmied, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervus+glossopharyngeus+und+schmeckbecher.">Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher.</a> Archiv f&#252;r die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).</li><li>Liu, H. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+organoids:+engineering+the+vasculature.">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li></ol>

ここで報告されているのは、成人マウス味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養、維持、処理するための効率的かつ容易に再現可能な方法である。8〜20週齢のLgr5-EGFPマウスの3つのCvPsを使用すると、実験用に約10,000 GFP+細胞を得るのに十分であり、その結果、48ウェルプレートのウェルあたり200細胞の密度で50のウェルがメッキされることがわかりました。CVPトレンチ上皮...

げっ歯類では、舌の後臭中線で舌の舌の前に分布する乳頭の真菌、両側葉乳頭、ならびに単一の周回乳頭(CVP)に舌の味覚芽が収容される。各味覚芽は、50〜100の短命で急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成され、I型グリア様支持細胞、甘味、苦い、旨味を検出するII型細胞、酸味2、3、4を検出するIII型細胞が含まれる。マウスCVPにおいて、基底層に沿ったLGR5+幹細胞は、非味の上皮細胞と同様に、すべてのTRCタイプを産生する5。味覚系統を更新する場合、LGR5娘細胞は、味覚芽に入り、3つのTRCタイプ6のいずれかに分化することができる、まず、味覚後前駆細胞(IV型細胞)として指定される。TRCの急速な回転は、放射線および特定の薬物療法を含む治療によって中断されやすい味覚システムをレンダリングします7,8,9,10 ,11,12,13.したがって、味覚機能の制御とTRC分化のコンテキストで味覚システムを研究することは、味覚機能障害を軽減または予防する方法を理解するために不可欠である。
マウスは、ヒト14、15、16と同様に組織された味覚システムを有するため、味覚科学におけるインビボ研究の伝統的なモデルである。しかし、マウスは維持コストが高く、作業に時間がかかるため、高スループット研究には適していません。これを克服するために、インビトロオルガノイド培養方法が近年開発されている。味オルガノイドは、天然のCVP組織から生成することができ、単離マウスCVP上皮培養ex vivo17からオルガノイドが芽を出すプロセスである。これらのオルガノイドは、インビボ味覚システムと一致する多層上皮を示す。ex vivo CVP培養を必要としないオルガノイドを生成するより効率的な方法は、2014年18年にRenらによって開発されました。腸オルガノイドを成長させるために最初に開発された方法および培養培地を適応させ、マウスCVPから単一のLgr5-GFP+前駆細胞を単離し、マトリックスゲル19にめっきした。培養の最初の6日間に増殖するこれらの単一細胞は、8日目頃に分化し始め、培養期間の終わりまでに非味覚上皮細胞および3種類のTRCタイプ18、20すべてを含む。現在までに、言語オルガノイドモデルシステムを利用した複数の研究が17、18、20、21、22に掲載されています。しかしながら、これらのオルガノイドを生成するために使用される方法と培養条件は、出版物によって異なる(補足表1)。したがって、これらの方法は、ここで調整され、成人マウスCVPのLGR5+前駆体に由来する言語オルガノイドの培養のための詳細な標準化されたプロトコルを提示するように最適化されている。
言語オルガノイドは、味細胞の発達と再生を駆動する細胞生物学的プロセスを研究するためのユニークなモデルを提供します。イン ビトロ オルガノイドモデルの活用に向けて、言語オルガノイドの応用が拡大し、ラボが増える中、再現性を高めるために標準化されたプロトコルの開発と採用に取り組む分野が重要です。味覚科学の中で標準的なツールとして言語オルガノイドを確立することは、単一の幹細胞が成体味システムの分化された細胞を生成する方法を引き離す高スループット研究を可能にする。さらに、舌間オルガノイドは、味の恒常性に影響を与える可能性のある薬物を迅速にスクリーニングするために使用することができ、動物モデルでより徹底的に調査することができます。このアプローチは、最終的には、将来の薬物レシピエントの生活の質を向上させる治療法を考案するための努力を強化します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

味覚は舌の味覚芽によって媒介され、急速に更新される味覚受容体細胞(TRC)で構成されています。この継続的な売上高は、局所的な前駆細胞によって動力を与えられ、多数の医療によって混乱を招きやすい味覚機能を提供し、生活の質に深刻な影響を与えます。したがって、薬物治療の文脈でこのプロセスを研究することは、味前駆物質機能とTRC産生が影響を受けるかどうか、そしてどのように影響を受けるかを理解するために不可欠です。倫理的な懸念と人間の味の組織の限られた可用性を考えると、マウスモデルは、人間と同様の味覚システムを持つ、一般的に使用されています。時間がかかり、高価で、高スループットの研究に適していない in vivo 方法と比較して、マウスリングアルガノイドは、多くの複製と少ないマウスで実験を迅速に実行することができます。ここで、以前に公開されたプロトコルが適応され、成体マウスの周回乳頭(CVP)から分離された味覚前駆細胞からオルガノイドの味覚を生成するための標準化された方法が提示されている。CVP発現LGR5中の前駆細胞を味わい、Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 アレルを運ぶマウスからEGFP蛍光活性化細胞選別(FACS)を介して単離することができる。並べ替えられた細胞は、マトリックスゲルベースの3D培養システムにメッキされ、12日間培養されます。オルガノイドは、増殖を介して培養期間の最初の6日間増殖し、その間に非味上皮細胞と共に3つの味細胞タイプすべてを生成する分化段階に入る。オルガノイドは、12日目の成熟時、またはRNA発現および免疫組織化学分析のための成長過程でいつでも収穫することができる。成体幹細胞から言語性オルガノイドを生産するための培養方法を標準化することは、味覚機能障害を経験している患者を助けるために戦いの強力な薬物スクリーニングツールとして再現性を向上させ、言語オルガノイドを進めます。

マウスは、舌の後に位置する1つのCVPを有し、そこからLGR5+ 幹細胞を単離することができる(図1A、ブラックボックス)。CVPの下および周辺の酵素溶液の注入(図1B)は、上皮のわずかな腫脹および結合組織の消化をもたらす。十分な消化は、33分のインキュベーションに続いて達成され、これは基底組織からCVP上皮を容易に分離する?...

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Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

このプロトコルは、成体マウスの後味乳頭から単離された味覚幹細胞に由来する言語オルガノイドを培養および処理するための方法を提示する。

成人マウス味幹細胞由来の舌下オルガノイドの生成と培養

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

オルガノイドは、薬物スクリーニングと生物学的プロセスの理解に使用される強力なインビトロ技術です。したがって、舌をモデル化するオルガノイドを生成することは、味細胞の発達と再生を研究するために重要です。伝統的なインビボ味の研究は、高価で時間がかかることができます。このオルガノイドプロトコルは、より高いスループット実験を可能にしながら、これらの課題を最小限に抑える標準化された、再現可能な代替手段を提供します。成虫マウスを安楽死させた後、大きな無菌解剖はさみを使って頬を切り、顎を折ります。次に、舌を持ち上げ、舌を口腔の床から分離するために舌を切ります。舌を切り取り、カルシウムとマグネシウムで滅菌氷冷dPBSでそれを収集します。解剖顕微鏡の下で、カミソリの刃でマラー間のエミネンスの前部だけを切断することによって前舌を取り除き、捨てます。その後、後舌から任意の髪と余分な液体を除去するために繊細なタスクワイプを使用しています。次に、1ミリリットルの注射器を200〜300マイクロリットルの注射酵素溶液で満たし、乳頭周蓋(CVP)の前部まで30ゲージの半インチ針を中間マラーエミネンスのすぐ上に挿入します。上皮と下層組織の間のCVPの下および横端に酵素溶液を注入する。溶液が注入されている間、ゆっくりと、そして継続的に舌から注射器を引き出す。正確に33分間室温で舌と無菌カルシウムマグネシウムフリーdPBSをインキュベートします。超微細解剖はさみを使用して、上皮の小さな切り傷を二国間で行い、CVPの前部にすぎません。その後、上皮を細かい鉗子で持ち上げて軽く剥がします。トレンチ上皮が下層の結合組織から解放されたら、FBSであらかじめコーティングされた2つのミリリットルマイクロ遠心分離管に入れる。解離酵素カクテルを皮をむいたCVP上皮を含むチューブに加え、15分ごとに短い渦で45分間摂氏37度の水浴にインキュベートします。インキュベーションの最後の15分間、水浴中のプリウォーム0.25%トリプシン-EDTA。インキュベーションに続いて、ガラスパスツールピペットで1分間トリチュレートでチューブを渦付けします。組織片が沈着した後、新しいFBSに解体細胞の最初のコレクションを含む上清をピペット1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ。上清をGの370倍で5分間回転させ、摂氏4度で細胞をペレットにします。得られた上清を取り除き、FACSバッファー内の細胞ペレットを再懸濁し、氷の上に保管します。元の2ミリリットルマイクロ遠心チューブの残りの組織片を解き分けるには、事前に温めた0.25%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで30°Cで30分間インキュベートし、10分ごとに短い渦巻きを行います。その後、ガラスパスツールピペットで組織片を1分間トリチュレートします。組織片が沈落した後、上清をFACSバッファーに以前に採取した解水細胞を含む1.5ミリリットルマイクロ遠心分離チューブにピペット化する。解き分け細胞でチューブを回転させます。上清を除去した後、FACSバッファー内の細胞ペレットを再懸濁し、氷の上に保管します。次に、テキスト原稿に記載されているように緑色蛍光タンパク質チャネルを用いてFACSを介してLgr5-GFP陽性細胞を単離する。望ましい数のLgr5陽性懸濁細胞を新しいマイクロ遠心分離管に移す。チューブを370倍Gで5分間回転させ、摂氏4度で細胞をペレットします。上清を取り除き、チューブを氷の上に置きます。穏やかなピペットでマトリックスゲルの適切な量の細胞ペレットを穏やかに再懸濁します。その後、マイクロ遠心チューブを氷の上に50ミリリットルの円錐チューブで入れて、マトリックスゲルがゲル化するのを防ぎます。48ウェルプレートの各ウェルの中央にセル混合物にマトリックスゲル15マイクロリットルを加えます。細胞の均一な分布を確保するには、3つのウェルごとにめっきした後に上下にピペット処理してマトリックスゲルと細胞混合物を混合します。プレートを37°C、炭酸ガス5%、湿度95%で10分間インキュベーターに入れ、マトリックスゲルのゲル化を可能にします。次に、300マイクロリットルの室温WENRAS培地をロックインヒビターY27632を各ウェルに加え、プレートをインキュベーターに戻します。めっきの2日後、1ミリリットルのピペットを使用するか、真空吸引を介して各ウェルから媒体を取り出し、条件間の交差汚染を確実にします。ウェルの側面に300マイクロリットルのWENRAS培地を加え、マトリックスゲルを破壊し、プレートをインキュベーターに戻さないように注意してください。言語オルガノイドはWENR培地を用いて培養される場合、効率的に増殖しない。しかし、A83-01、TGF-βシグナル伝達阻害剤、およびSB202190を添加した後、P-38マップキナーゼシグナル伝達阻害剤は、強い成長が観察される。興味深いことに、6日後に培地からこれらの阻害剤を除去すると、一般的な味覚受容体細胞マーカーであるKcnq1の発現が高くなり、A83-01およびSB-202190が味細胞分化を妨げることを示唆している。したがって、6日目から12日目までのWENRAS培地およびWENR培地でオルガノイドを培養することにより、最適な成長と分化が得られます。成熟したオルガノイドは、ケラチン-8とケラチン-13によってマークされた非味の上皮細胞によってマークされた両方の味細胞を含む。また、ケラチン-13は、3つの味覚受容体細胞マーカーの全てよりも高いレベルで発現し、オルガノイドが主に非味上皮細胞で構成されていることを示唆している。オルガノイドは、すべての味覚受容体細胞型を発現する。Entpd2によってマークされたタイプ1細胞とGnat3によってマークされたビタータイプ2細胞は味オルガノイドで高く発現され、酸味感タイプ3細胞はCar4でマークされる一般的ではありません。味覚受容体細胞は、生体内で観察される離散的な味覚芽構造ではなくオルガノイドにランダムに分布する。口腔から舌を解剖する際には、CVPに組織の後部を含めるようにしてください。さらに、両方のトレンチが飛び出し、上皮を剥がすときに得られることを確認してください。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

大人のゼブラフィッシュ脳由来神経球の単離および培養

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

再現性の高い小分子ベースの分化プロトコルを使用したヒト多能性幹細胞から心筋細胞の大規模生産

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

標準化され、再現性のある前脳型人間から脳オルガノイドの生成誘導多能性幹細胞

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

人間の成人および胎児心標本由来分離とプライマリの心外膜細胞の培養

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

臍帯血由来から 3 D 肌 Organoid の生成誘導多能性幹細胞

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

体節誘導体誘導される人間からの体外世代多能性幹細胞します。

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

初期マウス胚からのシーケンシングのための小型RNAライブラリーの調製

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

成人マウス卵巣における正確な卵胞列挙体

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

肺発生生物学と疾患をモデル化するための人工多能性幹細胞からの3D全肺オルガノイドの生成

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...