Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

저자는 WNR 조건부 미디어와 귀중한 토론을 제공하는 피터 뎀시와 모니카 브라운 (콜로라도 안슈츠 의료 캠퍼스 오르가노이드 및 조직 모델링 공유 자원의 대학)에게 감사드립니다. 우리는 또한 콜로라도 암 센터 세포 기술과 흐름 세포 측정 공유 자원, 특히 드미트리 바투린, 세포 분류 전문 지식을 주셔서 감사합니다. 이 작품은 NIH /NIDCD R01 DC012383에 의해 지원되었습니다. DC012383-S1, DC012383-S2, NIH/NCI R21 CA236480 ~ LAB, R21DC016131 및 R21DC016131-02S1 ~ DG, F32 DC015958 - EJG.

모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 AAALAC 공인 시설에서 수행되었으며, 콜로라도 안슈츠 의료 캠퍼스의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 승인을 받았습니다. 이 프로토콜에 사용되는 LGR5EGFP-IRES-CreERT2 마우스는 잭슨 연구소, 주식 번호 008875.
참고 : 프로토콜의 원활하고 시기 적절한 진행을 보장하기 전에 다음 단계를 완료해야합니다 : 37...

<ol>
	<li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+renewal+in+gustation:+new+insights+into+taste+bud+development.">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li><li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+taste.">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li><li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).</li><li>Barlow, L. A., Klein, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+and+regenerating+a+sense+of+taste.">Developing and regenerating a sense of taste.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 401-419 (2015).</li><li>Yee, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lgr5-EGFP+marks+taste+bud+stem/progenitor+cells+in+posterior+tongue.">Lgr5-EGFP marks taste bud stem/progenitor cells in posterior tongue.</a> Stem Cells. 31 (5), 992-1000 (2013).</li><li>Miura, H., Scott, J. K., Harada, S., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog-expressing+basal+cells+are+general+post-mitotic+precursors+of+functional+taste+receptor+cells.">Sonic hedgehog-expressing basal cells are general post-mitotic precursors of functional taste receptor cells.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 243 (10), 1286-1297 (2014).</li><li>Deshpande, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation-related+alterations+of+taste+function+in+patients+with+head+and+neck+cancer:+a+systematic+review.">Radiation-related alterations of taste function in patients with head and neck cancer: a systematic review.</a> Current Treatment Options in Oncology. 19 (12), 12 (2018).</li><li>Nolden, A. A., Hwang, L. D., Boltong, A., Reed, D. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+taste+organs+is+strictly+dependent+on+epithelial+hedgehog/gli+signaling.">Maintenance of taste organs is strictly dependent on epithelial hedgehog/gli signaling.</a> PLoS Genetics. 12 (11), 1006442 (2016).</li><li>Gaillard, D., Shechtman, L. A., Millar, S. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fractionated+head+and+neck+irradiation+impacts+taste+progenitors,+differentiated+taste+cells,+and+Wnt/&#946;-catenin+signaling+in+adult+mice.">Fractionated head and neck irradiation impacts taste progenitors, differentiated taste cells, and Wnt/&#946;-catenin signaling in adult mice.</a> Scientific Reports. 9, 17934 (2019).</li><li>Nguyen, H. M., Reyland, M. E., Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation.">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li><li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+taste:+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals.">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li><li>Chaudhari, N., Roper, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples.">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li><li>Ekert, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommended+guidelines+for+developing,+qualifying,+and+implementing+complex+in+vitro+models+(CIVMs)+for+drug+discovery.">Recommended guidelines for developing, qualifying, and implementing complex in vitro models (CIVMs) for drug discovery.</a> SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R &amp; D. 25 (10), 1174-1190 (2020).</li><li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance.">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).</li><li>Vintschgau, M. v., H&#246;nigschmied, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervus+glossopharyngeus+und+schmeckbecher.">Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher.</a> Archiv f&#252;r die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).</li><li>Liu, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+Shh+signaling+centers+participate+in+fungiform+papilla+and+taste+bud+formation+and+maintenance.">Multiple Shh signaling centers participate in fungiform papilla and taste bud formation and maintenance.</a> Developmental Biology. 382 (1), 82-97 (2013).</li><li>Workman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+pluripotent-stem-cell-derived+intestinal+tissues+with+a+functional+enteric+nervous+system.">Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system.</a> Nature Medicine. 23 (1), 49-59 (2017).</li><li>Koning, M., vanden Berg, C. W., Rabelink, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+organoids:+engineering+the+vasculature.">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li></ol>

여기에 보고된 효율적이고 쉽게 반복가능한 방법으로 성인 마우스 맛 줄기 세포에서 유래한 언어 오르가노이드를 배양, 유지 및 가공할 수 있다. EGFP마우스는 8~20주 된 Lgr5-EGFP 마우스3개의 CVP를 사용하여 실험용으로 ~10,000GFP+ 세포를 얻기에 충분하여 48웰 플레이트당 200개의 세포밀도로 도금된 50개의 우물을 초래하는 것으로 나타났다. CVP 트렌치 에피테리아의 제거는 갓 만든 디스?...

설치류에서, 언어 미각은 앞쪽으로 분포된 곰팡이 형태의 유두, 양측 단풍 유두 후방, 혀1의후방 에 있는 단일 둘레 유두(CVP)에 보관된다. 각 미각은 50-100의 단명, 빠르게 갱신하는 미각 수용체 세포(TrC)로 구성되어 있으며, 여기에는 I형 I 신경교식 지지 세포, 달콤하고 쓴 맛, 감칠맛을 감지하는 II형 세포, 신맛을 감지하는 III 세포유형 2,3,4. 마우스 CVP에서, 기저 라미나를 따라 LGR5+ 줄기 세포는 모든 TRC 유형뿐만 아니라 비맛 상피 세포를생성5. 미각 계보를 갱신할 때, LGR5 딸 세포는 먼저 미토틱 미각 전구체 세포(type IV 세포)로 지정되어 미각을 입력하고 3가지 TRC 유형 중 하나로 분화할 수 있는6. TrC의 급속한 회전율은 방사선 및 특정 약물치료7,8,9,10,11,12,13을포함한 의료 치료에 의한 중단에 취약한 맛 시스템을 렌더링합니다. 따라서, 맛 줄기 세포 조절 및 TRC 분화의 맥락에서 맛 시스템을 연구하는 것은 맛 기능 장애를 완화하거나 방지하는 방법을 이해하는 데 필수적이다.
마우스는인간14, 15,16과유사하게 조직된 맛 체계를 갖기 때문에 맛 과학에서 생체 내 연구를 위한 전통적인 모델이다. 그러나, 마우스는 높은 처리량 연구 결과, 유지 보수 비용이 많이 들고 작업하는 데 시간이 많이 걸리기 때문에 이상적이지 않습니다. 이를 극복하기 위해, 체외 오르간 배양 방법은 최근 몇 년 동안 개발되었다. 미각 오르가노이드는 네이티브 CVP 조직에서 생성될 수 있으며, 오가노이드가 분리된 마우스 CVP 상피 배양ex ex vivo17로부터싹을 떼어낸 과정이다. 이 오르가노이드는 생체 내 맛 시스템과 일치하는 다층 상피를 표시합니다. ex vivo CVP 문화를 필요로하지 않는 오르가노이드를 생성하는 보다 효율적인 방법은 2014년Renetal.에 의해 개발되었다. 장 가구를 성장시키기 위해 처음 개발된 적응 방법 및 배양 배지는 마우스 CVP에서 단일 Lgr5-GFP+ 전구 세포를 분리하고 매트릭스젤(19)에서도금하였다. 이러한 단일 세포는 배양의 첫 6일 동안 증식하는 언어 오르가노이드를 생성하고, 8일째에 분화하기 시작하고, 배양 기간이 끝날 때까지 비미미피상피세포와 3가지 TRC 유형18,20을모두 함유하고 있다. 현재까지, 언어 오르가노이드 모델 시스템을 활용한 다중 연구가17,18,20,21,22를발표했다. 그러나 이러한 오르가노이드를 생성하는 데 사용되는 방법 및 문화 조건은 간행물마다 다릅니다(보충표 1). 따라서, 이러한 방법은 LGR5+ 성인 마우스 CVP의 선조로부터 유래된 언어 오르가노이드의 배양에 대한 상세한 표준화 된 프로토콜을 제시하기 위해 여기에 조정 및 최적화되었습니다.
언어 오르가노이드는 맛 세포 발달과 갱신을 주도하는 세포 생물학적 과정을 연구하기위한 독특한 모델을 제공합니다. 언어 오르가노이드의 응용 프로그램이 확장되고 더 많은 실험실이 체외 오르간 형 모델을 활용하는 방향으로 이동함에 따라, 현장은 재현성을 향상시키기 위해 표준화 된 프로토콜을 개발하고 채택하기 위해 노력하는 것이 중요합니다. 맛 과학 내의 표준 도구로 언어 오르가노이드를 확립하면 단일 줄기 세포가 성인 맛 시스템의 분화 된 세포를 생성하는 방법을 따로 애타게하는 높은 처리량 연구를 가능하게합니다. 추가적으로, 언어 오르가노이드는 맛 항상성에 잠재적인 충격을 위해 약물을 신속하게 검사하기 위하여 이용될 수 있었습니다, 그 때 동물 모형에서 더 철저하게 조사될 수 있었습니다. 이 접근은 궁극적으로 미래 약 수령인을 위한 삶의 질을 향상시키는 치료를 고안하기 위하여 노력을 강화할 것입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

맛의 감각은 빠르게 갱신 맛 수용체 세포 (TrC)로 구성된 혀의 미각에 의해 매개된다. 이 지속적인 회전율은 현지 선조 세포에 의해 구동되고 차례로 심각하게 삶의 질에 영향을 미치는 의료 치료의 무리에 의해 중단되기 쉬운 맛 기능을 렌더링합니다. 따라서 약물 치료의 맥락에서이 과정을 연구하는 것은 맛 선조 기능과 TRC 생산이 어떻게 영향을 받는지 이해하는 데 필수적입니다. 인간의 취향 조직의 윤리적 우려와 제한된 가용성을 감안할 때, 인간과 유사한 맛 시스템을 가진 마우스 모델은 일반적으로 사용됩니다. 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들며 높은 처리량 연구에 순종하지 않는 생체 내 방법과 비교하여 뮤린 언어 오르가노이드는 많은 복제및 적은 마우스로 실험을 신속하게 실행할 수 있습니다. 여기서, 이전에 발표된 프로토콜은 성인 마우스의 외면 유두(CVP)로부터 분리된 미각 전구 세포로부터 미각 오르가노이드를 생성하는 표준화된 방법이 제시되고 있다. CVP에서 미각 전구는 LGR5를 발현하고 LGR5EGFP-IRES-CreERT2 항성을 운반하는 마우스로부터 EGFP 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 통해 분리될 수 있다. 선별된 세포는 매트릭스 젤 계 3D 배양 시스템에 도금되어 12일 동안 배양된다. 오르가노이드는 증식을 통해 배양 기간의 첫 6일 동안 확장한 다음 분화 단계에 들어가 비미미맛 상피 세포와 함께 세 가지 맛 세포 유형을 모두 생성합니다. 오르가노이드는 RNA 발현 및 면역 조직화학 분석을 위한 성장 과정에서 12일째 또는 언제든지 성숙시 수확될 수 있다. 성인 줄기 세포에서 언어 오르가노이드의 생산을위한 문화 방법을 표준화하면 맛 기능 장애를 경험하는 환자를 돕기 위해 싸움에서 강력한 약물 선별 도구로 재현성을 향상시키고 언어 오르가노이드를 발전시킬 것입니다.

마우스는 1개의 CVP를 가지고 있으며, 혀에 후방으로 위치하며, LGR5+ 줄기 세포는 분리될 수 있다(도1A,블랙박스). CVP(도1B)전후의 효소 용액을 주입하면 결합 조직의 상피 및 소화가 약간 부어 오게 됩니다. 충분한 소화는 33 분 배양 후 달성되며, 이는 기본 조직에서 CVP 상피의 쉽게 분리 할 수 있습니다. CVP 상피를 벗기려고 할 때, 트?...

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Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

이 프로토콜은 성인 마우스의 후미 유두로부터 분리된 맛 줄기 세포로부터 추출한 언어 오르가노이드를 배양하고 가공하는 방법을 제시한다.

성인 마우스 맛 줄기 세포에서 파생 된 언어 오르가노이드의 생성 및 배양

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Organoids는 약물 선별 및 생물학적 과정을 이해하는 데 사용되는 강력한 체외 기술입니다. 따라서 혀를 모델링하는 오르가노이드를 생성하는 것은 맛 세포 발달과 재생을 연구하는 데 매우 중요합니다. 전통적인 생체 내 맛 연구는 비싸고 시간이 많이 걸릴 수 있습니다.이 organoid 프로토콜은 더 높은 처리량 실험을 허용하면서 이러한 문제를 최소화하는 표준화되고 재현 가능한 대안을 제공합니다. 성인 마우스를 안락사 한 후, 큰 멸균 해부 가위를 사용하여 뺨을 자르고 턱을 부러 뜨리세요. 그런 다음 혀를 들어 올리고 언어 프레이틀럼을 잘라 혀를 구강 바닥에서 분리합니다.혀를 잘라 칼슘과 마그네슘으로 멸균 얼음 차가운 dPBS로 수집합니다. 해부 현미경으로, 면도날로 인터 말라지 의 앞쪽을 절단하여 전방 혀를 제거하고 버립니다. 그런 다음 섬세한 작업 와이프를 사용하여 후방 혀에서 머리카락과 과도한 액체를 제거합니다.다음으로, 1 밀리리터 주사기를 200~300마이크로리터의 주사 효소 용액으로 채우고, 주위 유두 또는 CVP의 전방까지 인터 말라저 에지우닝 바로 위에 30 게이지 반인치 바늘을 삽입한다. 상피와 기본 조직 사이의 CVP의 측면 가장자리 아래와 측면 가장자리에 효소 용액을 주입하십시오. 용액이 주입됨에 따라 주사기를 혀에서 천천히 그리고 지속적으로 철회하십시오.혀와 멸균 칼슘 마그네슘이 없는 dPBS를 실온에서 33분 간 배양합니다. 초미세 해부 가위를 사용하여, CVP의 양측 과 단지 전방에 작은 상처를. 그런 다음 미세 한 집게로 들어 올려 상피를 부드럽게 벗깁니다.트렌치 상피가 기본 결합 조직이 없는 후 FBS로 미리 코팅된 2밀리리터 미세 원심 분리튜브에 넣습니다. 해리 효소 칵테일을 껍질을 벗긴 CVP 상피를 포함하는 튜브에 넣고 15분마다 짧은 소용돌이로 45분 동안 섭씨 37도의 수조에 배양합니다. 마지막 15분 동안 수조에서 0.25%의 트립신-EDTA를 예식합니다.인큐베이션을 따라 1분 동안 유리 파스퇴르 파이펫으로 세트리어트튜브를 소용돌이시다. 조직 조각이 정착 한 후, 새로운 FBS 코팅 1.5 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 해리 된 세포의 첫 번째 컬렉션을 포함하는 상피. 370회 G와 섭씨 4도에서 5분간 상체를 회전하여 세포를 펠릿합니다.결과 상체를 제거한 다음 FACS 버퍼에서 셀 펠릿을 다시 중단하고 얼음 위에 보관하십시오. 원래 2 밀리리터 미세 원심 분리 튜브에 남아있는 조직 조각을 분리하려면, 사전 따뜻하게 0.25 %의 Trypsin-EDTA를 추가하고 10 분마다 짧은 소용돌이와 30 분 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 그런 다음 유리 파스퇴르 파이펫으로 티슈 조각을 1 분 동안 세리라뜨 살릴 수 있습니다.조직 조각이 정착한 후, FACS 버퍼에서 이전에 수집된 해리 세포를 포함하는 1.5 밀리리터 미세 원심 분리튜브내로 상피한다. 분리된 셀로 튜브를 회전시합니다. 상체를 제거 한 후 FACS 버퍼에서 세포 펠릿을 다시 중단하고 얼음에 보관하십시오.이어서, 텍스트 원고에 설명된 바와 같이 녹색 형광 단백질 채널을 사용하여 FACS를 통해 LGr5-GFP 양성 세포를 분리한다. 원하는 수의 Lgr5 양성 부유 세포를 새로운 미세원심분리기 튜브로 이송한다. 370회 G와 섭씨 4도에서 5분간 튜브를 회전하여 세포를 펠릿합니다.상체를 제거하고 얼음에 튜브를 배치합니다. 부드러운 파이펫팅으로 적절한 양의 매트릭스 젤로 셀 펠릿을 부드럽게 재페펜팅합니다. 그런 다음 50 밀리리터 원판 튜브에 미세 원심 분리기 튜브를 얼음에 보관하여 매트릭스 젤이 겔화되는 것을 방지합니다.48웰 플레이트의 각 웰의 중앙에 있는 세포 혼합물에 매트릭스 젤의 15 마이크로리터를 추가합니다. 세포의 균일한 분포를 보장하기 위해 3개의 우물마다 도금 후 위아래로 파이프를 사용하여 매트릭스 젤과 셀 혼합물을 섞습니다. 플레이트를 섭씨 37도, 이산화탄소 5%, 습도 95%를 10분간 넣어 매트릭스 젤의 겔화를 허용합니다.이어서, 300 마이크로리터의 실온 WENRAS 미디어를 암석 억제제Y27632로 보충하여 각 우물에 넣고 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 도금 후 이틀 후, 1밀리리터 파이펫을 사용하거나 진공 포부를 통해 각 우물에서 미디어를 제거하여 조건 간의 교차 오염을 보장합니다. 300 마이크로리터의 WENRAS 미디어를 우물 의 측면에 추가하여 매트릭스 젤을 방해하지 않도록주의하고 접시를 인큐베이터에 반환하십시오.언어 오르가노이드가 WENR 미디어를 사용하여 배양될 때, 그들은 효율적으로 성장하지 않습니다. 그러나, A 83-01, TGF-베타 시그널링 억제제 및 SB202190, P-38 맵 키나아제 신호 억제제, 견고한 성장을 추가한 후, 견고한 성장이 관찰된다. 흥미롭게도, 6일 후에 매체에서 이러한 억제제들을 제거하면 일반적인 맛 수용체 세포 마커인 Kcnq1의 더 높은 발현이 발생하며, 이는 A 83-01 및 SB-202190이 맛 세포 분화를 방해한다는 것을 시사한다.따라서, 최적의 성장 및 분화는 WENRAS 미디어에서 오르가노이드를 0일에서 6일째까지 배양하고 WENR 미디어를 6일째부터 12일째까지 배양하여 얻을 수 있다. 성숙한 오르가노이드는 각질-8에 의해 표시된 맛 세포와 각질-13에 의해 표시된 비 맛 상피 세포를 모두 포함합니다. 또한, 케라틴-13은 모든 3개의 맛 수용체 세포 마커보다 더 높은 수준으로 표현되며, 이는 오르가노이드가 주로 비맛 상피 세포로 구성된다는 것을 시사한다.오르가노이드는 모든 맛 수용체 세포 유형을 표현합니다. Entpd2와 Gnat3에 의해 표시된 쓴 타입 2 세포에 의해 표시된 타입 1 세포는 맛 오르가노이드에서 높게 표현되고, Car4에 의해 표시된 신 감지 타입 3 세포는 보다 적게 일반적이다. 미각 수용체 세포는 생체 내에서 관찰되는 이산 미각 구조보다는 오르가노이드에 무작위로 분포된다.구강에서 혀를 해부 할 때 CVP에 일부 조직 후방을 포함해야합니다. 또한, 두 참호가 튀어 나와 상피를 벗길 때 얻어졌는지 확인하십시오.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

성인 Zebrafish의 뇌 유래 neurosphere를의 분리 및 문화

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

연구

발생학

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

고도의 재현 작은 분자 기반의 차별화 프로토콜을 사용하여 인간 다 능성 줄기 세포로부터 심근 세포의 대규모 생산

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

분리와 인간 성인 그리고 태아 심장 표본에서 파생 하는 기본 Epicardial 세포의 문화

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Organoids 마우스 Extrahepatic 담 즙 덕트에서의 세대

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

성인 마우스 난소의 정확한 여포 열거

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

폐 발달 생물학 및 질병을 모델링하기위한 유도 다능성 줄기 세포에서 3D 전체 폐 오르간노이드의 생성

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...