Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

Os autores gostariam de agradecer ao Dr. Peter Dempsey e Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) por fornecer mídia condicionada wnr e discussões valiosas. Agradecemos também à University of Colorado Cancer Center Cell Technologies and Flow Cytometry Shared Resources, especialmente Dmitry Baturin, pela experiência em triagem celular. Este trabalho foi financiado por: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2 e NIH/NCI R21 CA236480 para LAB, e R21DC016131 e R21DC016131-02S1 para DG, e F32 DC015958 para EJG.

Todos os procedimentos animais foram realizados em uma unidade credenciada pela AAALAC em conformidade com o Guia de Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, Lei de Bem-Estar Animal e Política de Serviços públicos de Saúde, e foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) do Campus Médico da Universidade do Colorado Anschutz. Os camundongos LGR5EGFP-IRES-CreERT2 usados neste protocolo são do Laboratório Jackson, Stock No. 008875.
NOTA: As seg...

<ol>
	<li>Barlow, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+renewal+in+gustation:+new+insights+into+taste+bud+development.">Progress and renewal in gustation: new insights into taste bud development.</a> Development. 142, 3620-3629 (2015).</li><li>Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peripheral+coding+of+taste.">Peripheral coding of taste.</a> Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).</li><li>Finger, T. E., Silver, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The neurobiology of taste and smell. , 287-314 (2000).</li><li>Barlow, L. A., Klein, O. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+taste+bud+cell+loss+after+head+and+neck+irradiation.">Mechanisms of taste bud cell loss after head and neck irradiation.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 32 (10), 3474-3484 (2012).</li><li>Ohla, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+taste:+Coding+patterns+along+the+neural+axis+in+mammals.">Recognizing taste: Coding patterns along the neural axis in mammals.</a> Chemical Senses. 44 (4), 237-247 (2019).</li><li>Chaudhari, N., Roper, S. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples.">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Morizane, R., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+nephron+progenitor+cells+and+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells.">Generation of nephron progenitor cells and kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> Nature Protocols. 12 (1), 195-207 (2017).</li><li>Ekert, J. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids.">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li><li>Fujii, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+intestinal+organoids+maintain+self-renewal+capacity+and+cellular+diversity+in+niche-inspired+culture+condition.">Human intestinal organoids maintain self-renewal capacity and cellular diversity in niche-inspired culture condition.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793 (2018).</li><li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+development+and+disease+with+organoids.">Modeling development and disease with organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li><li>Castillo-Azofeifa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sonic+hedgehog+from+both+nerves+and+epithelium+is+a+key+trophic+factor+for+taste+bud+maintenance.">Sonic hedgehog from both nerves and epithelium is a key trophic factor for taste bud maintenance.</a> Development. 144 (17), 3054-3065 (2017).</li><li>Vintschgau, M. v., H&#246;nigschmied, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nervus+glossopharyngeus+und+schmeckbecher.">Nervus glossopharyngeus und schmeckbecher.</a> Archiv f&#252;r die gesamte Physiologie des Menschen und der Tiere. 14, 443-448 (1877).</li><li>Liu, H. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-derived+kidney+organoids:+engineering+the+vasculature.">Stem cell-derived kidney organoids: engineering the vasculature.</a> Cell and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (12), 2257-2273 (2020).</li></ol>

Relatado aqui é um método eficiente e facilmente repetitivo para a cultura, manutenção e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de gosto de camundongos adultos. Verificou-se que o uso de três CVPs de camundongos Lgr5 de 8 a 20 semanas de idade-EGFP é suficiente para obter ~10.000 células GFP+ para uso experimental, resultando em 50 poços banhados a uma densidade de 200 células por poço em placas de 48 poços. A remoção da epitélio da trincheira CVP é otimizada ...

Em roedores, as papilas gustativas linguais são alojadas em papilas fungiformes distribuídas anteriormente, papilas foliadas bilaterais posteriormente, bem como uma única papila circunvallada (CVP) na linha média posterodorsal da língua1. Cada paladar é composto por células receptoras de sabor de 50-100 de curta duração, que renovam rapidamente as células receptoras de sabor (TRCs), que incluem células de suporte tipo I, células tipo II que detectam células doces, amargas e umami, e células tipo III que detectam células azedas2,3,4. No mouse CVP, as células-tronco LGR5+ ao longo da lamina basal produzem todos os tipos de TRC, bem como células epiteliais não saborosas5. Ao renovar a linhagem de sabor, as células filhas LGR5 são primeiramente especificadas como células precursoras do sabor pós-mitótico (células tipo IV) que entram em uma papila gustativa e são capazes de se diferenciar em qualquer um dos três tipos TRC6. A rápida rotatividade dos TRCs torna o sistema de paladar suscetível à interrupção por tratamentos médicos, incluindo radiação e certas terapias medicamentosas7,8,9,10,11,12,13. Assim, estudar o sistema de paladar no contexto da regulação de células-tronco do sabor e da diferenciação de TRC é vital para entender como mitigar ou prevenir a disfunção do sabor.
Os camundongos são um modelo tradicional para estudos in vivo em ciência do sabor, uma vez que possuem um sistema de sabor organizado de forma semelhante aos humanos14,15,16. No entanto, os camundongos não são ideais para estudos de alto rendimento, pois são caros de manter e demorados para trabalhar. Para superar isso, métodos in vitro de cultura organoide têm sido desenvolvidos nos últimos anos. Organoides de paladar podem ser gerados a partir do tecido CVP nativo, um processo no qual organoides brotam do camundongo isolado CVP epitélio cultivado ex vivo17. Estes organoides exibem um epitélio multicamadas consistente com o sistema de sabor in vivo. Uma forma mais eficiente de gerar organoides que não requerem a cultura ex vivo CVP foi desenvolvida pela Ren et al. em 201418. Adaptando métodos e meios de cultura desenvolvidos pela primeira vez para cultivar organoides intestinais, isolaram células lgr5-GFP+ progenitores únicas do mouse CVP e as banhavam em gel de matriz19. Essas células únicas geraram organoides linguais que se proliferam durante os primeiros 6 dias de cultura, começam a se diferenciar por volta do dia 8, e ao final do período cultural contêm células epiteliais sem gosto e todos os três tipos TRC18,20. Até o momento, foram publicados múltiplos estudos utilizando o sistema de modelo organoide lingual17,18,20,21,22; no entanto, os métodos e condições de cultura utilizados para gerar esses organoides variam entre as publicações (Tabela Suplementar 1). Assim, esses métodos foram ajustados e otimizados aqui para apresentar um protocolo padronizado detalhado para a cultura de organoides linguais derivados do LGR5+ progenitores do mouse adulto CVP.
Organoides linguais fornecem um modelo único para estudar os processos biológicos celulares que impulsionam o desenvolvimento e renovação das células do paladar. À medida que as aplicações dos organoides linguais se expandem e mais laboratórios se movem para utilizar modelos organoides in vitro, é importante que o campo se esforce para desenvolver e adotar protocolos padronizados para melhorar a reprodutibilidade. Estabelecer organoides linguais como uma ferramenta padrão dentro da ciência do sabor permitiria estudos de alto rendimento que provocam como células-tronco únicas geram as células-tronco diferenciadas do sistema de paladar adulto. Além disso, organoides linguais poderiam ser empregados para rastrear rapidamente drogas para potenciais impactos na homeostase do sabor, que poderia então ser investigada mais detalhadamente em modelos animais. Esta abordagem, em última análise, aumentará os esforços para criar terapias que melhorem a qualidade de vida dos futuros receptores de medicamentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

A sensação de paladar é mediada por papilas gustativas na língua, que são compostas de células receptoras de sabor (TRCs) que renovam rapidamente. Essa rotatividade contínua é alimentada por células progenitoras locais e torna a função de paladar propensa à interrupção por uma infinidade de tratamentos médicos, o que, por sua vez, impacta severamente a qualidade de vida. Assim, estudar esse processo no contexto do tratamento medicamentoso é vital para entender se e como a função progenitora do sabor e a produção de TRC são afetadas. Dadas as preocupações éticas e a limitada disponibilidade do tecido de sabor humano, os modelos de camundongos, que têm um sistema de sabor semelhante aos humanos, são comumente usados. Em comparação com os métodos in vivo, que são demorados, caros e não favoráveis a estudos de alto rendimento, organoides linguais murinos podem permitir que experimentos sejam executados rapidamente com muitas réplicas e menos camundongos. Aqui, protocolos publicados anteriormente foram adaptados e um método padronizado para gerar organoides de paladar a partir de células progenitoras de sabor isoladas da papila circunvallada (CVP) de camundongos adultos é apresentado. Células progenitoras de sabor no LGR5 expresso CVP e podem ser isoladas através da classificação celular ativada por fluorescência (FACS) de camundongos portadores de um alelo Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. As células classificadas são banhadas em um sistema de cultura 3D baseado em gel matricial e cultivadas por 12 dias. Os organoides se expandem durante os primeiros 6 dias do período cultural por meio da proliferação e, em seguida, entram em uma fase de diferenciação, durante a qual geram todos os três tipos de células de paladar, juntamente com células epiteliais sem gosto. Os organoides podem ser colhidos após o amadurecimento no dia 12 ou a qualquer momento durante o processo de crescimento para expressão de RNA e análise imunohistoquímica. Padronizar métodos culturais para a produção de organoides linguais a partir de células-tronco adultas melhorará a reprodutibilidade e avançará organoides linguais como uma poderosa ferramenta de triagem de medicamentos na luta para ajudar pacientes que experimentam disfunção do sabor.

Os camundongos possuem um CVP, localizado posteriormente na língua, a partir do qual as células-tronco LGR5+ podem ser isoladas(Figura 1A, caixa preta). A injeção de uma solução enzimápica dentro e ao redor do CVP (Figura 1B) resulta em um leve inchaço do epitélio e digestão do tecido conjuntivo. A digestão suficiente é alcançada após uma incubação de 33 min, o que permite a fácil separação do epitélio CVP do tecid...

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Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

O protocolo apresenta um método para cultivo e processamento de organoides linguais derivados de células-tronco de sabor isoladas da papila de sabor posterior de camundongos adultos.

Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco do Gosto de Rato Adulto

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Organoides são poderosas tecnologias in vitro usadas para triagem de drogas e compreensão de processos biológicos. Assim, gerar organoides que modelam a língua é crucial para estudar o desenvolvimento e a regeneração das células de paladar. Estudos tradicionais de sabor in vivo podem ser caros e demorados.Este protocolo organoide oferece uma alternativa padronizada e reprodutível que minimiza esses desafios, permitindo experiências de maior throughput. Depois de eutanásia um rato adulto, use uma grande tesoura de dissecção estéril para cortar as bochechas e quebrar a mandíbula. Em seguida, levante a língua e corte o frênulo lingual para separar a língua do chão da cavidade oral.Corte a língua para fora e colete-a em dPBS gelado estérei com cálcio e magnésio. Sob um microscópio dissecando, remova e descarte a língua anterior cortando apenas antes da eminência inter malar com uma lâmina de barbear. Em seguida, usando uma tarefa delicada limpar para remover qualquer cabelo e excesso de líquido da língua posterior.Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com 200 a 300 microlitros de solução de enzima de injeção e insira uma agulha de meia polegada de calibre 30 logo acima da eminência inter malar até apenas antes da papila circunvallada, ou CVP. Injete a solução enzimápica por baixo e nas bordas laterais do CVP entre o epitélio e os tecidos subjacentes. Retire a seringa lentamente e continuamente da língua enquanto a solução está sendo injetada.Incubar a língua e dPBS livres de magnésio de cálcio estéril à temperatura ambiente por precisamente 33 minutos. Utilizando uma tesoura de dissecção extra-fina, faça pequenos cortes no epitélio bilateralmente e apenas anterior do CVP. Em seguida, descasque suavemente o epitélio levantando-o com fórceps finos.Uma vez que o epitélio da trincheira esteja livre do tecido conjuntivo subjacente, coloque-o em dois tubos de microcentrífugo mililitro, pré-revestidos com FBS. Adicione o coquetel de dissociação enzimática aos tubos contendo a epitélia CVP descascada e incuba-os em um banho de água de 37 graus Celsius por 45 minutos com breve vórtice a cada 15 minutos. Durante os últimos 15 minutos de incubação, pré-aquecimento 0,25% Trypsin-EDTA no banho de água.Após a incubação, vórtice os tubos em triturate com uma pipeta Pasteur de vidro por um minuto. Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernascer contendo a primeira coleção de células dissociadas em novos tubos de microcentrífuga revestidos de 1,5 mililitro. Gire o supernante por cinco minutos a 370 vezes G e quatro graus Celsius para pelotar as células.Remova o supernatante resultante, em seguida, resuspense a pelota celular no buffer FACS e mantenha-a no gelo. Para dissociar as peças de tecido restantes nos dois tubos originais de microcentrífugo mililitro, adicione 0,25% de trypsin-EDTA pré-aquecido e incubar a 37 graus Celsius por 30 minutos com breve vórtice a cada 10 minutos. Em seguida, triturar os pedaços de tecido com uma pipeta pasteur de vidro por um minuto.Após as peças de tecido se instalarem, pipeta o supernascer nos tubos de microcentrífugo de 1,5 mililitro contendo as células dissociadas previamente coletadas no buffer FACS. Gire os tubos com as células dissociadas. Depois de remover o supernatante, resuspense as pelotas de célula no buffer FACS e mantenha-as no gelo.Em seguida, isole as células positivas Lgr5-GFP via FACS usando o canal de proteína fluorescente verde, conforme descrito no manuscrito do texto. Transfira o número desejado de células suspensas lgr5 positivas para um novo tubo de microcentrifusagem. Gire o tubo por cinco minutos a 370 vezes G e quatro graus Celsius para pelotar as células.Remova o supernatante e coloque o tubo no gelo. Levemente resuspenque a pelota celular na quantidade apropriada de gel de matriz com tubulação suave. Em seguida, mantenha o tubo de microcentrifuge no gelo em um tubo cônico de 50 mililitros para evitar que o gel de matriz geleia.Adicione 15 microliters do gel de matriz na mistura celular no centro de cada poço de uma placa de 48 poços. Para garantir uma distribuição uniforme das células, misture o gel de matriz e a mistura celular por pipetar para cima e para baixo depois de emplaar a cada três poços. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus Celsius, 5% de dióxido de carbono e 95% de umidade por 10 minutos para permitir a gelagem do geleio matricial.Em seguida, adicione 300 microliters de temperatura ambiente wenras mídia complementada com o inibidor de rocha, Y27632, a cada poço e devolva a placa para a incubadora. Dois dias após o revestimento, remova a mídia de cada poço usando uma pipeta de um mililitro ou através de aspiração de vácuo, garantindo nenhuma contaminação cruzada entre as condições. Adicione 300 microliters de mídia WENRAS ao lado do poço, tomando cuidado para não interromper o gel de matriz e devolver a placa à incubadora.Quando organoides linguais são cultivados usando mídia WENR, eles não crescem eficientemente. No entanto, depois de adicionar um 83-01, um inibidor de sinalização TGF-beta, e SB202190, p-38 mapeando o inibidor de sinalização de quinase, o crescimento robusto é observado. Curiosamente, remover esses inibidores da mídia após seis dias resulta em maior expressão do marcador de células receptores de sabor geral, Kcnq1, sugerindo que A 83-01 e SB-202190 dificultam a diferenciação das células de paladar.Assim, o ótimo crescimento e diferenciação são obtidos por organoides de cultura na mídia WENRAS do dia zero ao seis e mídia WENR do sexto ao 12º dia. Organoides maduros contêm ambas as células de sabor marcadas por queratina-8 e células epiteliais sem gosto marcadas por queratina-13. Além disso, a queratina-13 é expressa em níveis mais altos do que todos os três marcadores celulares receptores de sabor, sugerindo que os organoides são predominantemente compostos de células epiteliais sem gosto.Os organoides expressam todos os tipos de células receptoras de sabor. Células tipo um marcadas por Entpd2 e células amargas do tipo dois marcadas por Gnat3 são altamente expressas em organoides de sabor, enquanto as células de sensoriamento azedo tipo três marcadas pelo Car4 são menos comuns. As células receptoras de paladar são distribuídas aleatoriamente nos organoides e não em estruturas discretas de paladar observadas in vivo.Certifique-se de incluir algum tecido posterior ao CVP ao dissecar a língua da cavidade oral. Além disso, certifique-se de que ambas as trincheiras saem e são obtidas ao descascar o epitélio.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

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Biologia do Desenvolvimento

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Produção em larga escala de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas utilizando um altamente reprodutível pequeno-Based Molecule Protocolo de Diferenciação

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

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The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes

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Na geração de Vitro do Somite derivados de humanos induzida por células tronco pluripotentes

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