Name: generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells
Uploaded: 2021-04-05T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells at JoVE.com

Los autores desean agradecer al Dr. Peter Dempsey y Monica Brown (University of Colorado Anschutz Medical Campus Organoid and Tissue Modeling Shared Resource) por proporcionar medios condicionados por WNR y discusiones valiosas. También agradecemos a los Recursos Compartidos de Tecnologías Celulares y Citometría de Flujo del Centro de Cáncer de la Universidad de Colorado, especialmente a Dmitry Baturin, por su experiencia en clasificación celular. Este trabajo fue financiado por: NIH/NIDCD R01 DC012383, DC012383-S1, DC012383-S2, y NIH/NCI R21 CA236480 a LAB, y R21DC016131 y R21DC016131-02S1 a DG, y F32 DC015958 a EJG.

Todos los procedimientos con animales se realizaron en una instalación acreditada por AAALAC de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio, la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública, y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en el Campus Médico Anschutz de la Universidad de Colorado. Los ratones Lgr5EGFP-IRES-CreERT2 utilizados en este protocolo son de The Jackson Laboratory, Stock No. 008875.
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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amine-reactive+dyes+for+dead+cell+discrimination+in+fixed+samples.">Amine-reactive dyes for dead cell discrimination in fixed samples.</a> Current Protocols in Cytometry. , (2010).</li><li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon,+adenoma,+adenocarcinoma,+and+Barrett's+epithelium.">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. 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Aquí se informa que es un método eficiente y fácilmente repetible para cultivar, mantener y procesar organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos. Se encontró que el uso de tres CVP de ratones Lgr5-EGFP de 8 a 20 semanas de edad es suficiente para obtener ~ 10,000 células GFP+ para uso experimental, lo que resulta en 50 pomos chapados a una densidad de 200 células por pozo en placas de 48 pomos. La eliminación de los epitelios de zanja CVP se optimiza inyectando ...

En roedores, las papilas gustativas linguales se alojan en papilas fungiformes distribuidas anteriormente, papilas foliadas bilaterales posteriormente, así como una sola papila circunvalada (CVP) en la línea media posterodorsal de la lengua1. Cada papila gustativa está compuesta por 50-100 células receptoras del gusto (TRC) de corta duración y rápida renovación, que incluyen células de soporte tipo I similares a las gliales, células tipo II que detectan dulce, amargo y umami, y células tipo III que detectan agrias2,3,4. En el CVP de ratón, las células madre LGR5+ a lo largo de la lámina basal producen todos los tipos de TRC, así como las células epiteliales no gustales5. Al renovar el linaje del gusto, las células hijas LGR5 se especifican primero como células precursoras del gusto postmitótico (células tipo IV) que entran en una papila gustativa y son capaces de diferenciarse en cualquiera de los tres tipos deCVR 6. La rápida rotación de los TRP hace que el sistema de sabor sea susceptible a la interrupción por tratamientos médicos, incluida la radiación y ciertas terapias farmacológicas7,8,9,10,11,12,13. Por lo tanto, estudiar el sistema de sabor en el contexto de la regulación de las células madre del gusto y la diferenciación de la CVR es vital para comprender cómo mitigar o prevenir la disfunción del gusto.
Los ratones son un modelo tradicional para los estudios in vivo en la ciencia del gusto, ya que tienen un sistema de sabor organizado de manera similar a los humanos14,15,16. Sin embargo, los ratones no son ideales para estudios de alto rendimiento, ya que son costosos de mantener y requieren mucho tiempo para trabajar. Para superar esto, en los últimos años se han desarrollado métodos de cultivo de organoides in vitro. Los organoides del gusto se pueden generar a partir de tejido CVP nativo, un proceso en el que los organoides brotan a partir del epitelio CVP aislado de ratón cultivado ex vivo17. Estos organoides muestran un epitelio multicapa consistente con el sistema de sabor in vivo. Una forma más eficiente de generar organoides que no requiere cultivo cvP ex vivo fue desarrollada por Ren etal. en 201418. Adaptando los métodos y medios de cultivo desarrollados por primera vez para cultivar organoides intestinales, aislaron células progenitoras individuales de Lgr5-GFP+ de CVP de ratón y las enchaparon en gel de matriz19. Estas células individuales generan organoides linguales que proliferan durante los primeros 6 días de cultivo, comienzan a diferenciarse alrededor del día 8, y al final del período de cultivo contienen células epiteliales no gustales y los tres tipos deCVR 18,20. Hasta la fecha, se han publicado múltiples estudios que utilizan el sistema modelo de organoideslinguales 17,18,20,21,22; sin embargo, los métodos y las condiciones de cultivo utilizados para generar estos organoides varían entre las publicaciones (Tabla suplementaria 1). Por lo tanto, estos métodos se han ajustado y optimizado aquí para presentar un protocolo estandarizado detallado para el cultivo de organoides linguales derivados de LGR5+ progenitores de CVP de ratón adulto.
Los organoides linguales proporcionan un modelo único para estudiar los procesos biológicos celulares que impulsan el desarrollo y la renovación de las células gustales. A medida que las aplicaciones de los organoides linguales se expanden y más laboratorios avanzan hacia la utilización de modelos organoides in vitro, es importante que el campo se esfuerce por desarrollar y adoptar protocolos estandarizados para mejorar la reproducibilidad. El establecimiento de organoides linguales como una herramienta estándar dentro de la ciencia del gusto permitiría estudios de alto rendimiento que separan cómo las células madre individuales generan las células diferenciadas del sistema de sabor adulto. Además, los organoides linguales podrían emplearse para detectar rápidamente los medicamentos en busca de posibles impactos en la homeostasis del gusto, que luego podrían investigarse más a fondo en modelos animales. En última instancia, este enfoque mejorará los esfuerzos para diseñar terapias que mejoren la calidad de vida de los futuros receptores de medicamentos.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Donkey anti Goat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11056, RRID: AB_142628</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 546 Goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A11010, RRID:AB_2534077</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 568 Goat anti Guinea pig IgG</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11075, RRID:AB_2534119</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Donkey anti Rabbit IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A31573, RRID:AB_2536183</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 Goat anti Rat IgG</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A21247, RRID:AB_141778</td>
			<td>1:2000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for FACS)</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>62247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (for immunohistochemistry)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D3571, RRID:AB_2307445</td>
			<td>1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-CAR4</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>AF2414, RRID:AB_2070332</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guinea pig anti-KRT13</td>
			<td>Acris Antibodies</td>
			<td>BP5076, RRID:AB_979608</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-GUSTDUCIN</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology Inc.</td>
			<td>sc-395, RRID:AB_673678</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NTPDASE2</td>
			<td>CHUQ</td>
			<td>mN2-36LI6, RRID:AB_2800455</td>
			<td>1:300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-KRT8</td>
			<td>DSHB</td>
			<td>TROMA-IS, RRID: AB_531826</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2D rocker</td>
			<td>Benchmark Scientific Inc.</td>
			<td>BR2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D Rotator</td>
			<td>Lab-Line Instruments</td>
			<td>4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Big-Digit Timer/Stopwatch</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S407992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5415D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 tank</td>
			<td>Airgas</td>
			<td>CD USP50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FormaTM Series 3 Water Jackeed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>4110</td>
			<td>184 L, Polished Stainless Steel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incucyte</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>Model: S3</td>
			<td>Cancer Center Cell Technologies Shared Resource, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP100</td>
			<td>Cytomation Inc</td>
			<td>Model: S13211997</td>
			<td>&#160;Gates Center Flow Cytometry Core, University of Colorado Anschutz Medical Campus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td>Excella E1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5417R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>ND-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Stereomicroscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Stemi SV6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>580BR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Precision</td>
			<td>51220073</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A83 01</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>SML0788-5MG</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 500 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12634-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504044</td>
			<td>Stock concentration 50X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15750-060</td>
			<td>Stock concentration 1000X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050061</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine EGF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-09-1MG</td>
			<td>Stock concentration 500 &#181;g/mL, final concentration 50 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine Noggin</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>250-38</td>
			<td>Stock concentration 50 &#181;g/mL, final concentration 25 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetyl-L-cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9165</td>
			<td>Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nicotinamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>N0636-100g</td>
			<td>Stock concentration 1 M, final concentration 1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>Stock concentration 100X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primocin</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>ant-pm-1</td>
			<td>Stock concentration 500X, final concentration 1X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SB202190</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>1264</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 0.4 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WRN Conditioned media</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Received from Dempsey Lab (AMC Organoid and Tissue Modeling Share Resource). Derived from L-WRN (ATCC&#174; CRL-3276&#8482;) cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydochloride 10ug</td>
			<td>APExBIO</td>
			<td>A3008-10</td>
			<td>Stock concentration 10 mM, final concentration 10 &#181;M</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml TB Syringe</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol, min. 98%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3148-25ML</td>
			<td>&#946;-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1420-2700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48-well plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 3/4 inch Pasteur Pipets</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-678-8A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Albumin from bovine serum (BSA)</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>A9647-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer RLT Lysis buffer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>1015750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Recovery Solution</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase from Clostridium histolyticum, type I</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>C0130-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex RGF BME, Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>3533-005-02</td>
			<td>Matrigel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II (neutral protease, grade II)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Roche)</td>
			<td>4942078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Filters</td>
			<td>Sysmex</td>
			<td>04-0042-2316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (1X) (Ca2+ &#38; Mg2+ free)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline with Ca2+ &#38; Mg2+&#160;</td>
			<td>Sigma Life Sciences</td>
			<td>D8662-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA, 0.5M (pH 8.0)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V4231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase Lyophilized</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>LS002292</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extra Fine Bonn Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount G</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Solution</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>H3537-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HyClone Tryspin 0.25% + EDTA</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iScript cDNA Synthesis Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706691</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modeling Clay, Gray</td>
			<td>Sargent Art</td>
			<td>22-4084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle</td>
			<td>BD Syringe</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Donkey Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>017-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Goat Serum</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>005-000-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerSYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4367659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNeasy Micro Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>74004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock Tubes 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7647-14-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate dibasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>7558-79-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phosphate monobasic anhydrous</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>7558-80-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SuperFrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scissors - Sharp</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14002-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma Life Science</td>
			<td>T8787-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VWR micro cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366067</td>
			<td>22x22mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and culture of lingual organoids derived from adult mouse taste stem cells

El sentido del gusto está mediado por las papilas gustativas en la lengua, que se componen de células receptoras del gusto (TRC) que se renuevan rápidamente. Esta rotación continua es impulsada por células progenitoras locales y hace que la función gustal sea propensa a la interrupción por una multitud de tratamientos médicos, lo que a su vez afecta gravemente la calidad de vida. Por lo tanto, estudiar este proceso en el contexto del tratamiento farmacológico es vital para comprender si y cómo se ven afectadas la función progenitora del gusto y la producción de CVR. Dadas las preocupaciones éticas y la disponibilidad limitada de tejido gustativo humano, los modelos de ratón, que tienen un sistema de sabor similar al de los humanos, se utilizan comúnmente. En comparación con los métodos in vivo, que consumen mucho tiempo, son costosos y no susceptibles de estudios de alto rendimiento, los organoides linguales murinos pueden permitir que los experimentos se ejecuten rápidamente con muchas réplicas y menos ratones. Aquí, se han adaptado protocolos publicados anteriormente y se presenta un método estandarizado para generar organoides del gusto a partir de células progenitoras del gusto aisladas de la papila circunvalada (CVP) de ratones adultos. Las células progenitoras gustales en el CVP expresan LGR5 y se pueden aislar a través de la clasificación celular activada por fluorescencia EGFP (FACS) de ratones portadores de un alelo Lgr5EGFP-IRES-CreERT2. Las células clasificadas se enchan en un sistema de cultivo 3D basado en gel de matriz y se cultivan durante 12 días. Los organoides se expanden durante los primeros 6 días del período de cultivo a través de la proliferación y luego entran en una fase de diferenciación, durante la cual generan los tres tipos de células gustales junto con las células epiteliales no gustales. Los organoides se pueden cosechar al madurar en el día 12 o en cualquier momento durante el proceso de crecimiento para la expresión de ARN y el análisis inmunohistoquímico. La estandarización de los métodos de cultivo para la producción de organoides linguales a partir de células madre adultas mejorará la reproducibilidad y hará avanzar los organoides linguales como una poderosa herramienta de detección de drogas en la lucha para ayudar a los pacientes que experimentan disfunción del gusto.

Los ratones tienen un CVP, ubicado posteriormente en la lengua, del cual se pueden aislar células madre LGR5+ (Figura 1A,caja negra). La inyección de una solución enzimática debajo y alrededor de la CVP(Figura 1B)da como resultado una ligera hinchazón del epitelio y la digestión del tejido conectivo. Se logra una digestión suficiente después de una incubación de 33 minutos, lo que permite una fácil separación del epitelio C...

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Generation and Culture of Lingual Organoids Derived from Adult Mouse Taste Stem Cells

El protocolo presenta un método para cultivar y procesar organoides linguales derivados de células madre gustales aisladas de la papila gustal posterior de ratones adultos.

Generación y cultivo de organoides linguales derivados de células madre gustales de ratones adultos

The sense of taste is mediated by taste buds on the tongue, which are composed of rapidly renewing taste receptor cells (TRCs). This continual turnover is ...

Los organoides son una poderosa tecnología in vitro utilizada para la detección de drogas y la comprensión de los procesos biológicos. Por lo tanto, la generación de organoides que modelan la lengua es crucial para estudiar el desarrollo y la regeneración de las células gusta gustativos. Los estudios tradicionales de sabor in vivo pueden ser costosos y llevar mucho tiempo.Este protocolo organoide ofrece una alternativa estandarizada y reproducible que minimiza esos desafíos al tiempo que permite experimentos de mayor rendimiento. Después de sacrificar a un ratón adulto, use tijeras de disección estériles grandes para cortar las mejillas y romper la mandíbula. Luego, levante la lengua y corte el frenillo lingual para separar la lengua del piso de la cavidad oral.Cortar la lengua y recogerla en dPBS estéril helado con calcio y magnesio. Bajo un microscopio de disección, retire y deseche la lengua anterior cortando justo la parte anterior de la eminencia inter malar con una cuchilla de afeitar. Luego use una delicada toallita de tareas para eliminar el vello y el exceso de líquido de la lengua posterior.A continuación, llene una jeringa de un mililitro con 200 a 300 microlitros de solución enzimática inyectable e inserte una aguja de media pulgada de calibre 30 justo por encima de la eminencia inter malar hasta justo antes de las papilas circunvaladas, o CVP. Inyecte la solución enzimática debajo y en los bordes laterales de la CVP entre el epitelio y los tejidos subyacentes. Retire la jeringa lenta y continuamente de la lengua mientras se inyecta la solución.Incubar la lengua y el dPBS estéril libre de calcio y magnesio a temperatura ambiente durante exactamente 33 minutos. Usando tijeras de disección extrafinas, haga pequeños cortes en el epitelio bilateralmente y justo antes de la CVP. Luego pela suavemente el epitelio levantándolo con forrceps finos.Una vez que el epitelio de la zanja esté libre del tejido conectivo subyacente, colóquelo en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros, precubierto con FBS. Agregue el cóctel de enzimas de disociación a los tubos que contienen los epitelios CVP pelados e incube en un baño de agua de 37 grados Celsius durante 45 minutos con un breve vórtice cada 15 minutos. Durante los últimos 15 minutos de incubación, precalen un 0,25% de Tripsina-EDTA en el baño de agua.Después de la incubación, vórtice los tubos en triturar con una pipeta Pasteur de vidrio durante un minuto. Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante que contiene la primera colección de células disociadas en nuevos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros recubiertos de FBS. Gire el sobrenadante durante cinco minutos a 370 veces G y cuatro grados Celsius para peletizar las células.Retire el sobrenadante resultante, luego vuelva a colocar el gránulo celular en el tampón FACS y manténgalo en hielo. Para disociar las piezas de tejido restantes en los tubos de microcentrífuga originales de dos mililitros, agregue tripsina-EDTA 0.25% precalentadas e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos con un breve vórtice cada 10 minutos. Luego, tritura las piezas de tejido con una pipeta Pasteur de vidrio durante un minuto.Después de que las piezas de tejido se asienten, pipetee el sobrenadante en los tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros que contienen las células disociadas previamente recolectadas en el tampón FACS. Girar los tubos con las células disociadas. Después de retirar el sobrenadante, vuelva a colocar los gránulos celulares en el tampón FACS y manténgalos en hielo.Luego, aísle las células positivas Lgr5-GFP a través de FACS utilizando el canal de proteína fluorescente verde como se describe en el manuscrito de texto. Transfiera el número deseado de células suspendidas positivas Lgr5 a un nuevo tubo de microcentrífuga. Gire el tubo durante cinco minutos a 370 veces G y cuatro grados Celsius para peletizar las células.Retire el sobrenadante y coloque el tubo sobre hielo. Resuspenda suavemente el pellet celular en la cantidad adecuada de gel de matriz con pipeteo suave. Luego mantenga el tubo de la microcentrífuga sobre hielo en un tubo cónico de 50 mililitros para evitar que el gel de matriz se gelifique.Agregue 15 microlitros del gel de matriz en la mezcla celular en el centro de cada pozo de una placa de 48 pozos. Para garantizar una distribución uniforme de las células, mezcle el gel de matriz y la mezcla de células mediante el pipeteo hacia arriba y hacia abajo después de emplatar cada tres pozos. Coloque la placa en una incubadora a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y 95% de humedad durante 10 minutos para permitir la gelificación del gel de matriz.Luego, agregue 300 microlitros de medios WENRAS a temperatura ambiente complementados con el inhibidor de roca, Y27632, a cada pozo y devuelva la placa a la incubadora. Dos días después del revestimiento, retire el medio de cada pozo con una pipeta de un mililitro o mediante aspiración al vacío, asegurando que no haya contaminación cruzada entre condiciones. Agregue 300 microlitros de medios WENRAS por el costado del pozo, teniendo cuidado de no interrumpir el gel de la matriz y devolver la placa a la incubadora.Cuando los organoides linguales se cultivan utilizando medios WENR, no crecen de manera eficiente. Sin embargo, después de agregar A 83-01, un inhibidor de la señalización TGF-beta, y SB202190, inhibidor de la señalización de la quinasa mapa P-38, se observa un crecimiento robusto. Curiosamente, la eliminación de estos inhibidores de los medios después de seis días da como resultado una mayor expresión del marcador general de células receptoras del gusto, Kcnq1, lo que sugiere que A 83-01 y SB-202190 dificultan la diferenciación de las células gusta gusta gustares.Así, el crecimiento y la diferenciación óptimos se obtienen cultivando organoides en medios WENRAS desde el día cero hasta el seis y medios WENR desde el día seis hasta el 12. Los organoides maduros contienen células gustales marcadas por queratina-8 y células epiteliales no gustales marcadas por queratina-13. Además, la queratina-13 se expresa en niveles más altos que los tres marcadores de células receptoras del gusto, lo que sugiere que los organoides están compuestos predominantemente de células epiteliales no gustales.Los organoides expresan todos los tipos de células receptoras del gusto. Las células de tipo uno marcadas por Entpd2 y las células amargas de tipo dos marcadas por Gnat3 están altamente expresadas en organoides de sabor, mientras que las células de tipo tres de detección agria marcadas por Car4 son menos comunes. Las células receptoras del gusto se distribuyen aleatoriamente en los organoides en lugar de en estructuras discretas de papilas gustativas observadas in vivo.Asegúrese de incluir un poco de tejido posterior al CVP al diseccionar la lengua de la cavidad oral. Además, asegúrese de que ambas zanjas salgan y se obtengan al pelar el epitelio.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres

Aislamiento y cultivo de neuroesferas derivada de cerebro de adultos de pez cebra

The zebrafish is a highly relevant model organism for understanding the cellular and molecular mechanisms involved in neurogenesis and brain regeneration ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

La producción a gran escala de los cardiomiocitos de células madre pluripotentes utilizando un pequeño protocolo de diferenciación basada en la molécula altamente reproducible

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de organoides Cerebral prosencéfalo-tipo estandarizadas y reproducibles de humanos inducida por células madre pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

El aislamiento y cultivo de células epicárdicas principales derivan de ejemplares de corazón humano adulto y Fetal

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

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En la generación de Vitro del Somite derivados humanos inducida por células madre pluripotentes

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Generation of Organoids from Mouse Extrahepatic Bile Ducts

Generación de organoides de conductos biliares extrahepáticos del ratón

Cholangiopathies, which affect extrahepatic bile ducts (EHBDs), include biliary atresia, primary sclerosing cholangitis, and cholangiocarcinoma. They have ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

Preparación de pequeñas bibliotecas de ARN para la secuenciación de embriones de ratón tempranos

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Enumeración exacta del folículo en ovarios adultos del ratón

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

Generation of 3D Whole Lung Organoids from Induced Pluripotent Stem Cells for Modeling Lung Developmental Biology and Disease

Generación de organoides pulmonares enteros en 3D a partir de células madre pluripotentes inducidas para modelar la biología y la enfermedad del desarrollo pulmonar

Human lung development and disease has been difficult to study due to the lack of biologically relevant in vitro model systems. Human induced pluripotent ...