Name: application of dna fingerprinting using the d1s80 locus in lab classes
Uploaded: 2021-07-17T13:30:00
Duration: 8 min 35 s
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लेखकों को अपनी आवाज पर और सभी प्रतिभागियों को जो इस काम के लिए नमूने दान के लिए केविन ग्राहम शुक्रिया अदा करना चाहते हैं ।

<ol>
	<li>Jeffreys, A. J., Wilson, V., Thein, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypervariable+'minisatellite'+regions+in+human+DNA.">Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA.</a> Nature. 314 (6006), 67-73 (1985).</li><li>Kasai, K., Nakamura, Y., White, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amplification+of+a+variable+number+of+tandem+repeats+(VNTR)+locus+(pMCT118)+by+the+polymerase+chain+reaction+(PCR)+and+its+application+to+forensic+science.">Amplification of a variable number of tandem repeats (VNTR) locus (pMCT118) by the polymerase chain reaction (PCR) and its application to forensic science.</a> Journal of Forensic Science. 35 (5), 1196-1200 (1990).</li><li>Balamurugan, K., Tracey, M. L., Heine, U., Maha, G. C., Duncan, G. 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L., Mazumder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Informativeness+of+genetic+markers+for+forensic+inference+-+An+information+theoretic+approach.">Informativeness of genetic markers for forensic inference - An information theoretic approach.</a> Forensic Science International: Genetics Supplement Series. 1 (1), 652-653 (2008).</li><li>Budowle, B., Chakraborty, R., Giusti, A. M., Eisenberg, A. J., Allen, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+VNTR+locus+D1S80+by+the+PCR+followed+by+high-resolution+PAGE.">Analysis of the VNTR locus D1S80 by the PCR followed by high-resolution PAGE.</a> American Journal of Human Genetics. 48 (1), 137 (1991).</li><li>Budowle, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1S80+population+data+in+African+Americans,+Caucasians,+southeastern+Hispanics,+southwestern+Hispanics,+and+Orientals.">D1S80 population data in African Americans, Caucasians, southeastern Hispanics, southwestern Hispanics, and Orientals.</a> Journal of Forensic Science. 40 (1), 38-44 (1995).</li><li>Verbenko, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymorphisms+at+locus+D1S80+and+other+hypervariable+regions+in+the+analysis+of+Eastern+European+ethnic+group+relationships.">Polymorphisms at locus D1S80 and other hypervariable regions in the analysis of Eastern European ethnic group relationships.</a> Annals of Human Biology. 33 (5-6), 570-584 (2006).</li><li>Walsh, S. J., Eckhoff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Australian+Aboriginal+population+genetics+at+the+D1S80+VNTR+locus.">Australian Aboriginal population genetics at the D1S80 VNTR locus.</a> Annals of Human Biology. 34 (5), 557-565 (2007).</li><li>Limborska, S. A., Khrunin, A. V., Flegontova, O. V., Tasitz, V. A., Verbenko, D. 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A., Akhteruzzaman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+analysis+of+Bangladeshi+population+with+reference+to+D1S80+VNTR+locus.">Phylogenetic analysis of Bangladeshi population with reference to D1S80 VNTR locus.</a> Bioresearch Communications. 2 (1), 146-151 (2016).</li><li>K&#246;seler, A., Atalay, A., Atalay, E. &. #. 2. 1. 4. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allele+frequency+of+VNTR+locus+D1S80+observed+in+Denizli+province+of+Turkey.">Allele frequency of VNTR locus D1S80 observed in Denizli province of Turkey.</a> Biochemical genetics. 47 (7-8), 540-546 (2009).</li><li>Mastana, S. S., Papiha, S. 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M., Williamson, J. H., Padula, D., Sundby, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+PCR+&amp;+a+Single+Hair+to+Produce+a+"DNA+Fingerprint.".">Use PCR &amp; a Single Hair to Produce a "DNA Fingerprint.".</a> The American Biology Teacher. 59 (3), 172-178 (1997).</li><li>Jackson, D. D., Abbey, C. S., Nugent, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+profiling+of+the+D1S80+locus:+A+forensic+analysis+for+the+undergraduate+biochemistry+laboratory.">DNA profiling of the D1S80 locus: A forensic analysis for the undergraduate biochemistry laboratory.</a> Journal of Chemical Education. 83 (5), 774 (2006).</li><li>Mansoor, S. K., Hussein, E. F., Ibraheem, A. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+from+buccal+swabs+suitable+for+high-throughput+SNP+multiplex+analysis.">DNA from buccal swabs suitable for high-throughput SNP multiplex analysis.</a> Journal of biomolecular techniques: JBT. 20 (5), 232 (2009).</li><li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymerase+chain+reaction:+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies.">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).</li><li>Destro-Bisol, G., Capelli, C., Belledi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inferring+microevolutionary+patterns+from+allele-size+frequency+distributions+of+minisatellite+loci:+a+worldwide+study+of+the+APOB+3'hypervariable+region+polymorphism.">Inferring microevolutionary patterns from allele-size frequency distributions of minisatellite loci: a worldwide study of the APOB 3'hypervariable region polymorphism.</a> Human Biology. 72 (5), 733-751 (2000).</li><li>Chen, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+alleles+in+the+3'end+region+of+human+apoB+gene.">Structure and function of alleles in the 3'end region of human apoB gene.</a> Chinese Medical Journal. 112 (3), 221-223 (1999).</li><li>Renges, H. -. H., Peacock, K., Dunning, A. M., Talmud, P., Humphries, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+relationship+between+the+3+'-VNTR+and+diallelic+apolipoprotein+B+gene+polymorphisms:+Haplotype+analysis+in+individuals+of+European+and+South+Asian+origin.">Genetic relationship between the 3 '-VNTR and diallelic apolipoprotein B gene polymorphisms: Haplotype analysis in individuals of European and South Asian origin.</a> Annals of Human Genetics. 56 (1), 11-33 (1992).</li><li>Kravchenko, S. A., Maliarchuk, O. S., Livshits, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+genetics+study+of+the+allelic+polymorphism+in+the+hypervariable+region+of+the+apolipoprotein+B+gene+in+the+population+of+different+regions+of+Ukraine.">A population genetics study of the allelic polymorphism in the hypervariable region of the apolipoprotein B gene in the population of different regions of Ukraine.</a> Tsitologiia i Genetika. 30 (5), 35-41 (1996).</li></ol>

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है ।

यहां हमने स्नातक व्यावहारिक कक्षाओं में आणविक फिंगरप्रिंटिंग को लागू करने के लिए एक सरल और लागत कुशल विधि का वर्णन किया ।
D1S80 लोकस में आनुवंशिक भिन्नता के लिए स्क्रीन करने के लिए, डीएनए निष्कर्षण और विश्लेषण के साथ मानव जैविक नमूना संग्रह की आवश्यकता है। यह आवश्यक है कि पूरी प्रक्रिया में मानव जैविक नमूनों का नैतिक उपयोग सुनिश्चित किया जाए। नमूना प्रबंधन को एक व्यापक नियामक ढांचे के भीतर नियंत्रित किया जाता है जो नमूनों और संबद्ध डेटा18 (उदाहरण के लिए, मानव जैविक सामग्री के उपयोग के लिए सहमति) का सही उपयोग सुनिश्चित करता है। प्रतिभागियों को उनके नमूनों के उपयोग, आनुवंशिक संबंधों में विसंगतियों की खोज के जोखिम (उदाहरण के लिए, संबंधित व्यक्तियों के लिए), जैविक नमूनों और डेटा के भविष्य के भंडारण के लिए गोपनीयता संरक्षण और इरादों के बारे में ठीक से सूचित किया जाना चाहिए । सभी दानदाताओं (छात्रों या सहकर्मियों) को स्वतंत्र रूप से सहमति देनी चाहिए और बिना कारण दिए वापस लेने के अधिकार को समझना चाहिए । सामान्य तौर पर, इस प्रयोगशाला वर्ग के संचालन से पहले मानव नमूना प्रबंधन के लिए संबंधित दिशानिर्देशों और विनियमों से परिचित होना अपरिहार्य है।
स्नातक प्रयोगशाला पाठ्यक्रमों में बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं के संग्रह के लिए, ऑपरेटर से या DNases के साथ डीएनए नमूनों के संदूषण से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए । यह सिफारिश की जाती है कि प्रयोगशाला कोट, दस्ताने और सुरक्षात्मक चश्मे का उपयोग हमेशा बाँझ झाड़ू और माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के साथ किया जाता है। बुक्कल स्वाब आधारित सेल हार्वेस्टिंग को पीसीआर-आधारित वीएनटीआर विश्लेषण के लिए उपयुक्त आनुवंशिक सामग्री के संग्रह के लिए एक सुविधाजनक और लागत प्रभावी तरीका माना जाता है, क्योंकि यह अपेक्षाकृत सस्ती और गैर-निवास है। बुक्कल झाड़ू के अलावा, लार चिकित्सा अनुसंधान के लिए सबसे आम मौखिक नमूना विधि है। यह दिखाया गया है कि बुक्कल झाड़ू में लार की तुलना में एपिथेलियल कोशिकाओं का अनुपात अधिक होता है, जिससे उन्हें पीसीआर आधारित D1S80 VNTR विश्लेषण19,20के लिए पर्याप्त मात्रा और डीएनए की गुणवत्ता प्रदान करने में अधिक विश्वसनीय बना दिया जाता है । इसके अतिरिक्त, 21 जनसंख्या विविधता अध्ययनों में, उदाहरण के लिए, उपयोग किए जाने परभौगोलिकबाधाओं पर काबू पाने के लिए स्व-संग्रह के बाद बुक्कल झाड़ू को बाहर निकाला जा सकता है।
विभिन्न कंपनियों से निष्कर्षण किट के विकास के कारण डीएनए निष्कर्षण अपेक्षाकृत आसान हो गया है। फिर भी, उन किटों का उपयोग सीमित वित्तीय संसाधनों के कारण प्रयोगशाला कक्षाओं में उपयुक्त नहीं हो सकता है। यहां, हम एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए निष्कर्षण किट की जरूरत के बिना मानव नमूनों से डीएनए निष्कर्षण के लिए एक आसान, तेजी से और लागत कुशल विधि प्रस्तुत की । डीएनए निष्कर्षण विधि वर्णित कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग नहीं करता है, इसके बजाय सेलुलर प्रोटीन एक 8 एम पोटेशियम एसीटेट समाधान का उपयोग कर नमक एकाग्रता में वृद्धि से हटा रहे हैं । यह विधि एक बार में कई नमूनों को संभालने और प्रत्येक नमूने के लिए कई जीनोटाइप विश्लेषणों के लिए पर्याप्त डीएनए में पैदावार की अनुमति देती है।
पीसीआर कई आणविक प्रयोगशालाओं में एक आम तकनीक है। जबकि आम तौर पर परेशानी से मुक्त, वहां नुकसान है कि नकली परिणाम है, जो कहीं और22चर्चा की गई है उत्पादन प्रतिक्रिया जटिल हो सकता है । यहां प्रस्तुत पीसीआर की स्थिति खराब टेम्पलेट डीएनए गुणवत्ता के चेहरे में बहुत मजबूत दिखाई दी है, लेकिन खराब बुक्कल एपिथेलियल सेल हार्वेस्टिंग के कारण बेहद कम डीएनए सांद्रता के साथ टेम्पलेट्स का उपयोग करते समय पीसीआर प्रवर्धन की कमी फिर भी कभी-कभार देखी जाती थी । इस अध्ययन में इस्तेमाल डीएनए प्राइमर विभिन्न कंपनियों से आदेश दिया जा सकता है, जैसे कि इस कागज के अंत में सामग्री की मेज में उद्धृत । ऑपरेटर से DNases या डीएनए के साथ संदूषण से बचने के लिए डीएनए प्राइमर के साथ काम करते समय विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। पीसीआर उत्पादों को भी उपयोग में नहीं होने पर ठंडा रखना चाहिए।
एक और महत्वपूर्ण कदम एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस है। 16 बीपी की केवल एक दोहराने इकाई द्वारा भिन्न टुकड़े जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस में अलग नहीं किया जा सकता है और इस प्रकार एक बैंड के रूप में दिखाई देते हैं। इस मामले में, D1S80 alleles परीक्षण की दोहराने इकाइयों की संख्या का एक उचित निर्धारण का आश्वासन नहीं दिया जा सकता है । इसलिए, जेल के रन समय को बढ़ाया जाना चाहिए जबकि वोल्टेज को कम किया जाना चाहिए और एकल बैंड के बेहतर समाधान और अलगाव प्रदान करने के लिए जेल एकाग्रता को बढ़ाया जा सकता है।
यह उल्लेखनीय है कि वीएनटीआर लोकस के लिए सभी एलील्स में पूर्ण दोहराने वाली इकाइयां नहीं हैं। गैर-आम सहमति एलील्स (माइक्रोविएंट्स) जिनमें अपूर्ण दोहराने वाली इकाइयां होती हैं, अधिकांश वीएनटीआर लोकी में आम हैं और उनके आकार पूर्ण दोहराने वाली इकाइयों के साथ एलील्स के आकार के बीच में आते हैं। ये माइक्रोवेरिएंट एगरॉर्ज्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा बमुश्किल पता लगाया जा सकता है। इसके विपरीत , पॉलीएक्रीलामाइड जैल या केशिका इलेक्ट्रोफोरेसिस जैसी तकनीकें उन एलील्स को हल कर सकती हैं जो एक से कुछ दोहराने वाली इकाइयों या माइक्रोवेरेंट्स12,23,24,25, 26से भिन्न होती हैं । हालांकि, बाद की तकनीकें स्नातक प्रयोगशाला कक्षाओं के लिए कम उपयुक्त हैं क्योंकि उनके पास खतरनाक यौगिकों के उपयोग, जटिल तैयारी और उपकरणों की कमी सहित कई नुकसान हैं। टुकड़ा आकार निर्धारण के लिए, माइग्रेट डीएनए टुकड़ों की दूरी को मापते समय विशेष सावधानी बरती जानी चाहिए। यदि बैंड भी ठीक मापा जा करने के लिए फैलाना कर रहे हैं, रैखिक प्रतिगमन द्वारा D1S80 allele टुकड़ा आकार की गणना गलत हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप दोहराने इकाई संख्या का गलत अनुमान है । उस मामले में जेल की स्थिति को अनुकूलित करने के बाद एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का फिर से संचालन लोरेंज और सह-कार्यकर्ताओं द्वारा पहले वर्णित22के रूप में उचित है।
पूरे D1S80 VNTR विश्लेषण प्रक्रिया यहां प्रस्तुत, बुक्कल एपिथेलियल सेल संचयन से टुकड़ा लंबाई मूल्यांकन करने के लिए, एक ही कार्य दिवस में पूरा किया जा सकता है । यह प्रोटोकॉल स्नातक व्यावहारिक प्रयोगशाला कक्षाओं के लिए उपयुक्त एक मजबूत, लागत कुशल और उपयोग में आसान विधि है।

आणविक फिंगरप्रिंटिंग, जिसे डीएनए फिंगरप्रिंटिंग भी कहा जाता है, को सर एलेक जेफरीज ने १९८४१में लीसेस्टर विश्वविद्यालय में जेनेटिक्स विभाग में काम करते हुए पेश किया था । यह मानव जीनोम के 0.1% पर आधारित है जो व्यक्तियों के बीच अलग है और इसमें लगभग तीन मिलियन वेरिएंट शामिल हैं। जीनोटाइप में ये अद्वितीय अंतर व्यक्तियों के बीच भेदभाव के लिए अनुमति देते हैं और इसलिए मोनोज़िगोटिक जुड़वां बच्चों को छोड़कर आनुवंशिक फिंगरप्रिंट के रूप में कार्य कर सकते हैं। नतीजतन, डीएनए फिंगरप्रिंटिंग का उपयोग विभिन्न व्यक्तियों की संबंधितता के अनुमान के लिए किया जाता है जो पितृत्व परीक्षण या जनसंख्या विविधता अध्ययन में उदाहरण के लिए लागू होता है। हमारी प्रयोगशाला कक्षाओं में हम डीएनए फिंगरप्रिंटिंग और एलील आवृत्तियों की अवधारणा को व्यक्त करने के उद्देश्य से । यहां वर्णित विधि D1S80 लोकस में टैंडेम रिपीट्स (VNTR) की चर संख्या का विश्लेषण करके आनुवंशिक फिंगरप्रिंटिंग के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत विधि को दर्शाती है। इस विधि में D1S80 लोकस को बढ़ाने के लिए बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं और बाद में पॉलीमरेज चेन रिएक्शन (पीसीआर) से डीएनए का निष्कर्षण शामिल है, जिसके बाद एक एगर उठे जेल पर टुकड़ा लंबाई अंतर का दृश्य है।
D1S80 VNTR minisatellite लोकस अत्यधिक चर है और गुणसूत्र 1 (1p36-p35) के टेलोमेरिक क्षेत्र में स्थित है। इसकी पहचान की गई थी और १९९० में करसाई और सहकर्मियों द्वारा 16 बीपी की एक कोर दोहराने इकाई के साथ एक लोकस के रूप में वर्णित किया गया था, जो सिर्फ एक इकाई2से भिन्न एलील्स के पृथक्करण के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, D1S80 लगभग 7.77 x 10-53की उत्परिवर्तन दर के साथ भिन्नता की एक उच्च डिग्री दिखाता है। D1S80 में उच्च स्तर की विषमता4,5 (उदाहरण के लिए, कोकेशियान 6 के लिए 80.8% विषमता और अफ्रीकी-अमेरिकियों के लिए 87% विषमता7)है। इसके अतिरिक्त, D1S80 लोकस अधिकांश आबादी में बहुरूपी है, आम तौर पर 15 से अधिक विभिन्न एलील्स 14 से 41 दोहराते हैं। D1S80 alleles की आवृत्ति आबादी के बीच भिन्न होती है। 24 रिपीट इकाइयों (एलील 24) के साथ एलील यूरोपीय और एशियाई आबादी में सबसे अधिक बार होता है, जबकि एलील 21 अफ्रीकीआबादी 4, 7,8,9,10में सबसे आम है। नतीजतन, एली फ्रीक्वेंसी वितरण विभिन्न मानव आबादी के लिए नैदानिक हैं और संबंधितता के अनुमान (उदाहरण के लिए, पितृत्व परीक्षणों में) के आकलन के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए। 
डी1एस80 वीएनटीआर लोकस का पीसीआर आधारित प्रवर्धन फोरेंसिक विज्ञान, पितृत्व परीक्षण, रोग विश्लेषण और जनसंख्या विविधता अध्ययन11,12, 13,14में एक बहुत ही उपयोगीतरीकारहा है । जबकि आज फोरेंसिक में वीएनटीआरएस के उपयोग को छोटे टैंडेम रिपीट्स द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है, D1S80 VNTR लोकस का व्यापक रूप से मूल और आनुवंशिक संबंधों के निर्धारण में उपयोग किया जाता है और आबादी के बीच4,8,9,11। इसके अलावा , इसका उपयोग अक्सर व्यावहारिक प्रयोगशाला कक्षा15,16में डीएनए फिंगरप्रिंटिंग सिखानेकेलिए किया जाता है । यहां वर्णित विधि स्नातक प्रयोगशाला कक्षाओं में बहुत अधिक सफलता दर के साथ एक मजबूत, लागत प्रभावी और उपयोग में आसान विधि का प्रतिनिधित्व करती है। इस लेख का उद्देश्य बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं से मानव D1S80 मिनीस्टेलाइट लोकस के आणविक विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह का अवलोकन प्रदान करना है। इसमें तकनीकों का प्रदर्शन, सरलीकृत प्रोटोकॉल और पहले प्रकाशित कार्यों में वर्णित व्यावहारिक सुझाव2,17शामिल हैं।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72,706</td>
			<td>autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microcentrifuge tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>7,26,95,500</td>
			<td>autoclaved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-propanol</td>
			<td>Fisher chemical</td>
			<td>PI7508/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5x PCR buffer</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td>A6283-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>BioBudget</td>
			<td>10-35-1020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buccal swabs</td>
			<td>BioBudget</td>
			<td>57-BS-05-600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>5430</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Combs</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs (10 mM)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>R0192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Honeywell</td>
			<td>32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel caster</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel chamber</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>SubCell GT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Doc XR+</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Geltray</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>SubCell GT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneRuler 50 bp DNA Ladder</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>SM0371</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Go-Taq Polymerase</td>
			<td>Promega</td>
			<td>M7845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heating block</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>1.5 mL and 2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Sharp</td>
			<td></td>
			<td>R-941STW</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peqGreen</td>
			<td>VWR</td>
			<td>&#160;732-3196&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettes</td>
			<td>Gilson</td>
			<td></td>
			<td>1000 &#181;L, 200 &#181;L, 20 &#181;L, 2 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium acetate</td>
			<td>Arcos Organics</td>
			<td>217100010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerPac power supply</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>100-120/220-240V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma/Merck</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Kern</td>
			<td></td>
			<td>PCB 2.5 kg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Arcos Organics</td>
			<td>218591000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA labortechnik</td>
			<td></td>
			<td>IKA RH basic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop centrifuge</td>
			<td>myFuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td></td>
			<td>C100 Touch</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>VWR</td>
			<td>103156x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>LMS</td>
			<td></td>
			<td>VTX-3000L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of dna fingerprinting using the d1s80 locus in lab classes

जैविक विज्ञान में, डीएनए फिंगरप्रिंटिंग व्यापक रूप से पितृत्व परीक्षण, फोरेंसिक अनुप्रयोगों और फिलोजेनेटिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है । यहां, हम स्नातक प्रयोगशाला कक्षाओं के संदर्भ में वेरिएबल नंबर ऑफ टैंडेम रिपीट (वीएनटीआर) विश्लेषण द्वारा जीनोटाइपिंग व्यक्तियों के लिए एक विश्वसनीय और मजबूत विधि का वर्णन करते हैं। मानव D1S80 VNTR लोकस दोहराव दृश्यों की संख्या में भिन्नता के आधार पर एक अत्यधिक बहुरूपी मार्कर के रूप में इस प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है।
यह सरल प्रोटोकॉल शिक्षकों के लिए उपयोगी जानकारी और व्यावहारिक प्रयोगशाला कक्षाओं में डीएनए फिंगरप्रिंटिंग के कार्यान्वयन को व्यक्त करता है । प्रस्तुत प्रयोगशाला अभ्यास में, पीसीआर प्रवर्धन के बाद डीएनए निष्कर्षण का उपयोग D1S80 VNTR लोकस में आनुवंशिक भिन्नता निर्धारित करने के लिए किया जाता है। पीसीआर उत्पादों के टुकड़े आकार में अंतर एगरल्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा कल्पना की जाती है। टुकड़ा आकार और दोहराने की संख्या एक डीएनए आकार मानक के आकार और प्रवास दूरी के एक रैखिक प्रतिगमन के आधार पर गणना कर रहे हैं ।
इस गाइड के बाद, छात्रों को सक्षम होना चाहिए:
• फसल और बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं से डीएनए निकालने • पीसीआर प्रयोग करें और विभिन्न प्रतिक्रिया घटकों के कार्य को समझें • एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा एम्प्लिकॉन का विश्लेषण करें और परिणामों की व्याख्या करें • डीएनए फिंगरप्रिंटिंग में वीएनटीआर के उपयोग और जैविक विज्ञान में इसके आवेदन को समझें

वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, D1S80 VNTR मार्कर विश्लेषण मानव जीनोमिक डीएनए पर किया गया था जो झाड़ू नमूने(चित्र 6)द्वारा काटा गया बुकल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं से निकाला गया था। पीसीआर का उपयोग करके प्रवर्धन के बाद, D1S80 एम्प्लिकॉन युक्त एक एगर उठे जेल का एक विशिष्ट प्रतिनिधित्व चित्र 1में दिखाया गया है। लेन 1 ५० बीपी आणविक वजन मानक से पता चलता है । आणविक वजन मानक के बगल में, आठ छात्र नमूनों से पीसीआर उत्पादों की कल्पना की जाती है। लेन 10 एनटीसी को दिखाता है जिसमें टेम्पलेट डीएनए के बजाय पानी का इस्तेमाल किया जाता था । विश्लेषण नमूनों के अधिकांश स्पष्ट रूप से दो बैंड प्रदर्शित करते हैं, D1S80 लोकस के लिए विषम व्यक्तियों का प्रतिनिधित्व करते हैं । लेन 2 और लेन 9 D1S80 लोकस के लिए होमोज़िगस व्यक्तियों का प्रतिनिधित्व करने वाला एक बैंड दिखाते हैं। लेन 5 एक अस्पष्ट एकल बैंड दिखा रहा है जो अन्य बैंड की तुलना में बहुत व्यापक है । यह केवल एक दोहराने इकाई में भिन्न दो D1S80 एलील्स का परिणाम हो सकता है। आगे के विश्लेषण के लिए, लेन 5 में नमूना एक एकल बैंड के रूप में माना जाएगा, एक homozygous व्यक्ति का प्रतिनिधित्व ।
सत्यापित पीसीआर उत्पादों पर किए गए डाउनस्ट्रीम जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस टुकड़ा विश्लेषण का उपयोग विभिन्न छात्र नमूनों के D1S80 वीएनटीआर लोकस के आकार कॉलिंग के लिए किया गया था। पीसीआर विश्लेषण द्वारा प्राप्त एम्प्लिकॉन आकारों की व्याख्या आणविक वजन मानक पर निर्भर करती है। आणविक वजन मानक के प्रत्येक बैंड के लिए अच्छी तरह से दूरी(चित्रा 1)मापा गया था और दर्ज(चित्रा 2)। आकार और प्रवास दूरी के आधार पर व्यक्तिगत बैंड के आकार की गणना रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण का उपयोग करके की जा सकती है। लॉग (आधार 10) छात्र नमूनों(चित्रा 5)में प्रत्येक बैंड के लिए निर्धारित किया गया था और संबंधित एंटीलॉग प्रत्येक एम्प्लिकॉन के लिए बीपी की संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । पुन: दोहराने वाली इकाइयों की संख्या की गणना प्राप्त एम्प्लिकॉन आकार(तालिका 2)के अनुसार की जा सकती है।
प्रत्येक छात्र के नमूने के लिए एम्प्लिकॉन आकारों की गणना रैखिक प्रतिगमन द्वारा की जाती थी और प्रत्येक बैंड को टेबल 2में दिखाए गए एक विशेष एलील को आसानी से सौंपा जा सकता था। D1S80 allele आकार पर जानकारी तो स्नातक छात्रों की छोटी आबादी सबसेट के बीच allele आवृत्तियों का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । 28-दोहराने एलील इस दोहराने एली (व्यक्तियों 1 और 4) के लिए दो होमोज़िगस व्यक्तियों के कारण छात्रों के बीच सबसे अधिक बार होता है। दूसरा सबसे बार एलील 18-दोहराने वाले एलील है, जो होमोज़िगस व्यक्तिगत 8 और विषम व्यक्ति 6 द्वारा किया जाता है। कम आवृत्ति एलील्स क्रमशः 6, 5 और 3 व्यक्तियों में केवल एक बार पाए जाने वाले 21-, 26 और 30-दोहराने वाले एलील्स हैं। छोटे छात्र आबादी के D1S80 VNTR लोकस के एलील फ्रीक्वेंसी पैटर्न की तुलना बड़ी मानव आबादी की एलील फ्रीक्वेंसी से की जा सकती है, उदाहरण के लिए विभिन्न महाद्वीपों4,7,8,9,10से निकलने वाली आबादी ।
छात्रों में, व्यक्तियों 2 और 3 शेयर 24-दोहराने allele, व्यक्तियों 2 और 7 शेयर 20 दोहराने allele और व्यक्तियों 5 और 7 शेयर 23-दोहराने allele । दिलचस्प बात यह है कि दो D1S80 होमोज़िगस व्यक्ति (व्यक्तिगत 1 और 4) 28-दोहराने वाले एलील को साझा करते हैं। दो व्यक्तियों के बीच मिलान एलील्स एक संभावित संबंधितता का संकेत कर सकते हैं। हालांकि, साझा एलील्स भी संयोग से हो सकते हैं। इस प्रकार, दो व्यक्तियों के बीच एक एलील मैच की संभावना निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। संभावना सामान्य आबादी में व्यक्तिगत एलील्स की एलील आवृत्ति पर निर्भर करती है और सांख्यिकीय दृष्टिकोणों को वीएनटीआर मार्कर विश्लेषण जैसे बायेसियन दृष्टिकोण के लिए सांख्यिकीय वजन संलग्न करने के लिए नियोजित किया जाना चाहिए। संक्षेप में, प्रस्तुत फिंगरप्रिंटिंग विधि डीएनए फिंगरप्रिंटिंग में VNTRs के उपयोग और जैविक विज्ञान में इसके आवेदन को पढ़ाने के लिए हाथ पर वर्ग व्यावहारिक में उपयोग किया जा सकता है ।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig01.jpg"> चित्रा 1:50 बीपी आणविक वजन मानक लेन के बगल में रखे एक शासक के साथ D1S80 प्रवर्धन उत्पादों के इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद एक एगरल्ड जेल का प्रतिनिधित्व। लेन 1 में 50 बीपी आणविक वजन मानक होता है, जबकि लेन 2-9 में पीसीआर रिएक्शन उत्पाद होते हैं। लेन 10 में नो टेम्पलेट कंट्रोल (एनटीसी) होता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig02.jpg"> चित्रा 2:डीएनए खंड प्रवास दूरी का निर्धारण और ५० बीपी आणविक वजन मानक के प्रत्येक टुकड़ा आकार के लॉग इन करें । 50 बीपी आणविक वजन मानक के प्रत्येक बैंड के लिए कुएं (सेमी में) से दूरी दर्ज की जाती है और प्रत्येक टुकड़े के लिए लॉग (आधार 10) निर्धारित किया जाता है। मानों स्प्रेडशीट प्रोग्राम का उपयोग करके तालिका में प्रवेश किया जाता है। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig03.jpg"> चित्रा 3:वाई-एक्सिस पर प्रत्येक टुकड़े के आकार के लॉग (आधार 10) के खिलाफ एक्स-एक्सिस पर आणविक वजन मानक की डीएनए खंड माइग्रेशन दूरी की साजिश रचने से उत्पन्न स्कैटर प्लॉट। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig03large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig04.jpg"> चित्र 4-रैखिक प्रतिगमन रेखा और प्रतिगमन समीकरण के साथ-साथ डेटा के लिए आर2 मूल्य का शोषण। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig04large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig05.jpg"> चित्रा 5: D1S80 एम्प्लिकॉन के आकार का निर्धारण। प्रत्येक टुकड़े के लिए कुएं से दूरी प्रतिगमन समीकरण में प्रवेश किया है। वाई-वैल्यू का एंटीलॉग बीपी में टुकड़े के आकार का प्रतिनिधित्व करता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig05large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62305/62305fig6v2.jpg"> चित्रा 6: D1S80 VNTR विश्लेषण के लिए सुझाए गए समय रेखा और कार्यप्रवाह। पूरे D1S80 VNTR विश्लेषण प्रक्रिया यहां प्रस्तुत, बुक्कल एपिथेलियल सेल संचयन से टुकड़ा लंबाई मूल्यांकन करने के लिए, एक ही कार्य दिवस के भीतर पूरा किया जा सकता है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62305/62305fig6v2large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>एलील आकार (बीपी में)</td>
			<td>दोहराने की संख्या</td>
		</tr>
<tr>
<td>369</td>
			<td>14</td>
		</tr>
<tr>
<td>385</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>401</td>
			<td>16</td>
		</tr>
<tr>
<td>417</td>
			<td>17</td>
		</tr>
<tr>
<td>433</td>
			<td>18</td>
		</tr>
<tr>
<td>449</td>
			<td>19</td>
		</tr>
<tr>
<td>465</td>
			<td>20</td>
		</tr>
<tr>
<td>481</td>
			<td>21</td>
		</tr>
<tr>
<td>497</td>
			<td>22</td>
		</tr>
<tr>
<td>513</td>
			<td>23</td>
		</tr>
<tr>
<td>529</td>
			<td>24</td>
		</tr>
<tr>
<td>545</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>561</td>
			<td>26</td>
		</tr>
<tr>
<td>577</td>
			<td>27</td>
		</tr>
<tr>
<td>593</td>
			<td>28</td>
		</tr>
<tr>
<td>609</td>
			<td>29</td>
		</tr>
<tr>
<td>625</td>
			<td>30</td>
		</tr>
<tr>
<td>641</td>
			<td>31</td>
		</tr>
<tr>
<td>657</td>
			<td>32</td>
		</tr>
<tr>
<td>673</td>
			<td>33</td>
		</tr>
<tr>
<td>689</td>
			<td>34</td>
		</tr>
<tr>
<td>705</td>
			<td>35</td>
		</tr>
<tr>
<td>721</td>
			<td>36</td>
		</tr>
<tr>
<td>737</td>
			<td>37</td>
		</tr>
<tr>
<td>753</td>
			<td>38</td>
		</tr>
<tr>
<td>769</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>785</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>801</td>
			<td>41</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: प्रत्येक D1S80 VNTR लोकस के लिए एम्प्लिकॉन आकार।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>व्यक्ति</td>
			<td>एलील</td>
			<td>दूरी (सेमी में)</td>
			<td>आकार (बीपी में)</td>
			<td>दोहराने इकाइयों की संख्या</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>समोसेदार</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>28</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>विषमता</td>
			<td>5.2 ; 5.5</td>
			<td>535, 458</td>
			<td>24, 20</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>विषमता</td>
			<td>4.9 ; 5.2</td>
			<td>626, 535</td>
			<td>30, 24</td>
		</tr>
<tr>
<td>4</td>
			<td>समोसेदार</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>28</td>
		</tr>
<tr>
<td>5</td>
			<td>विषमता</td>
			<td>5.1 ; 5.3</td>
			<td>564, 508</td>
			<td>26, 23</td>
		</tr>
<tr>
<td>6</td>
			<td>विषमता</td>
			<td>5.4 ; 5.6</td>
			<td>483, 435</td>
			<td>21, 18</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td>विषमता</td>
			<td>5.3 ; 5.5</td>
			<td>508, 458</td>
			<td>23, 20</td>
		</tr>
<tr>
<td>8</td>
			<td>समोसेदार</td>
			<td>5.6</td>
			<td>435</td>
			<td>18</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 2: विभिन्न व्यक्तियों की एलील संरचना का परीक्षण किया गया। रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा प्राप्त एम्प्लिकॉन आकार के अनुसार दोहराने वाली इकाइयों की संख्या का अनुमान लगाया जा सकता है।

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Application of DNA Fingerprinting using the D1S80 Locus in Lab Classes

यहां हम एपिथेलियल सेल डीएनए से वीएनटीआर लोकस D1S80 को बढ़ाना द्वारा डीएनए फिंगरप्रिंटिंग प्रोफाइल उत्पन्न करने के लिए एक सरल प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।

लैब कक्षाओं में D1S80 लोकस का उपयोग कर डीएनए फिंगरप्रिंटिंग का आवेदन

In biological sciences, DNA fingerprinting has been widely used for paternity testing, forensic applications and phylogenetic studies. Here, we describe a ...

डीएनए फिंगरप्रिंटिंग जैविक विज्ञान में एक आम उपकरण है और पितृत्व परीक्षण में लागू होता है, साथ ही फोरेंसिक या फिलोजेनेटिक अध्ययन भी। यह प्रोटोकॉल स्नातक छात्रों को प्रयोगशाला कक्षाओं में डीएनए फिंगरप्रिंटिंग के बुनियादी सिद्धांतों को प्रदान करने के लिए डिज़ाइन किया गया है । यह मानव D1S80 लोकस पर आधारित है, जो मिलकर दोहराता क्षेत्र की एक चर संख्या है, जो एलील्स व्यक्तियों के बीच लंबाई में भिन्न हो सकते हैं।डीएनए निष्कर्षण, पीसीआर, जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस, और बाद में विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए मुश्किल हो सकता है, खासकर अगर पहली बार के लिए किया । सभी चरणों का दृश्य प्रदर्शन दर्शकों को सामान्य अभ्यास, विवरण और सावधानियों का पालन करने की अनुमति देता है जो इस बहुत मजबूत प्रोटोकॉल को पूरा करते समय किए जाने चाहिए। बुक्कल म्यूकोसा एपिथेलियल कोशिकाओं से डीएनए निकालने के लिए, एक बाँझ मौखिक झाड़ू का उपयोग करके कोशिकाओं की कटाई से शुरू करें।30 से 40 सेकंड के लिए गाल के अंदर पर सख्ती से रगड़ने के लिए झाड़ू का इस्तेमाल करें। संग्रह की नोक को लेबल बाँझ माइक्रो-अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें और प्लास्टिक की लंबाई को तोड़ दें जो किनारे से परे फैली हुई है, और ट्यूब को बंद कर देती है। 65 डिग्री सेल्सियस तक एक हीटिंग ब्लॉक को पहले से गरम करें और सभी आवश्यक बफ़र्स और समाधान तैयार करें।झाड़ू में lyse समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़ें, सुनिश्चित करें कि नमूना पूरी तरह से lyse समाधान में डूब गया है और कम से कम पांच सेकंड के लिए नमूना भंवर। 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस और भंवर कभी-कभी पर नमूने को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, एक अधिकतम नमूना मात्रा प्राप्त करने के लिए ट्यूब की दीवार के खिलाफ दबाकर झाड़ू हटा दें।कोशिकाओं को lyse करने के लिए 100 माइक्रोलीटर डेनैचेशन बफर जोड़ें और ट्यूब को उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं जब तक कि सफेद तेज़ दिखाई न दे। कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट, तो 17, ९५० जी हस्तांतरण ४५० सुपरनेट के माइक्रोलीटर एक साफ, १.५ मिलीलीटर माइक्रो अपकेंद्रित्र ट्यूब में पांच मिनट के लिए नमूना अपकेंद्रित्र । फिर आईएसओ 2-प्रोपनॉल के 450 माइक्रोलीटर जोड़ें और डीएनए को उपजी करने के लिए ट्यूब को उलटा करके अच्छी तरह से मिलाएं।कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए इनक्यूबेट और पांच मिनट के लिए अपकेंद्रित्र । सुपरनेट को त्यागें और ट्यूब को एक साफ पेपर तौलिया पर उलटा करें और गोली को सुखा लें। डीएनए को 70% इथेनॉल के 500 माइक्रोलीटर से धोएं, शीघ्र ही एक मिनट के लिए अपकेंद्रित्र करें, और सुपरनेट को त्यागें।गोली को पूरी तरह से सुखाने के लिए, एक हीटिंग ब्लॉक में ६५ डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए नमूना इनक्यूबेट । अंत में, डीएनए सिस को निष्क्रिय करने के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए एल्यूशन बफर और इनक्यूबेट के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें। माइक्रो-सेंट्रलाइज ट्यूब में ग्रीन पीसीआर बफर, डीएनटीपीएस, प्राइमर, वॉटर और पॉलीमरेज डालकर मास्टर मिक्स तैयार करें।पीसीआर ट्यूब को सैंपल नंबर और एलिकोट 45 माइक्रोलीटर पीसीआर मास्टर मिक्स के साथ प्रत्येक पीसीआर ट्यूब पर लेबल करें। इसके बाद, पांच माइक्रोलिटर डीएनए जोड़ें, या, नो-टेम्पलेट कंट्रोल के लिए, पानी जोड़ें। पीसीआर ट्यूब बंद करें और उन्हें संक्षेप में सेंट्रलाइज करें।ट्यूबों को थर्मल साइकिलर में रखें और पीसीआर प्रोग्राम शुरू करें। जब कार्यक्रम पूरा हो जाता है, तो नमूनों को आगे की प्रक्रिया तक चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। 1 1/2 ग्राम एगर उठे पाउडर का वजन करके और इसे एक बोतल में टीएई बफर समाधान के 100 मिलीलीटर के साथ मिलाकर 1.5% एगर उठे जेल तैयार करें।एक माइक्रोवेव में एगर उठे मिश्रण को सावधानी से गर्म करें और मिश्रण को बीच में तब तक घूमता है जब तक कि एगर उठी पूरी तरह से भंग न हो जाए। ध्यान रखें कि उबलते देरी हो सकती है। एगर उठे मिश्रण के थोड़े ठंडा होने के बाद, पीईसी ग्रीन के दो माइक्रोलीटर जोड़ें।जेल डालो और नमूनों के लिए पर्याप्त कुओं के साथ एक कंघी का उपयोग करें। एगर उठे जेल के पूर्ण बहुलीकरण के बाद, प्रत्येक पीसीआर नमूनों के 10 माइक्रोलीटर के साथ कुओं को लोड करें और फ्लैंकिंग कुओं में आणविक वजन मानक जोड़ें। लगभग 40 मिनट के लिए 150 वोल्ट पर जेल चलाएं।पीसीआर उत्पादों की कल्पना करने के लिए, पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करके जेल की छवि करें। प्रवर्धित D1S80 alleles के विश्लेषण के लिए, तस्वीर जेल छवि पर कुओं में शुरू आणविक वजन मानक के बगल में एक शासक जगह है। वजन मानक के प्रत्येक बैंड के लिए दूरी को मापने और एक मेज गणना कार्यक्रम में लंबाई रिकॉर्ड।इसके बाद, वजन मानक के प्रत्येक टुकड़े के आकार के लॉगरिथ्म का निर्धारण करें। लॉग-ट्रांसफॉर्म, वजन-मानक टुकड़े के आकार और अपने जेल से मापी गई दूरी का उपयोग करके एक स्कैटरप्लॉट डालें। एक ट्रेंड लाइन फिट करें और प्रतिगमन समीकरण और आर-स्क्वायर मूल्य प्रदर्शित करें।एक नई मेज में, पीसीआर एम्प्लिकॉन से कुओं तक की दूरी के उपाय डालें। इन एम्प्लिकॉन के आकार को निर्धारित करने के लिए, रैखिक प्रतिगमन से प्रतिगमन समीकरण का उपयोग करें और एम्प्लिक्लोन से आधार जोड़े में टुकड़ा आकार प्राप्त करने के लिए एंटीलॉग की गणना करें। अंत में प्रत्येक मापा एम्प्लिकॉन को 16 आधार जोड़े की दोहराने इकाइयों को आवंटित करें।डीएनए और D1S80 लोकस के प्रवर्धन के निष्कर्षण सभी अध्ययन व्यक्तियों के लिए सफल रहा था, और लेन 10 में कोई टेम्पलेट नियंत्रण किसी भी amplicons नहीं दिखा था । टुकड़ा लंबाई विश्लेषण से, व्यक्तियों को दो एलील्स के साथ होमोज़िगस या विषम होने में वर्गीकृत किया गया था। मिलकर दोहराने की इकाइयों की संख्या स्पष्ट रूप से सापेक्ष था, और अब आगे के विश्लेषण के लिए सेवा कर सकते हैं ।यहां हम स्नातक व्यावहारिक कक्षाओं में आणविक फिंगरप्रिंटिंग को लागू करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी विधि का वर्णन करते हैं । पूरी प्रक्रिया एक ही कार्यदिवस के भीतर पूरी की जा सकती है, और इसमें चार अलग-अलग चरण शामिल हैं। पहले चरण में डीएनए टेम्पलेट तैयार किया जाता है।बुक्कल एपिथेलियल कोशिकाओं को झाड़ू के नमूने द्वारा काटा जाता है। मौखिक झाड़ू डीएनए निष्कर्षण के लिए कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता प्रदान करने के लिए एक विश्वसनीय उपकरण हैं। इसके अलावा, डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग नहीं करता है, जो स्नातक प्रयोगशाला कक्षाओं में लाभप्रद है।चरण एक 90 मिनट या उससे कम समय में पूरा किया जा सकता है। दूसरे चरण में, D1S80 लोकस पीसीआर द्वारा परिलक्षित होता है। डीएनए टेम्पलेट की खराब गुणवत्ता के मामले में भी यहां प्रस्तुत पीसीआर की स्थिति मजबूत है ।यह स्टेप 2 1/2 घंटे में पूरा किया जा सकता है। इसके बाद पीसीआर उत्पादों का विश्लेषण एगरबिंग जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा किया जाता है। एगर उठे जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस के अन्य तकनीकों की तुलना में कई फायदे हैं, जैसे खतरनाक घटकों से बचना और एक सरल तैयारी तकनीक।यह विश्लेषण 90 मिनट में पूरा किया जा सकता है। इलेक्ट्रोफोरेसिस के बाद, खंड की लंबाई के परिणामों का विश्लेषण रैखिक प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा 90 मिनट के भीतर किया जा सकता है, या तो टेबल गणना कार्यक्रम का उपयोग करके, या एक साधारण कैलकुलेटर का उपयोग करके किया जाता है। संक्षेप में, प्रस्तुत फिंगरप्रिंटिंग विधि हाथ में उपयोग किया जा सकता है व्यावहारिक आणविक मार्कर के उपयोग और जैविक विज्ञान में इसके आवेदन सिखाने के लिए ।

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Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

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डीएनए प्रतिकृति एक Vivo में मॉडल प्रणाली के रूप में Zebrafish का उपयोग समय की रूपरेखा

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Mitochondrial डीएनए मिथाइल का सटीक पता लगाने के लिए क्रियाविधि

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

Identification of Homologous Recombination Events in Mouse Embryonic Stem Cells Using Southern Blotting and Polymerase Chain Reaction

माउस भ्रूण में मुताबिक़ पुनर्संयोजन की घटनाओं की पहचान स्टेम दक्षिणी सोख्ता और पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया का उपयोग कोशिकाओं

Relative to the issues of off-target effects and the difficulty of inserting a long DNA fragment in the application of designer nucleases for genome ...

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

Determining the Egg Fertilization Rate of Bemisia tabaci Using a Cytogenetic Technique

एक कोशिका आनुवंशिक तकनीक का उपयोग कर बेमिसिया टैबची के अंडे निषेचन दर का निर्धारण

A few species of sap-sucking whiteflies are some of the most damaging terrestrial pests worldwide because of the crop damage they inflict and plant ...

In vivo Application of the REMOTE-control System for the Manipulation of Endogenous Gene Expression

अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति के हेरफेर के लिए दूरस्थ नियंत्रण प्रणाली के vivo आवेदन में

Here we describe a protocol for implementing the REMOTE-control system (Reversible Manipulation of Transcription at Endogenous loci), which allows for ...