Name: a sample preparation pipeline for microcrystals at the vmxm beamline
Uploaded: 2021-06-17T13:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline at JoVE.com

ويود المؤلفون أن يشكروا جيريمي كيون وجون غرايمز وجيف ساتون وديف ستيوارت وجامعة ستروبي في أكسفورد وراشيل بولتون من جامعة ساوثهامبتون على التكرم بتقديم عينات من البلورات الدقيقة لتطوير وعروض طرق إعداد العينات لشعاع VMXm بالإضافة إلى تمكين التكليف بخط الحزم. كما يود المؤلفون أن يشكروا iNEXT-Discovery (رقم المشروع 871037) على الفرصة والدعم في نشر هذه المخطوطة.

<ol>
	<li>Laundy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multi-lane+X-ray+mirror+providing+variable+beam+sizes.">Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+conditions+for+biological+macromolecules.">Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).</li><li>Holton, J. M., Frankel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+crystal+size+needed+for+a+complete+diffraction+data+set.">The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set.</a> Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).</li><li>Garman, E. F., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryocooling+and+radiation+damage+in+macromolecular+crystallography.">Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).</li><li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+indexing+multi-lattice+diffraction+data.">New methods for indexing multi-lattice diffraction data.</a> Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).</li><li>Chapman, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-Ray+Free-Electron+Lasers+for+the+Structure+and+Dynamics+of+Macromolecules.">X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).</li><li>Beale, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+sample+preparation+for+serial+crystallography+experiments.">Successful sample preparation for serial crystallography experiments.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).</li><li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-crystallography+comes+of+age.">Micro-crystallography comes of age.</a> Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).</li><li>Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+synchrotron+radiation+instrumentation+for+MX+experiments.">Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).</li><li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), 496 (2019).</li><li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin.">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyhedra+structures+and+the+evolution+of+the+insect+viruses.">Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses.</a> Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).</li><li>Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The design of macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).</li><li>. MiTeGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.mitegen.com/product/micromeshes/">https://www.mitegen.com/product/micromeshes/</a> (2020)</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+manipulation+and+data+assembly+for+robust+microcrystal+synchrotron+crystallography.">Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography.</a> IUCrJ. 5, 238-246 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+the+lipid+cubic+phase+or+in+mesomethod+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+and+complexes.">A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).</li><li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology.">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li><li>Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+methodology+and+development.">MicroED methodology and development.</a> Structural Dynamics. , 1-8 (2020).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cryogen+for+plunge+freezing.">An improved cryogen for plunge freezing.</a> Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).</li><li>Garman, E. F., Schneider, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Cryocrystallography.">Macromolecular Cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).</li><li>Pflugrath, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+macromolecular+cryocrystallography.">Practical macromolecular cryocrystallography.</a> Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).</li><li>Alcorn, T., Juers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+rational+methods+of+cryoprotection+in+macromolecular+crystallography.">Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+improvements+in+order+and+diffraction+limit+of+crystals+of+bovine+mitochondrial+F(1)-ATPase+by+controlled+dehydration.">Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration.</a> Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).</li><li>Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cryocooling+of+naked+crystals:+are+cryoprotection+agents+always+necessary.">Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary.</a> Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).</li><li>Beale, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+as+a+method+for+sample+visualization+in+protein+X-ray+crystallography.">Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography.</a> IUCrJ. , 1-9 (2020).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Global+and+Site-Specific+Radiation+Damage+in+Cryo-EM.">Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM.</a> Structure. 26 (5), 759-766 (2018).</li><li>Sanchez-Weatherby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diffraction+by+humidity+control:+a+novel+device+compatible+with+X-ray+beamlines.">Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines.</a> Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).</li><li>Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through-grid+wicking+enables+high-speed+cryoEM+specimen+preparation.">Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Determination+from+Lipidic+Cubic+Phase+Embedded+Microcrystals+by+MicroED.">Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED.</a> Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).</li><li>Polovinkin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+electron+diffraction+from+membrane+protein+crystals+grown+in+a+lipidic+mesophase+after+lamella+preparation+by+focused+ion+beam+milling+at+cryogenic+temperatures.">Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).</li><li>Storm, S. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy-dependent+photoelectron+escape+in+microcrystals.">Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals.</a> IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).</li></ol>

لا تضارب في المصالح للإعلان.

يوضح هذا البروتوكول كيف يمكن استخدام أدوات إعداد عينة cryoTEM لإعداد البلورات الدقيقة لتجارب حيود الأشعة السينية في خطوط الحزم البؤرية الدقيقة. وتتركز الأجهزة الحزمة القياسية حول عينة مثبتة دبوس وبينما بذلت جهود لتوفير دعم عينة على هذه يتصاعد للبلورات الدقيقة، فإنها غالبا ما تكون صعبة لتحميل مع عينة مع ضمان أن يتم تحقيق أعلى إشارة إلى الضوضاء(الشكل 1C، D). قد تتطلب العديد من هذه العينات أيضا تحسين ظروف الحماية من التبريد لضمان أن تكون العينة ذات حيوية. طريقة تجميد يغرق يوفر طريقة قابلة للتكرار لإزالة السائل الزائد وفلاش تبريد العينة في cryogen كفاءة (الشكل 1A, B). في حين يمكن بعد ذلك تركيب الشبكة على خط شعاعي قياسي مع جبل دبوس قائم على ملاقط ، فقد تم تصميم حاملي عينات VMXm خصيصا لقبول الشبكات والاحتفاظ بها تحت درجة حرارة انتقال الزجاج في بيئة فراغ عبر التبريد التوصيلي. تتيح بيئة العينة في VMXm جمع بيانات الخلفية المنخفضة ، حيث تكون العينة هي المصدر المتبقي للخلفية ، وتوفر ميكروبا يمكن استخدامه لمطابقة البلورات ذات الأبعاد الأقل من 10 ميكرومتر. يمكن أيضا استخدام طريقة إعداد العينة هذه لإعداد البلورات النانوية للانعراج الإلكتروني حيث يوجد أيضا شرط لسائل فائض قليل جدا وعينة حيوى بسبب ضعف اختراق الإلكترونات. في حين أن شبكات cryoTEM هشة ، فإن تلك التي شهدت في حصاد البلورات في الحلقات سوف تتكيف بسرعة مع التعامل مع الشبكات. مع كمية صغيرة من الخبرة، سيتم فقدان شبكات قليلة خلال مراحل النشاف والتجميد والتحميل من البروتوكول. خطوات التحسين، ومع ذلك، حاسمة لهذا النجاح وإعداد دقيق سوف يقلل من فرص فقدان بلورات أو الحد من سلامة الكريستال.
توفر شبكات CryoTEM جبلا واحدا كبيرا نسبيا يمكن أن يحتوي على مئات البلورات ، وبالتالي تحسين الإنتاجية حيث قد يكون من الممكن فقط تسجيل إسفين صغير من بيانات الحيود. شبكة واحدة قد توفر أيضا ما يكفي من بلورات لتحديد بنية البروتين، لا سيما في بلورات من التماثل العالي. حيث واحد فقط أو اثنين من قطرات تبلور واحد قد ولدت microcrystals، النشاف المحاكمة من حالة التبلور وحدها يمكن أن تساعد على ضمان أنه عندما يتم مسح البلورات الدقيقة، والأوقات المستخدمة هي أقرب ما يمكن لتلك اللازمة لتوليد عينات ذات نوعية جيدة الأولية. تدعم أفلام الكربون غير مرئية للأشعة السينية وتتوفر مع تباعد الثقوب المختلفة ، والتي يمكن استخدامها لتناسب مورفولوجيا معينة. نحن الأكثر شيوعا الاستفادة من أفلام الدعم مع ثقوب 2 ميكرومتر في تباعد 2 ميكرومتر، ولكن ثقوب أصغر مع تباعد أكبر قد تكون أكثر ملاءمة للبلورات أصغر من 2 ميكرومتر. تتوفر أفلام دعم أخرى مثل تلك التي بها ثقوب 1 ميكرومتر مع تباعد 4 ميكرومتر بالإضافة إلى أفلام الدعم ذات الثقوب المختلفة الشكل ، وكلها ستؤثر على وقت النشاف. شبكة مربعة حجم شبكة من 200 (200 مربع لكل بوصة) كما يوفر مساحة كافية (~ 100 ميكرومتر) بين قضبان شبكة النحاس بحيث شعاع الأشعة السينية لا تتفاعل بقوة مع النحاس في حين توفير الدعم الهيكلي الكافي لفيلم الكربون محملة بلورات. استخدام الإيثان السائل ينفي الحاجة إلى المبردات، مما يقلل بدوره من المتطلبات على حجم العينة التي كانت ستستخدم في تحسين ظروف البروتين المبرد.
المعلمات الرئيسية التي سيتم تحسينها أثناء العملية هي أوقات النشاف وتخفيف العينة. يجب أن تكون أوقات النشاف طويلة بما يكفي لمراقبة تأثير "الظهور" عبر الشبكة بأكملها قبل الهبوط في التجمد. يمكن أن يؤدي النشاف الزائد إلى جفاف البلورات ، ومع ذلك ، يتم استخدام التحكم في الرطوبة داخل غرفة العينة لتقليل هذا التأثير. في حين يقترح أن الرطوبة النسبية من 90٪ المستخدمة، قد تستفيد بعض العينات في الاستفادة الأمثل من الرطوبة. قد تؤثر الرطوبة على كفاءة النشاف لورق النشاف الذي يمكن أن يصبح مشبعا بالماء ببطء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التحكم في الرطوبة داخل غرفة العينة لتحسين جودة الحيود من بلورات30. من المستحسن إجراء تغييرات صغيرة (<5٪ في الرطوبة قبل التحقق من سلامة الحيود لضمان عدم تدهور جودة الحيود.
يمكن إجراء تحسين العينات غير الثمينة باستخدام مجهر خفيف بدلا من SEM. على الرغم من أنها مدمرة ، فمن المفيد لتقييم كثافة البلورات عبر الشبكة وتمكين اتخاذ القرار بشأن ما إذا كان ينبغي تخفيف العينة أو تركيزها لتفريق بلورات بشكل أفضل عبر الشبكة. هذه الخطوة هي الأكثر فائدة عندما يكون هناك عدد كبير من بلورات المتاحة وخاصة العينات عالية التركيز. يجب تجنب تجميع بلورات معا(الشكل 3)،كما في حين أنها ليست مشكلة كبيرة إذا كانت بلورتين مضيئة في نفس الوقت أثناء جمع البيانات6،سيكون هناك على الأرجح حجم أكبر من السائل المحيطة كتلة، وبالتالي تقليل إشارة إلى الضوضاء (الشكل 5). في حين أنه من الممكن مراقبة تجاوزات كبيرة من السائل على الصعيد العالمي عبر الشبكة باستخدام المجهر الخفيف ، لا يمكن إجراء تقييم لحجم السائل المحيط بالبلورات الدقيقة ووجود الجليد البلوري إلا باستخدام المجهر الإلكتروني المزود بنظام نقل فراغ المبردة والمرحلة. في بعض الأحيان، بعد تطبيق بلورات على الشبكة وقبل أن يحدث النشاف، بلورات في حلول اللزوجة منخفضة قد يستقر على طول حافة واحدة من الشبكة. لقد وجدنا أن إضافة ما يصل إلى تركيز نهائي بنسبة 50٪ من جلايكول الإيثيلين يمكن أن يبطئ حركة البلورات من خلال القطيرات ، مما يضمن توزيعا أفضل للبلورات الدقيقة عبر الشبكة بالإضافة إلى توفير تحكم أكبر في النشاف عن طريق زيادة وقت النشاف(الشكل 3D).
يمكن أن تكون بعض حلول التبلور التي تحتوي على عوامل لزجة مثل PEGs عالية الوزن الجزيئي صعبة لللطخة ، مما يتطلب أوقات النشا طويلة بشكل متزايد (>10 s). في مثل هذه الحالات، يمكن أن يكون من المفيد تقليل حجم السائل المودع على الجزء الخلفي من الشبكة، فضلا عن حجم الكريستال التي تحتوي على حل إلى جانب دعم الفيلم من الشبكة. استراتيجيات مثل استخدام 2 طبقات من الورق النشاف أو الألياف الزجاجية قد تساعد أيضا النشاف في هذه الحالات الصعبة31.
في حين أن خط الأنابيب هذا مناسب لبلورات البروتين القابلة للذوبان ، فإن تلك التي تتشكل في وسائل لزجة للغاية مثل بروتينات الأغشية في LCP تمثل تحديا مختلفا لا يناسبه هذا البروتوكول. ومع ذلك، تظهر استراتيجيات لإعداد بلورات LCP على شبكات cryoTEM للميكروED والتي تشمل الحد من لزوجة العينات عن طريق إحداث تغيير مرحلي في LCP. يسمح هذا العينات ليتم تطبيقها على شبكات بطريقة مشابهة لتلك الموضحة في هذه المقالة. وأخيرا، يمكن طحن العينة مع شعاع أيون مركزة لإزالة المواد الزائدة غير الكريستال32،33،34.
وعموما، فإن خط الأنابيب هذا يستغرق عموما 1-2 ساعة (بما في ذلك وقت إعداد المعدات) لمتابعة من العينة التي تصل إلى VMXm لتوفير الشبكات الأمثل مع عينات مشتتة جيدا، وvitrified، اعتمادا على توافر العينة، وتركيز بلورات و لزوجة الحل تبلور. وقد استخدمت هذه الأساليب بالفعل بنجاح لإعداد البلورات الدقيقة لتجارب الحيود بالأشعة السينية استكشاف الأضرار الإشعاعية على البلورات الدقيقة حيث كان الحد الأدنى من حجم السائل المحيطة العينة الأساسية28،35. وتجدر الإشارة إلى أن البروتوكول يمكن تطبيقه على جميع عينات البلورات الدقيقة القابلة للذوبان، وليس فقط على عينات منتشرة جيدا التي تم تحسينها بالفعل. تجربة التبلور التي تنتج المواد microcrystalline تقليديا أن يكون هدفا للتحسين بهدف الحصول على بلورات أكبر، ومع ذلك، فإن هذه الطريقة إعداد العينة وقدرات VMXm قد تسمح بجمع البيانات الكافية من هذه العينات دون مزيد من التحسين. بدلا من ذلك، إذا كانت هذه العينات microcrystalline diffract سيئة، والبيانات التي تم جمعها من VMXm باستخدام هذه الطريقة إعداد العينة لا يزال يمكن أن تكون بمثابة دليل مفيد لمزيد من التحسين من ظروف التبلور. أدوات لإعداد الشبكات، بما في ذلك تفريغ توهج وتجميد يغرق متاحة الآن على نطاق واسع في معاهد البحوث مجهزة لتجارب cryoTEM وسوف تكون متاحة لكثير من المستخدمين تمكينهم من إعداد عينات قبل وقت الحزم في VMXm.

يبقى الحاجز الرئيسي لتحديد الهياكل عالية الدقة للجزيئات البيولوجية بواسطة علم البلورات الجزيئية الكلية (MX) هو إنتاج بلورات منتشرة بشكل جيد بحجم قابل. هناك العديد من الاستراتيجيات لتحقيق هذا الهدف من بناء الجينات البروتين المؤتلف تصميم من خلال البحث مصفوفة متناثرة كبيرة عن الكوكتيلات الكيميائية التي قد تولد بلوراتالأولية 2. بالنسبة لهذا الأخير ، غالبا ما يكون الحال أن البلور سوف تحتاج إلى تحسين أي يضرب الأولية للحصول على بلورات مع جودة الحيود كافية وحجم لدراسات تحديد الهيكل3. على الرغم من هذه الخيارات، قد لا تولد بعض الجزيئات المستهدفة أبدا بلورات كبيرة (>10 ميكرومتر)، وبلورات منتشرة جيدا، ونتيجة لذلك يجب على عالم البلورات المثابرة مع البلورات الدقيقة والتحديات التي تمثلها هذه العينات. وتشمل هذه التركيب المناسب وحماية البلورات، وإدارة الحيود الأضعف بطبيعته وزيادة حساسية الإشعاع. تتشكل البلورات الدقيقة من خلايا وجزيئات أقل من البلورات الكبيرة ، وعلى هذا النحو ، لا يتم تضخيم الحيود بنفس القدر مقارنة بالبلورات الأكبر ، مما يؤدي إلى كثافة حيود أضعف بطبيعتها. من المهم أن إشارة الخلفية لا يخفي هذه الانعكاسات، لا سيما في دقة أعلى حيث يمكن أن تضيع كثافة انعكاس ضعيفة4. بالإضافة إلى ذلك ، فإن البلورات الدقيقة أكثر حساسية للتلف الإشعاعي وعلى الرغم من تسجيل الحيود في درجات حرارة النيتروجين السائل5، فقد لا يكون من الممكن جمع بيانات كاملة من بلورة واحدة ، مما يجعل من الضروري جمع البيانات من عدد كبير جدا من البلورات لإنتاج مجموعة بيانات كاملة واحدة6.
وقد وفرت زيادة توافر أشعة الليزر الإلكترونية الحرة بالأشعة السينية (XFELs) وتطور أساليب البلورات التسلسلية (SFX)7 طرقا لجمع البيانات من البلورات الدقيقة الأصغر. ومع ذلك ، هذه هي طرق تسليم العينات حسب الطلب ، والتي تتطلب قدرا كبيرا من الخبرة في الأجهزة والبرامج ، حيث تقتصر التجارب على درجة حرارة الغرفة وعادة ما يكون استهلاك العينة مرتفعا (مئات الميكرويتر) ولا يزال قد يتطلب المزيد من التحسين8. على هذا النحو، المشاريع التي يمكن أن تكون فيها كمية محدودة فقط من البلورات الدقيقة غير مناسبة لSFX.
وفي الوقت نفسه، تقدمت تكنولوجيا خط الحزم السنكروترون على مدى العقود الأخيرة لإنتاج أصغر وأكثر استقرارا الحزم9 مع تألق التي سمحت لجمع البيانات من بلورات أصغر من أي وقتمضى 10،11. وقد تمكنت خطوط الحزم Microfocus مثل FMX في NSLS-II و I24 في Diamond Light Source من تحديد هياكل جديدة من بلورات ذات أبعاد قصوى تبلغ ~ 3 ميكرومتر12 وإظهار القدرة على جمع البيانات القابلة للاستخدام من بلورات أصغر قياس ~ 1 ميكرومتر13. يجب تكوين خط الحزم بدقة ، مع بصريات ممتازة وعالية الدقة على المحور ، ومجال أدنى من الارتباك لدوران العينة ومحور دوران متوائم بدقة يتزامن مع شعاع الأشعة السينية. من المهم أن تتطابق عن كثب مع ملف شعاع الأشعة السينية إلى حجم الكريستال وضمان محاذاة الكريستال بدقة في شعاع الأشعة السينية - وهو تحد للبلورات <5 ميكرومتر14. تلبية هذه الشروط التجريبية في خط الحزم ضروري لتسجيل أفضل البيانات جودة من البلورات الدقيقة.
الجانب المتبقي وربما الأكثر أهمية لجمع البيانات من البلورات الدقيقة هو عرض الكريستال على شعاع الأشعة السينية. وغالبا ما شنت Microcrystals على يتصاعد عينة ميكروميش، المصنعة من البوليميد، وانخفاض المواد التشتت الأشعة السينية مع فتحات صغيرة مثل 10 ميكرومتر15،16. يتم تركيب شبكة البوليميد على دبوس قياسي يتم تعيينه في قاعدة العمود الفقري المغناطيسي ، مما يجعله متوافقا مع معظم خطوط شعاع MX17. يتم استخدام جبل شبكة لصيد بلورات من قطرة تبلور غالبا ما تتبع نفس الإجراء كما تصاعد الكريستال 100 ميكرومتر باستخدام جبل نمط حلقة القياسية. في حين أن بلورات يمكن توزيعها عبر شبكة، عيب رئيسي هو أن حجم كبير نسبيا من السائل يمكن أن يتم بواسطة شبكة ودبوس أثناء الحصاد(الشكل 1C،D). هذا الحجم من السائل، التي يمكن أن تكون أكبر عدة مرات من البلورات نفسها، وسوف تسهم في الضوضاء الخلفية عندما تضيء مع الأشعة السينية. يمكن أن يكون هذا التشتت الخلفية أقوى إذا شكل السائل الجليد البلوري أثناء التبريد فلاش، مما يقلل من نسبة الإشارة إلى الضوضاء من كثافة ضعيفة بالفعل داخل قرارات الحيود الجليد. لذلك، من المهم إزالة السائل الزائد من العينة، لضمان إمكانية تسجيل جميع الإشارات الممكنة. هذا التحدي هو أكبر في حالة بلورات البروتين الغشاء تشكلت داخل مرحلة مكعب الدهون (LCP)، حيث يولد LCP مبعثر خلفية قوية وأيضا من الصعب إزالتها من جميع أنحاء بلورات 18.
يوفر خط الحزمة الجديد متعدد الجزيئات البلورية البلورية (VMXm) في Diamond Light Source الظروف التي يمكن من خلالها جمع البيانات من بلورات يحتمل أن يكون حجمها أقل من ميكرون. وقد تم تصميم خط الحزم لتقديم صورة شعاع قياس 0.3 ميكرومتر × 0.5 ميكرومتر (VxH)1، وهو مقياس ال غونيمتر مع مجال من الارتباك لا يزيد عن 60 نانومتر وفي بيئة عينة vacuo. هذه الميزات تصميم محطة نهاية VMXm تقليل توليد الخلفية الأشعة السينية الضوضاء من قبل جهاز الحزمة أثناء جمع البيانات مع أكبر مصدر المتبقية من الخلفية التي تم إنشاؤها بواسطة العينة14.
وتتيح أساليب إعداد العينة المحددة المصممة لشعاع VMXm فرصة للحد من هذه الخلفية وزيادة تحسين الإشارة إلى الضوضاء لبيانات الحيود، مما يزيد من جودة البيانات التي يمكن تسجيلها من البلورات الدقيقة التي تبلغ قوتها <10 ميكرومتر. العديد من المتطلبات المبينة هنا للانعراج منخفض الخلفية من البلورات الدقيقة شائعة أيضا في المجهر الإلكتروني الإرسال المبرد (cryoTEM)19 والكفر الإلكتروني microcrystal (microED)20. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الأدوات التي تم تطويرها بالفعل لإعداد عينات cryoTEM مناسبة، مع بعض التعديلات، لإعداد البلورات الدقيقة. في إعداد عينات لكريوتيم الجسيمات واحد، يتم تضمين الجسيمات قيد التحقيق في طبقات رقيقة جدا (عادة <100 نانومتر) من الجليد الزجاجي بحيث الإلكترونات قادرة على نقل من خلال العينة. ويتحقق طبقة موحدة رقيقة عن طريق النشاف بعيدا السائل الزائد ويتحقق التزجيج من العينة عن طريق التبريد السريع للعينة (~ 104 K ق-1)21 من خلال الغطس في الإيثان السائل الذي عقد في ~ 93 K22. في المقابل، النيتروجين السائل، كما تستخدم بشكل روتيني لإعداد عينة MX، هو cryogen أقل كفاءة من الإيثان ولديه ميل أكبر لتشكيل الجليد البلوري داخل العينة21. تشكيل الجليد البلوري ، الذي يمكن أن يتحلل الحيود وتوليد الضوضاء الخلفية ، وعادة ما يتم تخفيفها من خلال استخدام المركبات المبردة23. يمكن إضافة البوليمرات منخفضة الوزن الجزيئي مثل بولي إيثيلين غليكول (PEG) 400 وميثيل-2,4-pentanediol (MPD) والسكريات والزيوت أو الأملاح المشبعة إلى محلول التبلور في تركيزات منخفضة24- لا يوجد حل "مقاس واحد يناسب الجميع" لاختيار أكثر المبردات ملاءمة وهذا يتطلب في كثير من الأحيان التحسين25 . الكريستال يخضع أيضا التلاعب متعددة خلال عملية الحصاد وحماية التبريد والتي قد تؤدي إلى تلف الكريستال، وفرصة للاستفادة من الإيثان السائل يسمح إغفال هذه الخطوة ويساعد على حماية سلامة الكريستال.
في حين أن الإيثان السائل هو cryogen فعالة للبلورات الدقيقة (<10 ميكرومتر) بسبب نحافة العينة، وهناك طرق بديلة لمنع تشكيل الجليد البلوري، لا سيما في بلورات أكبر، بما في ذلك الحد من محتوى المياه من الكريستال عن طريق استخدام بيئة رطبة تسيطر عليها بإحكام26،أو من خلال فتل السائل الزائد بعيدا عن كل من حلقة وسطح الكريستال27 ، ومع ذلك، تتطلب هذه مرة أخرى معالجة أكبر للعينة. استخدام النشاف الآلي ويغرق تجميد مع الإيثان السائل، كما هو الحال في cryoTEM، معا إزالة محلول التبلور الزائد وتوفير وسيلة لوميض البلورات الدقيقة بارد بطريقة تسيطر عليها في حين تحاول تقليل التلاعب.
هنا، نقدم بروتوكولا يمكن استخدامه ليس فقط من قبل كل من مستخدمي خط الحزم VMXm وفي خطوط الحزم microfocus الأخرى لجمع بيانات حيود عالية من إشارة إلى ضوضاء ولكن قد تكون مفيدة أيضا لأولئك الذين يعدون عينات بلورية البروتين القابلة للذوبان والمنظفات القائمة على بروتين الغشاء لإجراء تجارب microED. في حين أن جميع المرافق لإعداد وتقييم العينات متوفرة في VMXm ، فإن العديد من مختبرات البيولوجيا الهيكلية مجهزة بشكل متزايد لإعداد عينات cryoTEM. ونتيجة لذلك، نتصور أن بعض المستخدمين قد يرغبون في استخدام مرافقهم الخاصة لإعداد عيناتهم لوقت البث في VMXm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated Cryo-EM plunge freezing instrument</td>
			<td>Leica or ThermoFisher</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop light microscope with light source</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade/Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 &#181;m holes</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C16nCu20-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTEM grid storage boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>146750010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12383118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>455732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharging device</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film (Parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small, fine forceps</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetting devices</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape for crystallisation plates.</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small/medium liquid nitrogen dewars</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprung circlip clipping tool</td>
			<td>Subangstrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann No.1 pre-cut filter paper</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sample preparation pipeline for microcrystals at the vmxm beamline

تركيب البلورات الدقيقة (<10 ميكرومتر) لبلورة واحدة بلورية بلورية يمثل تحديا غير تافهة. وقد شوهدت تحسينات في جودة البيانات للبلورات الدقيقة مع تطوير البصريات الحزمة، والاستقرار شعاع وحجم شعاع متغير مع التركيز من submicron إلى ميكرون، كما هو الحال في خط الحزم VMXm في مصدر ضوء الماس1. وسيكتسب المزيد من التحسينات في نوعية البيانات من خلال إدخال تحسينات على بيئة العينة وإعداد العينات. تولد البلورات الدقيقة بطبيعتها حيود أضعف ، وبالتالي فإن تحسين الإشارة إلى الضوضاء هو المفتاح لجمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الجودة وسيأتي في الغالب من انخفاض في ضوضاء الخلفية. المصادر الرئيسية للضوضاء الخلفية بالأشعة السينية في تجربة الحيود هي من تفاعلها مع مسار الهواء قبل وبعد العينة ، محلول التبلور الزائد المحيط بالعينة ، وجود الجليد البلوري والتشتت من أي أجهزة شعاعية أخرى أو نوافذ الأشعة السينية. يتضمن خط الحزم VMXm أجهزة وبروتوكول إعداد عينة لتقليل جميع مصادر الضوضاء هذه.
أولا، تزيل بيئة عينة في الفراغ في VMXm مسار الهواء بين مصدر الأشعة السينية والعينة. بعد ذلك ، تستخدم بروتوكولات إعداد العينة للبلورات الجزيئية الكلية في VMXm عددا من العمليات والأدوات المكيفة من cryoTEM. وتشمل هذه الشبكات النحاسية مع أفلام دعم الكربون هولي، النشاف الآلي والروبوتات التبريد يغرق الاستفادة من الإيثان السائل. تمكن هذه الأدوات من إعداد مئات البلورات الدقيقة على شبكة cryoTEM واحدة مع الحد الأدنى من السائل المحيط على دعم منخفض الضوضاء. كما أنها تقلل من تكوين الجليد البلوري من أي سائل متبقي يحيط بالبلورات. نقدم عملية إعداد وتقييم جودة البلورات الدقيقة للبروتين القابلة للذوبان باستخدام الضوء المرئي ومسح المجهر الإلكتروني قبل تركيب العينات على خط الحزم VMXm لتجارب حيود الأشعة السينية. كما سنقدم أمثلة على عينات ذات نوعية جيدة وكذلك تلك التي تتطلب المزيد من التحسين والاستراتيجيات للقيام بذلك.

الهدف من هذا البروتوكول هو تحقيق البلورات الدقيقة التزجيج مع الحد الأدنى من حجم السائل المحيطة الكريستال التي تمكن تجارب الحيود الأشعة السينية مع الحد الأدنى من التشتت الخلفية لتحسين إشارة الحيود. مثال تظهر صور SEM للبلورات الدقيقة المعدة على شبكات cryoTEM للنثر الخلفي الأدنى في الشكل 1A وB والشكل 2. الشبكات مع بلورات واحدة موزعة بالتساوي سوف توفر الاستخدام الأكثر كفاءة للشبكة، مع إشارة جيدة إلى الضوضاء. ومع ذلك، هذا غير ممكن عادة عبر الشبكة بأكملها وبعض المناطق قد تعرض قدرا من تكتل(الشكل 2A، B). على الرغم من هذا التكتل، لا تزال هذه الأمثلة تعرض عددا مفيدا من بلورات معزولة واحدة من شأنها أن توفر الحيود الخلفية المنخفضة(الشكل 5). يمكن أن يختلف مستوى النشاف الذي لا يزال يحافظ على تشتت منخفض الخلفية. النشاف قوية بحيث الثقوب في فيلم دعم الكربون واضحة للعيان ولكن بلورات لا تزال رطب هو الهدف (الشكل 2C, D). ومع ذلك ، لا يزال بإمكان شبكات ذات نوعية جيدة عرض بعض السائل داخل ثقوب فيلم الدعم على الرغم من أن موضع الثقوب يجب أن يكون لا يزال قابلا للتحديد(الشكل 2A ، B). الأهم من ذلك، كل هذه الأمثلة عرض بلورات واحدة معزولة مع هالة من السائل المهتز المحيطة الكريستال للحفاظ على الترطيب بين النشاف وتجميد يغرق.
قد تتطلب العديد من العينات المزيد من التحسين(الشكل 3)،والتي يمكن أن تشمل الاختلاف في وقت النشاف أو تركيز البلورات الدقيقة. الشبكات المحملة بالبلورات سوف تظهر انخفاض كفاءة النشاف ويمكن أن يؤدي إلى شبكات متعددة يتم تسجيلها في صور حيود واحدة(الشكل 3A، B). يمكن أن تؤدي ظروف التبلور اللزجة أكثر، مثل تلك الخاصة بالتريبسين الذي يحتوي على 8٪ PEG 4000 و 15٪ جلايكول الإيثيلين(الشكل 3C)،إلى الحاجة إلى فترات النشا أطول (>10 s). على العكس من ذلك ، يمكن أن تتبلور الظروف مع لزوجة منخفضة جدا أن لطخة بسرعة كبيرة ، تعاني من مشاكل في التوزيع بسبب الجاذبية مما تسبب في تسوية قبل النشاف يحدث ، مما أدى إلى استقرار جميع microcrystals على طول جانب واحد من الشبكة (الشكل 3د).
يسمح الإعداد الأمثل للعينات باستغلال القدرات الكاملة ل VMXm لجمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الجودة بأعلى دقة ممكنة مع إشارة عالية إلى ضوضاء (الشكل 5). وتستفيد هذه العينات من توافقها مع بيئة العينة داخل المهبل، مما يؤدي إلى انخفاض شديد أو صفر في متوسط عدد الخلفيات في صور الحيود. استخدام الإيثان السائل، دون حماية التبريد، يؤدي إلى عدم وجود حلقات الجليد (الشكل 5)، على الرغم من أن حيث بلورات تقع على مقربة من قضبان شبكة النحاس، شعاع الأشعة السينية يمكن إلقاء نظرة على القضبان مما أدى إلى حلقات حيود مسحوق النحاس في ~ 2.1 Å و ~ 1.8 Å.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig01.jpg"> الشكل 1: مقارنة تركيب البلورات الدقيقة على يتصاعد micromesh وشبكات cyoTEM. مسح ميكروجرافات الإلكترون من البلورات الدقيقة المجمدة من الفيروسات متعددة الأضلاع قياس 2.5 ميكرومتر عبر (A، B) 5 كيلو فولت الجهد المتسارع، وحجم بقعة من 39 (وحدات التعسفي) ووقت يسكن من 16 ميكرومتر. الشبكة خالية من السائل الزائد (A)، لوحظ هالة ضيقة من السائل المحيطة بلورات (ب). نفس العينات التي شنت على micromesh (20 ميكرومتر فتحات) قبل فلاش التبريد في النيتروجين السائل ولاحظ باستخدام نظام عرض على محور في الحزمة I24 وجها لوجه (C) والجانب على (D). التشوهات البصرية(C)عند عرض وجها لوجه تعطي مؤشرا على مدى سمك السائل عبر micromesh، وهذا هو أكثر وضوحا عند عرض الجانب micromesh على (D). يمثل الهدف الأحمر في C و D موضع شعاع الأشعة السينية وحجمه. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig01large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig02.jpg"> الشكل 2: أمثلة على عينات ذات نوعية جيدة. بلورات بوليهيدرا(A)لوحظ عبر مربع شبكة واحدة ~ 100 ميكرومتر. في حين أن بعض البلورات متجمعة قليلا وتظهر بعض الاتصال من السائل المحيط بها، وهناك عدد من بلورات واحدة معزولة مع هالة صغيرة من السائل المحيطة الكريستال. بلورات الأنسولين أكبر قليلا (ب) قياس ~ 5 × 5 ميكرومتر تظهر أيضا بعض تكتل ولكن مرة أخرى هناك بلورات الفردية معزولة بشكل جيد. بلورات إبرة يمكن أن يكون لها بعد ضيق جدا وتتطلب الميكروبات، مثل هذه بلورات lysozyme على شكل إبرة(C). ويمكن رؤية نطاق ضيق من السائل المحيطة هذه البلورات (هالة رمادية فاتحة). أكبر microcrystals تصل إلى عشرات ميكرون أيضا يمكن تركيبها بشكل جيد على شبكات cryoTEM، مثل هذه بلورات البروتين ~7 ميكرومتر K (D). في كل من (C) و (D) وإلى حد أقل في (A) ، تكون ثقوب فيلم دعم الكربون مرئية بوضوح ، مما يدل على وجود القليل جدا / لا يوجد سائل. في المثال B ، في حين لا توجد ثقوب فارغة ، لا يزال من الممكن تحديد موضع الثقوب ، مما يشير إلى أن السائل يملأ الثقوب فقط في فيلم الدعم. في كل هذه الأمثلة ، يمكن رؤية هالة من السائل حول حافة مربع الشبكة (مربع داخلي مستدير) ، حيث يكون للثقوب مظهر رمادي أخف. هذه سمة مشتركة من الشبكات المعدة جيدا. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig02large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig03.jpg"> الشكل 3:أمثلة على العينات التي تتطلب المزيد من التحسين. شبكات مثقلة microcrystals (A ، B) يمكن أن تزيد من خلفية مبعثر كما العينات كتلة الثقوب في الفيلم دعم الحد من كفاءة النشاف ، ومع ارتفاع التوتر السطحي بين بلورات أكثر بقايا السائل. وبالإضافة إلى تدهور الإشارة إلى الضوضاء مما يؤدي إلى فقدان المعلومات، فمن المرجح أن يتم تسجيل شعريات متعددة. باستخدام وقت النشاف الذي ليس طويلا بما فيه الكفاية، أو حل بلورة لزجة للغاية يمكن أن يؤدي إلى عينة الرطب بشكل مفرط(C)،كما تنتج إشارة منخفضة إلى الضوضاء. ظروف التبلور مع عدم وجود مثبطات، مثل تلك للأنسولين البقري(D)،لديها لزوجة منخفضة جدا. في حين أن هذا يؤدي إلى وقت النشاف قصيرة جدا، فإنه يمكن أن يؤدي أيضا إلى حركة بلورات عبر الشبكة قبل وأثناء النشاف بسبب آثار الجاذبية. وهذا عادة ما يؤدي إلى شبكة فارغة إلى حد كبير مع تركيز عال من بلورات على طول حافة واحدة (D). يمكن أن يكون من المفيد إضافة عامل لزج مثل جلايكول الإيثيلين إلى الطين الكريستالي قبل وقت قصير من تطبيقها على الشبكة للحد من تدفق الكريستال وتحسين توزيع البلورات. هذا يمكن أيضا إطالة وقت النشاف، مما يجعل من الأسهل لمراقبة النشاف. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig03large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig04.jpg"> الشكل 4: أدوات لتحميل العينة في VMXm. وقد تم تصميم مجموعة مفصلة من الأدوات لتحميل أصحاب عينة VMXm (أ). يحتوي محمل العينة(B)على مساحة لحامل عينة VMXm واحد ومربع الشبكة وتخزين الأداة أثناء العمل. كما أنها مصممة للسماح بالعمل تحت سطح النيتروجين السائل والسماح لخرطوشة العينة لتناسب تحت (ب). يتم استخدام ديوار القفل الهوائي (C) ، الذي يناسب مربع غاز النيتروجين القفل الهوائي على محطة VMXm النهائية ، لأخذ خرطوشة العينة المحملة من المختبر إلى كوخ الحزم التجريبي. لعرض العينات في SEM غير متصل، تم إجراء مكوك مفصل(D)يتألف من حامل عينة VMXm بدون قاعدة لتمكين التقييم في حامل العينة الذي يستخدم على خط الحزمة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig04large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig05.jpg"> الشكل 5: مثال على الحيود من البلورات الدقيقة في VMXm. صورة حيود واحدة مسجلة باستخدام كاشف Pilatus 3 6M في VMXm من بلورة متعددة الهدرال فيروس ~ 3 ميكرومتر محمولة على شبكة cryoTEM باستخدام طريقة تجميد الهبوط. ويلاحظ الحيود إلى ما بعد 1.7 ألف وانعكاس (مربع أزرق) في 1.74 ألف هو inset ، مما يدل على انخفاض الخلفية مبعثر ، مع عدد كبير من بكسل مع العد صفر. تمت إضافة جلايكول الإيثيلين إلى تركيز نهائي قدره 50٪ v/v إلى الطين البلوري قبل تطبيقه على الشبكة. تظهر طبيعة الخلفية المنخفضة لموضع عينة VMXm من خلال الخلفية الثابتة عبر الصورة كما هو موضح من خلال الكثافات المرسومة تحت الخط الأزرق المتقطع ، حتى بالقرب من مركز الحزمة. تظهر الكثافات المرسومة أن الخلفية لا تزال أقل من 3 تهم. لوحظت حلقتان خافتتان عند 2.15 Å و 1.86 Å اللتين يتم إنشاؤهما بواسطة حيود مسحوق النحاس لشبكة cryoTEM. لا توجد حلقات جليدية يمكن اكتشافها ، مما يدل على فعالية النشاف تليها التبريد مع الإيثان السائل. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig05large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline at JoVE.com

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

نسبة الإشارة إلى الضوضاء من البيانات هي واحدة من أهم الاعتبارات في إجراء قياسات الحيود الأشعة السينية من البلورات الدقيقة. يوفر خط الحزم VMXm بيئة منخفضة الضوضاء والميكروبات لمثل هذه التجارب. هنا، ونحن نصف أساليب إعداد عينة لتركيب وتبريد البلورات الدقيقة لVMXm وغيرها من الخطوط شعاعية البلورات الجزيئية الدقيقة.

خط أنابيب إعداد عينة للبلورات الدقيقة في خط شعاع VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

إعداد عينة قياسية تجعل من الصعب تحقيق إشارة جيدة إلى الضوضاء أثناء تجارب الحيود الأشعة السينية من البلورات الدقيقة. يهدف هذا البروتوكول إلى تقليل مصادر البلورات التي تشكلت في الخلفية بطريقة خاضعة للرقابة. يوفر استخدام الروبوتات المجمدة وشبكات cryoTEM منصة قوية للتلاعب بالبلورات الدقيقة بشكل متكرر ، مما يقلل من حجم السائل المحيط ويوفر تزجيجا سريعا للعينة.البراعة اللازمة للتعامل مع الشبكات مماثلة لتلك اللازمة لحصاد الكريستال التقليدية. وثمة عامل هام آخر هو تحديد معلمات النشاف الأولية باستخدام حل التبلور، وهو أمر أساسي للحد من استخدام العينة. للبدء، قم بإعداد وتبريد ثلاجة الغطس الآلية وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.قبل الاستخدام مباشرة، قم بتفريغ التوهج لشبكات cryoTEM لمدة 25 ثانية مع تيار 15 مللي أمبير وضغط 0.39 ملليبار، ثم حافظ على شبكات تفريغ التوهج في طبق بيتري مغطى. تعيين الرطوبة النسبية للغرفة عينة إلى 90٪، ووقت النشاف إلى خمس ثوان. تأكد من أن يتم تعيين الفريزر يغرق تلقائيا العينة بعد النشاف كاملة.فتح ختم البئر تبلور والخزان. إضافة بسرعة اثنين إلى خمسة ميكرولترات من محلول الخزان في قطرة الكريستال للحفاظ على حجم الانخفاض. نقل 10 ميكرولتر من محلول الخزان إلى أنبوب 0.5 ملليلتر للاستخدام في وقت لاحق وإعادة ختم البئر لمنع انخفاض التبلور من التجفيف.استخدام ملقط تجميد يغرق لاختيار توهج واحد شبكة تفريغ وتحميل الشبكة في الصك مع الجانب الكربون التي تواجه بعيدا عن الذراع النشاف. تدوير ملقط عقد الشبكة بحيث يواجه الجانب الكربون الذراع النشاف. استخدم ماصة 2.5 ميكرولتر لتطبيق اثنين من ميكرولترات من محلول الخزان على الجانب غير الداعم لشبكة cryoTEM.تدوير الشبكة مع الجانب الكربوني التي تواجه بعيدا عن الذراع النشاف وتطبيق بعناية السائل الخزان إلى الجانب دعم فيلم الكربون من الشبكة. بدء عملية النشاف ومراقبة السائل المسحوب من سطح الكربون حتى موجة ظهرت عبر سطح الشبكة مرئية. إذا كانت موجة الظهور غير مرئية، قم بزيادة وقت النشاف من ثانية إلى ثانيتين قبل أن تتراجع ذراع النشاف من الشبكة.ضع لوحة التبلور تحت المجهر الخفيف وضع الهدف جيدا داخل مجال الرؤية. ضع شبكة تفريغ توهج جديدة في ثلاجة الغطس وطبق سائل الخزان على الجانب غير الداعم من الشبكة كما هو موضح سابقا. تدوير الشبكة مع الجانب دعم فيلم الكربون التي تواجه منفذ عينة من الفريزر يغرق.قشر الختم المؤقت من لوحة تبلور واستخدام ماصة تعيين في اثنين من microliters لتنشق بلطف قطرة تبلور مرارا وتكرارا. نقل اثنين من microliters من الطين microcrystal يستنشق إلى الثلاجة يغرق وتطبيق كل عينة على الجانب الكربوني من شبكة cryoTEM. بدء النشاف ومراقبة لموجة من ظهرت، ثم تبدأ على الفور تجميد يغرق.نقل بسرعة الشبكة من الإيثان السائل إلى مربع الشبكة مغمورة في النيتروجين السائل. بعد النشاف والغطس تجميد الشبكة، تراجع الشبكة سقطت من الإيثان السائل عن طريق إعادة تعيين الفريزر يغرق. إزالة ملقط عقد الشبكة من الفريزر يغرق ووضع الشبكة تحت المجهر الخفيف.ضبط التركيز الدقيق وتقييم كثافة بلورات عبر الشبكة. بعد تحميل شبكة cryoTEM في SEM، قم بمحاذاة العينة ثم قم بتشغيل شعاع الإلكترون. في البداية تقييم الشبكة بأكملها في التكبير 45X وتسجيل الصورة، ثم زيادة التكبير لفحص أوثق من المربعات الشبكة الفردية حتى يتم رصد بلورات الفردية بوضوح.تحرك حول الشبكة والتقاط الصور الثابتة ، مما يضمن أن الشبكات مسطحة وفيلم دعم الكربون سليم إلى حد كبير. تأكد من وجود العديد من البلورات المفردة مع هالة ضيقة من السائل المهتز المحيط بالكريستال والثقوب مرئية في فيلم دعم الكربون. أثناء مراقبة والتقاط صور الشبكة ، تأكد من عدم وجود مناطق كبيرة من السائل المهزوز ، ولا ينتشر الجليد السداسي أو الجليد السطحي عبر الشبكة ، وأن البلورات ليست متداخلة وموزعة بالتساوي عبر فيلم الدعم.في ديوار رغوة كبيرة، تبريد العدد المطلوب من أصحاب عينة VMXm تحميلها في خرطوشة العينة. إضافة النيتروجين السائل فوق موضع العينة في محمل العينة. نقل بسرعة مربع الشبكة التي تحتوي على شبكات محملة microcrystal إلى عطلة مربع الشبكة على محمل العينة وفك الغطاء قليلا للحفاظ على غطاء فضفاضة وقابلة للدوران.ارفع الشبكة من مربع الشبكة وتناوب الشبكة لوضع الشبكة مسطحة على حامل العينة. ضع بسرعة أداة circlip المبردة مسبقا فوق الشبكة في فتح الشبكة واضغط على الزر لتثبيت circlip. إضافة النيتروجين السائل حوالي 1.5 سنتيمتر فوق حامل العينة.استخدم ملقط عينة VMXm لرفع حامل العينة المحمل بعناية ووضعه مرة أخرى في خرطوشة العينة. استبدل الغطاء الموجود على الخرطوشة، وتأكد من أن الدبوس الموجود أعلى الخرطوشة يتفاعل مع الثقب الموجود في الغطاء. وأظهرت الصور الدقيقة الإلكترونية المسح الضوئي من البلورات الدقيقة التي أعدت على شبكات cryoTEM الحد الأدنى من التشتت الخلفية.كانت الشبكة خالية من السائل الزائد ولوحظت هالة ضيقة من السائل تحيط بالبلورات. وقد لوحظت بلورات متعددة الهد بشكل فردي وكذلك في كتل. وأظهرت بلورات الأنسولين أكبر قليلا أيضا بعض تكتل جنبا إلى جنب مع بلورات معزولة.كما تم تركيب البلورات الدقيقة الكبيرة جدا بنجاح على شبكات cryoTEM. كانت الثقوب في فيلم دعم الكربون مرئية بوضوح ، مما يشير إلى النشاف القوي. تتطلب العديد من العينات المزيد من التحسين بسبب الاختلاف في وقت النشاف وتركيز البلورات الدقيقة.الشبكات المحملة بالبلورات تقلل من كفاءة النشاف وسجلت شعريات متعددة في صورة حيود واحدة. يمكن أن يؤدي وقت النشاف القصير لحلول التبلور اللزجة للغاية إلى عينة رطبة بشكل مفرط. للحصول على حل تبلور اللزوجة أقل، يؤدي وقت النشاف القصير في سرقة البلورات الدقيقة على جانب واحد من الشبكات.إن إعداد العينة الأمثل يجعل من الممكن استغلال القدرات الكاملة ل VMXm لجمع بيانات حيود الأشعة السينية عالية الجودة بأعلى دقة ممكنة مع نسبة عالية من الإشارة إلى الضوضاء. تحديد النشاف الأولي لحل التبلور هو المفتاح لاستخدام عينة الحد الأدنى. إذا كانت العينة محدودة جدا، فتخطى تقييم الكثافة.في نهاية المطاف، من الأفضل أن يكون لديك عينة مخففة. هذه العينات جاهزة الآن لتجارب حيود الأشعة السينية في خط شعاع VMXm ، أو حيود الإلكترون البلوري الدقيق ، أو طحن شعاع الأيونات المركزة قبل ED الصغير.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

إعداد وتسليم Microcrystals البروتين في المرحلة مكعب شحمي عن المسلسل الفيمتو ثانية البلورات

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

استخدام خط أنابيب MALDI TOF-MS IDBac المفتوح المصدر لتحليل البروتين الميكروبي وبيانات المستقلب المتخصصة

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

ثقافة الخلية علي اغشيه نيرايد السيليكون والتعويض عن البرد لل Synchrotron الاشعه السينية الفلورية نانو-تحليل

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

إعداد عينة TMT لتقديم مرافق Proteomics وتحليل البيانات اللاحقة

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

سير العمل وأدوات لفحص الأجزاء البلورية في هيلمهولتز-زينتروم برلين

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

بروتوكول تحضير العينات ونقلها لعلم البلورات طويل الطول الموجي داخل الفراغ على خط الشعاع I23 في مصدر ضوء الماس

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

إعداد العينة باستخدام طريقة أحادية الطبقة الدهون للدراسات البلورية الإلكترون

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...