Name: a sample preparation pipeline for microcrystals at the vmxm beamline
Uploaded: 2021-06-17T13:00:00
Duration: 9 min
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Die Autoren danken Jeremy Keown, Jon Grimes, Geoff Sutton und Dave Stuart, STRUBI University of Oxford und Rachel Bolton, University of Southampton für die freundliche Bereitstellung von Mikrokristallproben für die Entwicklung und Demonstration von Probenvorbereitungsmethoden für die VMXm-Beamline sowie für die Inbetriebnahme der Beamline. Die Autoren danken auch iNEXT-Discovery (Projektnummer 871037) für die Möglichkeit und Unterstützung bei der Veröffentlichung dieses Manuskripts.

1. Einrichtung der Ausrüstung
HINWEIS: Die hier beschriebenen Methoden verwenden ein Tauchgefrierinstrument mit einem einzigen Löscharm. Einige Instrumente sind mit zwei Löscharmen ausgestattet und wir empfehlen dem Benutzer, die Anweisungen des Herstellers zu überprüfen, um das Instrument so einzustellen, dass nur ein Löscharm verwendet wird.
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass ein Lichtmikroskop in der Nähe des Tauchgefrierinstruments positioniert ist, idealerweise so, dass sowohl das Mikroskop als auch der Tauchgefrierschrank für den Benutzer leicht erreichbar sind.</li>
	<li>Richten Sie den automatisierten Tauchfroster gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kühlen Sie ihn. HINWEIS: Die Probenkammertemperatur sollte auf die Temperatur eingestellt werden, bei der die Kristalle gezüchtet wurden. Legen Sie kein Löschpapier in die Probenkammer. ACHTUNG: Flüssiges Ethan ist ein leicht entzündlicher Sprengstoff und darf nur in einem gut belüfteten Bereich abseits potenzieller Funkenquellen verwendet werden.</li>
	<li>Gitterboxen entsprechend etikettieren und in einem kleinen Dewar mit flüssigem Stickstoff abkühlen.</li>
	<li>Legen Sie die Gitter, Kohlenstofffolie Seite nach oben, vorsichtig auf einen geeigneten Träger für die Glühentladung (z. B. einen in Parafilm gewickelten Glasmikroskopobjektträger).</li>
	<li>Glühentladungs-CryoTEM-Gitter für 25 s bei 0,39 mBar bei einem Strom von 15 mA. Glühentladung kurz bevor die Gitter verwendet werden. Bewahren Sie die glühend entladenen Gitter in einer abgedeckten Petrischale auf, bis sie fertig sind. Wenn 30 Minuten nach der Glühentladung verfallen, wiederholen Sie die Glühentladung. HINWEIS: Wenn der Tauchfroster bereit ist und gitter vorbereitet sind, kann sich die Aufmerksamkeit auf die Probe richten.</li>
</ol>2. Bestimmen der anfänglichen Löschparameter
<ol><li>Stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit der Probenkammer auf 90% und die Löschzeit auf 5 s ein und stellen Sie sicher, dass der Tauchfroster so eingestellt ist, dass die Probe nach Abschluss des Blottings automatisch getaucht wird. HINWEIS: Diese Startparameter eignen sich am besten für den Leica GP Tauchgefrierschrank, weitere Parameter wie die Löschkraft sind auf dem FEI Vitrobot verfügbar. Unserer Erfahrung nach wird die Kristallintegrität jedoch eher durch die Verwendung eines einzigen Löscharms aufrechterhalten.</li>
	<li>Um die Kristallisationsschale versiegeln zu können, sobald der interessierende Brunnen geöffnet ist, schneiden Sie einen kleinen Streifen Klebeband und falten Sie ihn über ein Ende, um eine Lasche zu erstellen, um das Öffnen der Dichtung zu erleichtern und vorsichtig zur Seite zu legen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Dichtung über der Kristallisationsbohrung einschließlich des Reservoirs auf. Tragen Sie schnell 2-5 μL Reservoirlösung auf den Kristall auf, der den Tropfen enthält, um das Flüssigkeitsvolumen im Tropfen zu erhalten.</li>
	<li>Verwenden Sie die Klebebandlasche, um den Brunnen wieder zu veralten und sicherzustellen, dass der Kristallisationstropfen nicht austrocknet.</li>
	<li>Während Sie das Band vorübergehend über der Kristallisationsbohrung offen halten, werden 10 μL der Reservoirlösung in ein 0,5-ml-Röhrchen übertragen, um es für spätere Schritte zu verwenden.</li>
	<li>Verdienen Sie den Brunnen wieder.</li>
	<li>Legen Sie ein Stück vorgeschnittenes Löschpapier auf den Löscharm des Tauchgefrierinstruments.</li>
	<li>Legen Sie ein einzelnes glühend entladenes Gitter in die Tauchgefrierzzette und laden Sie es so in das Instrument, dass die Kohlenstoffseite vom Löscharm weg zeigt.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass die relative Luftfeuchtigkeit in der Löschkammer bei 90% liegt.</li>
	<li>Drehen Sie die Zette so, dass die Carbonfilmseite dem Löscharm zugewandt ist.</li>
	<li>Tragen Sie mit einer 2,5 μL-Pipette 2 μL Reservoirlösung aus dem 0,5-ml-Röhrchen auf die nicht stützende (glänzende Kupfer-) Seite des KryoTEM-Gitters auf.</li>
	<li>Drehen Sie das Gitter so, dass die Kohlenstoffträgerseite vom Löscharm weg ist, und wiederholen Sie den Vorgang, wobei Sie die Flüssigkeit vorsichtig auf die Kohlenstofffilmträgerseite des Gitters auftragen. Vermeiden Sie es, den Carbonfilm mit der Pipettenspitze zu berühren, um den Carbonfilm nicht zu beschädigen. Die Flüssigkeit sollte sich aufgrund der Ladung, die sich während der Glühentladung ablagert, über das Gitter verteilen.</li>
	<li>Initiieren Sie den Löschvorgang, während Sie das Raster beobachten. Hierfür steht auf der Leica GP2 ein Betrachtungsfernrohr zur Verfügung.</li>
	<li>Beobachten Sie, ob die Flüssigkeit während dieser Zeit von der Kohlenstoffoberfläche des Gitters gezogen wird, dies beginnt damit, dass der Großteil des flüssigen Bolus auf dem Gitter abflacht, wenn die Flüssigkeit durch das Gitter abflacht. Da die Flüssigkeit in jedem Gitterquadrat weiter reduziert wird, kann eine Welle des "Knallens" über die Oberfläche des Gitters beobachtet werden. Wenn dieser Effekt beobachtet wird, kann das Blotting innerhalb von 2-3 s nach dem Ende des Popping-Effekts gestoppt werden. Es ist nicht notwendig, das Testgitter zu stürzen, das verworfen werden kann.</li>
	<li>Wenn der sogenannte "Popping"-Effekt nicht beobachtet wird, wiederholen Sie die Schritte 2.11-2.14 und verlängern Sie jedes Mal die Löschzeit um 1-2 s, bis der Popping-Effekt beobachtet wird, kurz bevor sich der Löscharm aus dem Raster zurückzieht. Notieren Sie sich dieses Mal für Schritt 3. HINWEIS: Es ist wichtig, dass das Blotting stoppt, sobald dieser Popping-Effekt aufgetreten ist, um sicherzustellen, dass kristalle während des Prozesses nicht durch Überblotten dehydriert werden. Verwenden Sie die Kristallisationslösung aus dem Reservoir zum Zurückblotten und Verdünnen der Probe, da sie sicherstellt, dass die Kristalle einer konsistenten Lösung ausgesetzt sind, wodurch das Risiko einer Destabilisierung der Kristalle verringert wird.</li>
</ol>3. Kristalle ernten
<ol><li>Legen Sie die Kristallisationsplatte unter das Lichtmikroskop und positionieren Sie das Ziel gut im Sichtfeld.</li>
	<li>Legen Sie ein frisches, glühend entladenes Gitter in die Tauchfrosterzette und montieren Sie die Zette im Tauchgefrierschrank, wobei die Carbonfilmseite vom Löscharm abwandt.</li>
	<li>Drehen Sie die Zette so, dass die Carbonfilmseite dem Löscharm zugewandt ist.</li>
	<li>Tragen Sie mit einer 2,5 μL-Pipette 2 μL Reservoirlösung aus dem 0,5-ml-Röhrchen auf die nicht tragende Seite des KryoTEM-Gitters auf und drehen Sie das Gitter so, dass die Kohlenstofffilm-Stützseite dem Probenanschluss des Tauchgefrierschranks zugewandt ist.</li>
	<li>Ziehen Sie die temporäre Versiegelung zurück und saugen Sie den Kristallisationstropfen vorsichtig wiederholt mit der Pipette ab, um die Mikrokristalle aufzuhängen (es ist wichtig, keine Luftblasen in den Tropfen einzuführen). HINWEIS: Es ist wichtig, diesen Prozess unter dem Lichtmikroskop zu beobachten, um sicherzustellen, dass Kristalle von jeder Oberflächenhaut oder der Basis des Brunnens freigesetzt werden. Wenn die Kristalle stecken bleiben und nicht mit Aspiration gezogen werden, können entweder die Pipettenspitze oder andere Kristallisationswerkzeuge wie eine Akupunkturnadel verwendet werden, um die Kristalle sanft zu vertreiben. Abhängig von der Größe der Kristalle und der Schärfentiefe des Lichtmikroskops ist es manchmal möglich, mit dem Mikroskop die Kristalle zu betrachten, die in die Pipettenspitze gelangen.</li>
	<li>2 μL der abgesaugten Mikrokristallaufschlämmung in den Tauchgefrierschrank übertragen und die gesamte Probe auf die Kohlenstoffseite des KryoTEM-Gitters auftragen.</li>
	<li>Blot für die in Schritt 2 festgelegte Zeit und sofort mit dem Einfrieren beginnen. Beobachten Sie beim Blotting das Auftreten eines Popping-Welleneffekts im gesamten Raster und notieren Sie, ob dies vollständig im gesamten Raster aufgetreten ist. Das Vorhandensein von Kristallen kann die anfängliche Löschzeit beeinflussen, und dies muss möglicherweise für nachfolgende Gitter um 1-2 s angepasst werden.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gitter schnell vom flüssigen Ethan in die in flüssigen Stickstoff getauchte Gitterbox. Restethan kann sich in einen undurchsichtigen weißen Feststoff auf dem Gitter verwandeln, wenn es in flüssigen Stickstoff gelangt. Um dies zu reduzieren, entfernen Sie das Gitter stetig aus dem flüssigen Ethan und gelangen dann schnell in das Flüssigstickstoffreservoir.</li>
	<li>Sobald 4 Gitter in die Gitterbox gelegt wurden, befestigen Sie den Deckel der Box mit der Schraube und geben Sie ihn entweder in einen Schaumtau aus flüssigem Stickstoff, um eine weitere Probenbeurteilung mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) zu ermöglichen, oder in einen Flüssigstickstoffspeicher dewar mit einem geeigneten Aufbewahrungsbehälter.</li>
</ol>4. Beurteilung der Probendichte mittels Lichtmikroskopie
ACHTUNG: Diese Methode ist destruktiv. Wenn die Proben nur begrenzt verfügbar sind, z. B. nur ein oder zwei Kristallisationströpfchen, wird empfohlen, diesen Schritt zu überspringen. Nach dem Einfrieren von Proben (Schritt 3.7) kann die Verteilung der Kristalle über das Gitter beurteilt werden.
<ol><li>Montieren Sie ein trockenes CryoTEM-Gitter bei Raumtemperatur in der Tauch-Gefrier-Schärfe und platzieren Sie die Zette auf der Seite auf dem Lichtmikroskop, mit dem Gitter im Sichtfeld. Stellen Sie eine entsprechende Vergrößerung und Fokussierung ein, damit das gesamte Raster und einzelne Rasterquadrate aufgelöst werden können.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 3.1-3.7 aus.</li>
	<li>Anstatt das Gitter auf die Gitterbox zu übertragen (Schritt 3.8), ziehen Sie das eingetauchte Gitter aus dem flüssigen Ethan zurück, indem Sie den Tauchfroster zurücksetzen. ACHTUNG: Das Gitter und die Probe erwärmen sich auf Raumtemperatur und können nicht für weitere Beugungsexperimente verwendet werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Zette aus dem Tauchgefrierinstrument.</li>
	<li>Während Sie das Gitter in der Zette halten, legen Sie das Gitter unter das Lichtmikroskop - der Fokus ist bereits grob eingestellt.</li>
	<li>Führen Sie einen Feinfokus durch und bewerten Sie die Dichte der Kristalle über das Gitter. Ein gutes Gitter enthält mehrere isolierte Kristalle abseits der Gitterstäbe in jedem Gitterquadrat und die Verklumpung von Kristallen ist minimal.</li>
	<li>Wenn die Dichte der Kristalle innerhalb des Gitters zu einer Verklumpung von Kristallen mit nur wenigen isolierten Kristallen führt, verdünnen Sie die Kristallaufschlämmung mit Reservoirlösung weiter und wiederholen Sie Schritt 3. Achten Sie beim Verdünnen der Proben darauf, dass die Verdünnung nicht zur Auflösung der Kristalle führt.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Kristalle schrittweise mit kleinen Volumina von 0,5-1 μL.</li>
</ol>5. Probenbeurteilung mittels Rasterelektronenmikroskopie
HINWEIS: Die Mikrokristallpräparation auf KryoTEM-Gittern wird am besten mit einer Rasterelektronenmikroskopie (REM) unter kryogenen Bedingungen beurteilt, dies kann mit einem REM mit Kryostufe erreicht werden. Bei VMXm kommen ein JEOL JSM-IT100 SEM (Wolframquelle) mit quorum PP3006 Luftschleuse und Kryobühne zum Einsatz. Um minimale Strahlungsschäden bei der Betrachtung von Proben auf VMXm28,29zu gewährleisten, werden die folgenden Einstellungen verwendet: 5 kV Beschleunigungsspannung; eine Spotgröße von 40 (beliebige Einheiten auf dem JEOL JSM-IT100); 10 mm Arbeitsabstand. Die Bilder werden mit dem Sekundärelektronendetektor aufgezeichnet, für die Probenausrichtung und Fokussierung wird eine Verweilzeit von 0,8 μs verwendet, während hochauflösende Bilder von Einkristallen mit einer Verweilzeit von 16 μs aufgenommen werden. Vor dem Laden einer Probe in das REM ist es wichtig, dass das Mikroskop gemäß den Anweisungen des Herstellers ausgerichtet ist. Es wird empfohlen, dass nur ein einzelnes Gitter in das REM geladen wird, während alle verbleibenden Gitter, die mit den gleichen Parametern vorbereitet wurden, für Röntgenbeugungsexperimente reserviert sind.
<ol><li>Bereiten Sie das REM vor, indem Sie die Probenschreibstufe gemäß herstellerüblichem Anweisungen auf -180 °C abkühlen. Befolgen Sie die Anweisungen zum Laden von cryoTEM-Gittern in das jeweilige verfügbare System.</li>
	<li>Wenn die Probe in das REM geladen ist, schalten Sie den Elektronenstrahl ein, richten Sie die Probe aus und stellen Sie den Fokus mit einer hohen Vergrößerung (0,8 μs Verweilzeit) ein.</li>
	<li>Führen Sie zunächst die Ersteinschätzung mit Blick auf das gesamte Raster bei geringer Vergrößerung (x45) durch. Nehmen Sie ein Bild bei dieser Vergrößerung auf.</li>
	<li>Erhöhen Sie die Vergrößerung, um eine genauere Betrachtung einzelner Gitterquadrate zu ermöglichen, einzelne Kristalle sollten sehr deutlich beobachtbar sein.</li>
	<li>Bewegen Sie sich im Raster und erfassen Sie Standbilder (16 μs Verweilzeit) von Kristallen, um sicherzustellen, dass sie die folgenden Anforderungen erfüllen, bevor Sie fortfahren:<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die Gitter flach sind und die Kohlenstofftragschicht weitgehend intakt ist.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass sich zahlreiche Einkristalle mit einem engen Halo aus verglaster Flüssigkeit befinden, die den Kristall umgeben.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Löcher in der Kohlenstoffträgerfolie sichtbar sind.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass es keine großen Bereiche von verglaster Flüssigkeit gibt, die durch ein dunkles und glattes Aussehen definiert sind.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass wenig oder kein sechseckiges Eis oder Oberflächeneis über das Gitter verstreut ist.</li>
		<li>Stellen Sie sicher, dass die Kristalle gleichmäßig über die Trägerfolie verteilt sind und sich nicht überlappen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Messen Sie an dieser Stelle genau die Abmessungen einer Reihe von Kristallen, um eine genaue Korrelation der Röntgenstrahlgrößenkorrelation bei späteren Beugungsexperimenten zu ermöglichen.</li>
	<li>Proben, die zuverlässig aus dem REM entnommen und bei kryogenen Temperaturen gehalten werden können, können später für Röntgenbeugungsexperimente verwendet werden. Wenn dies nicht möglich ist, entsorgen Sie diese Proben. HINWEIS: Bei der Abbildung sowohl des gesamten Gitters als auch einzelner Mikrokristalle (ca. x45 bzw. x700 Vergrößerung) sollte beurteilt werden, ob mit Gittern, die mit den gleichen Parametern vorbereitet wurden, zur Beamline übergehen soll oder ob einige Parameter während Schritt 3 angepasst werden müssen. Die Gitter sollten die in Schritt 5.5 beschriebenen Tests erfüllen. Wenn die Raster diese Kriterien nicht erfüllen, ist eine weitere Optimierung während Schritt 3 erforderlich, bevor Schritt 5 wiederholt wird.</li>
</ol>6. Vorbereitung des Rasters für Beugungsexperimente bei VMXm
<ol><li>Kühlen Sie die erforderliche Anzahl von VMXm-Probenhaltern (Abbildung 4A) (bis zu 5), die in die Probenkartusche (mit Deckel) geladen sind, mit dem Probenlader in einem großen Schaumstofftau (Abbildung 4B) mit flüssigem Stickstoff ab - dies kann eine große Menge an flüssigem Stickstoff erfordern. Der Gehalt an flüssigem Stickstoff sollte knapp über der Probenposition auf dem Probenlader liegen.</li>
	<li>Bereiten Sie Circlips und Werkzeuge vor.</li>
	<li>Legen Sie Werkzeuge wie Clipping-Tool, Sozette und VMXm-Probenzette zum Abkühlen in Löcher im Probenlader. Es kann nützlich sein, einen Scheinwerfer über dem Dewar anzuordnen.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gitterbox mit den mit Mikrokristallen beladenen Gittern schnell in die Gitterkastenmulde am Probenlader und schrauben Sie den Deckel so ab, dass er locker und drehbar ist (nicht entfernen).</li>
	<li>Unter flüssigem Stickstoff den Deckel mit großer Zette aus der Probenkartusche entfernen und unter den Probenlader legen.</li>
	<li>Verwenden Sie die VMXm-Probenzette, um den Probenhalter auf den Probenlader zu heben, und stellen Sie sicher, dass der Halter nach oben zeigt, damit er ein Gitter aufnehmen kann. In der richtigen Position greift ein kleiner Stift am Probenlader mit dem kleinen Loch in der Mitte des Probenhalters ein.</li>
	<li>Heben Sie mit der abgekühlten Feinzette vorsichtig das Gitter aus dem Gitterkasten und übertragen Sie es in die Nähe der Gitteröffnung auf dem Probenhalter. Drehen Sie das Gitter so, dass es flach liegt (es spielt keine Rolle, in welche Richtung die Trägerfolienseite zeigt).</li>
	<li>Senken Sie die Zette vorsichtig ab, damit sich das Gitter so nah wie möglich über der Gitteröffnung befindet (achten Sie darauf, das Gitter nicht zu verbiegen) und lassen Sie das Gitter in die Öffnung los. Wenn das Gitter nicht richtig sitzt, verwenden Sie vorsichtig die feine Zette, um das Gitter in Position zu bringen, oder klopfen Sie vorsichtig mit der größeren Zette auf den Probenhalter.</li>
	<li>Legen Sie das vorgekühlte Circlip-Werkzeug schnell über das Gitter in der Gitteröffnung und setzen Sie den Circlip durch Drücken der Taste ein. Es kann hilfreich sein, 2 Vertiefungen des Knopfes anzuwenden, um sicherzustellen, dass der Circlip richtig sitzt.</li>
	<li>Befüllen Sie den flüssigen Stickstoff, so dass der Füllstand ~ 1,5 cm über dem Probenhalter liegt. Heben Sie mit der VMXm-Probenpinzette den geladenen Probenhalter vorsichtig über den kleinen Stift am Probenlader und zurück in die Probenpatrone. Notieren Sie sich die Positionsnummer des Probenhalters in der Probenkartusche.</li>
	<li>Laden Sie weiterhin Gitter in die Probenhalter, bis alle Proben geladen sind.</li>
	<li>Bringen Sie die Gitterboxen zum Speicherdewar zurück, wenn Proben im Inneren verbleiben, und entfernen Sie den Probenlader aus dem Dewar, um mehr Platz zu schaffen.</li>
	<li>Ersetzen Sie den Patronendeckel an der Patrone, und stellen Sie sicher, dass der Stift auf der Oberseite der Patrone mit dem Loch im Deckel eingreift.</li>
	<li>Kühlen und füllen Sie die VMXm-Luftschleusentau mit flüssigem Stickstoff und legen Sie sie neben den Schaumtauwar, der die beladene Probenkartusche enthält.</li>
	<li>Mit dem VMXm-Patronenwerkzeug bekeilen Sie das Werkzeug vorsichtig in die Grate an der Seite der Patrone und heben Sie die Patrone schnell in die Luftschleuse dewar.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Gehalt an flüssigem Stickstoff die Kartusche bedeckt.</li>
	<li>Setzen Sie den Dewar der Luftschleuse auf und fahren Sie mit der geladenen Probenpatrone zur VMXm-Endstation. HINWEIS: Das Einlegen der Probenkartusche in die VMXm-Endstation erfolgt durch Beamline-Mitarbeiter.</li>
</ol>

<ol>
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L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy-dependent+photoelectron+escape+in+microcrystals.">Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals.</a> IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).</li></ol>

Keine Interessenkonflikte zu erklären.

Dieses Protokoll zeigt, wie Werkzeuge aus der cryoTEM-Probenvorbereitung zur Herstellung von Mikrokristallen für Röntgenbeugungsexperimente an Mikrofokus-Beamlines eingesetzt werden können. Die Standard-Beamline-Instrumentierung ist um eine an einem Pin montierte Probe zentriert, und obwohl Anstrengungen unternommen wurden, um eine Probenunterstützung auf diesen Halterungen für Mikrokristalle bereitzustellen, sind sie oft schwierig, sie mit der Probe zu laden, während sichergestellt wird, dass das höchste Signal-Rauschen erreicht wird (Abbildung 1C, D). Viele dieser Proben erfordern möglicherweise auch eine Optimierung der Kryoschutzbedingungen, um sicherzustellen, dass die Probe glasig ist. Das Tauchgefrierverfahren bietet eine wiederholbare Möglichkeit, überschüssige Flüssigkeit zu entfernen und die Probe in einem effizienten Kryogen zu kühlen (Abbildung 1A, B). Während das Gitter dann auf einer Standard-Beamline mit einer Pinzettenhalterung montiert werden kann, wurden VMXm-Probenhalter speziell entwickelt, um Gitter aufzunehmen und sie in einer Vakuumumgebung durch leitfähige Kühlung unter der Glasübergangstemperatur zu halten. Die Beispielumgebung von VMXm ermöglicht eine geringe Hintergrunddatenerfassung, bei der die Probe die verbleibende Hintergrundquelle ist, und bietet einen Mikrostrahl, mit dem Kristalle mit Abmessungen von weniger als 10 μm abgegleicht werden können. Diese Probenvorbereitungsmethode kann auch zur Vorbereitung von Nanokristallen für die Elektronenbeugung verwendet werden, wo aufgrund des schwachen Eindringens von Elektronen auch sehr wenig überschüssige Flüssigkeit und eine Glaskörperprobe erforderlich sind. Während CryoTEM-Gitter zerbrechlich sind, werden sich diejenigen, die Erfahrung mit der Ernte von Kristallen in Schleifen haben, schnell an die Handhabung der Gitter anpassen. Mit ein wenig Erfahrung gehen während der Lösch-, Einfrier- und Ladephasen des Protokolls nur wenige Gitter verloren. Die Optimierungsschritte sind jedoch entscheidend für diesen Erfolg und eine sorgfältige Vorbereitung verringert die Wahrscheinlichkeit, Kristalle zu verlieren oder die Kristallintegrität zu verringern.
CryoTEM-Gitter bieten eine relativ große Einzelhalterung, die viele hundert Kristalle enthalten kann, wodurch der Durchsatz verbessert wird, wo es möglicherweise nur möglich ist, einen kleinen Keil beugungsdaten aufzuzeichnen. Ein einzelnes Gitter kann auch genügend Kristalle liefern, um die Proteinstruktur zu bestimmen, insbesondere in Kristallen mit hoher Symmetrie. Wenn nur ein oder zwei Einkristallisationstropfen Mikrokristalle erzeugt haben, kann allein das Versuchslöschen der Kristallisationsbedingung dazu beitragen, dass beim Blotten der Mikrokristalle die verwendeten Zeiten so nahe wie möglich an denen liegen, die zur Erzeugung anfänglicher Proben guter Qualität erforderlich sind. Die Carbonfilmträger sind für Röntgenstrahlen unsichtbar und mit unterschiedlichen Lochabständen erhältlich, die für eine bestimmte Morphologie verwendet werden können. Am häufigsten verwenden wir Stützfolien mit 2 μm-Löchern in einem Abstand von 2 μm, aber kleinere Löcher mit größerem Abstand können für Kristalle kleiner als 2 μm besser geeignet sein. Andere Trägerfolien wie solche mit 1 μm-Löchern mit einem Abstand von 4 μm sowie Trägerfolien mit unterschiedlich geformten Löchern sind verfügbar, die sich alle auf die Löschzeit auswirken. Eine Rasterquadratmaschenöffnung von 200 (200 Quadrate pro Zoll) bietet auch genügend Platz (~ 100 μm) zwischen den Kupfergitterstäben, so dass der Röntgenstrahl nicht stark mit dem Kupfer interagiert und gleichzeitig genügend strukturelle Unterstützung für den mit Kristallen beladenen Kohlenstofffilm bietet. Die Verwendung von flüssigem Ethan macht Kryoprotektoren zunichte, was wiederum den Bedarf an Probenvolumen reduziert, das bei der Optimierung der Kryoprotektorenbedingungen verwendet worden wäre.
Die wichtigsten Parameter, die während des Prozesses optimiert werden müssen, sind die Löschzeiten und die Probenverdünnung. Die Blotting-Zeiten sollten lang genug sein, um den "Popping" -Effekt über das gesamte Gitter zu beobachten, bevor sie einfrieren. Überblotting könnte zur Austrocknung der Kristalle führen, jedoch wird die Kontrolle der Feuchtigkeit innerhalb der Probenkammer verwendet, um diesen Effekt zu minimieren. Während vorgeschlagen wird, dass eine relative Luftfeuchtigkeit von 90% verwendet wird, können einige Proben bei der Optimierung der Luftfeuchtigkeit profitieren. Die Feuchtigkeit kann die Löscheffizienz des Löschpapiers beeinträchtigen, das langsam mit Wasser gesättigt werden kann. Zusätzlich könnte die Feuchtigkeitskontrolle innerhalb der Probenkammer verwendet werden, um die Beugungsqualität der Kristalle zu verbessern30. Es wird empfohlen, vor der Überprüfung der Beugungsintegrität kleine Änderungen (<5%) der Luftfeuchtigkeit vorzunehmen, um sicherzustellen, dass die Beugungsqualität nicht beeinträchtigt wird.
Die Optimierung von nicht wertvollen Proben kann mit einem Lichtmikroskop anstelle eines REM durchgeführt werden. Obwohl es destruktiv ist, ist es nützlich, um die Dichte von Kristallen über das Gitter zu beurteilen und die Entscheidung darüber zu ermöglichen, ob eine Probe verdünnt oder konzentriert werden soll, um Kristalle besser über das Gitter zu dispergieren. Dieser Schritt ist am nützlichsten, wenn eine große Anzahl von Kristallen und besonders hochkonzentrierte Proben zur Verfügung stehen. Ein Zusammenklumpen von Kristallen sollte vermieden werden (Abbildung 3), da es zwar kein signifikantes Problem darstellt, wenn zwei Kristalle während der Datenerhebung6gleichzeitig beleuchtet werden, aber wahrscheinlich ein größeres Flüssigkeitsvolumen um den Klumpen herum vorhanden ist, wodurch das Signal-Rausch-Rauschen verringert wird (Abbildung 5). Während es möglich ist, große Flüssigkeitsexzesse global über das Gitter mit einem Lichtmikroskop zu beobachten, kann die Beurteilung des Flüssigkeitsvolumens, das die Mikrokristalle umgibt, und des Vorhandenseins von kristallinem Eis nur mit einem Elektronenmikroskop erfolgen, das mit einem kryogenen Vakuumtransfersystem und einer Kryostufe ausgestattet ist. Manchmal, nach dem Auftragen der Kristalle auf das Gitter und bevor es zu Blotting kommt, können sich Kristalle in niedrigviskosen Lösungen entlang einer Kante des Gitters absetzen. Wir haben festgestellt, dass die Zugabe einer Endkonzentration von Ethylenglykol von bis zu 50% die Bewegung von Kristallen durch das Tröpfchen verlangsamen kann, was eine bessere Verteilung der Mikrokristalle über das Gitter gewährleistet und eine bessere Kontrolle über das Blotting durch Erhöhung der Blotting-Zeit bietet (Abbildung 3D).
Einige Kristallisationslösungen, die viskose Fällungsmittel wie PEGs mit hohem Molekulargewicht enthalten, können sich als schwierig zu bloten erweisen und erfordern immer längere Löschzeiten (>10 s). In solchen Fällen kann es hilfreich sein, das Volumen der auf der Rückseite des Gitters abgelagerten Flüssigkeit sowie das Volumen der Kristalllösung auf der Trägerfilmseite des Gitters zu reduzieren. Strategien wie die Verwendung von 2 Schichten Löschpapier oder Glasfasern können in diesen schwierigen Fällen auch das Blotting unterstützen31.
Während diese Pipeline für lösliche Proteinkristalle geeignet ist, stellen diejenigen, die sich in sehr viskosen Medien wie Membranproteinen in LCP bilden, eine andere Herausforderung dar, für die dieses Protokoll nicht geeignet ist. Es entstehen jedoch Strategien zur Herstellung von LCP-Kristallen auf KryoTEM-Gittern für microED, die die Verringerung der Viskosität der Proben durch Induktion einer Phasenänderung des LCP beinhalten. Auf diese Weise können die Beispiele auf raster in ähnlicher Weise wie in diesem Artikel beschrieben angewendet werden. Schließlich kann die Probe mit einem fokussierten Ionenstrahl gefräst werden, um überschüssiges nichtkristallines Material32,33,34zu entfernen.
Insgesamt dauert diese Pipeline in der Regel 1-2 Stunden (einschließlich der Einrichtungszeit der Ausrüstung), von der Probe, die bei VMXm ankommt, bis zur Bereitstellung optimierter Gitter mit gut dispergierten, verglasten Proben, abhängig von der Probenverfügbarkeit, der Konzentration der Kristalle und der Viskosität der Kristallisationslösung. Diese Methoden wurden bereits erfolgreich zur Herstellung von Mikrokristallen für Röntgenbeugungsexperimenteeingesetzt,bei denen Strahlungsschäden an Mikrokristallen untersucht wurden, bei denen ein minimales Flüssigkeitsvolumen, das die Probe umgibt, unerlässlich war28,35. Es sollte beachtet werden, dass das Protokoll auf alle löslichen Mikrokristallproben angewendet werden kann, nicht nur auf gut beugte Proben, die bereits optimiert wurden. Ein Kristallisationsexperiment, das mikrokristallines Material erzeugt, wäre traditionell ein Ziel für die Optimierung mit dem Ziel, größere Kristalle zu erhalten, aber diese Probenvorbereitungsmethode und die Fähigkeiten von VMXm können es ermöglichen, angemessene Daten aus solchen Proben ohne weitere Optimierung zu sammeln. Alternativ, wenn solche mikrokristallinen Proben schlecht streuen, könnten die von VMXm mit dieser Probenvorbereitungsmethode gesammelten Daten immer noch als nützlicher Leitfaden für die weitere Optimierung der Kristallisationsbedingungen dienen. Die Werkzeuge zur Vorbereitung von Gittern, einschließlich Glühentladung und Tauchgefrieren, sind jetzt in Forschungsinstituten, die für KryoTEM-Experimente ausgestattet sind, weit verbreitet und werden vielen Benutzern zur Verfügung stehen, so dass sie Proben vor der Strahlzeit bei VMXm vorbereiten können.

Eine wesentliche Barriere für die Bestimmung hochauflösender Strukturen biologischer Moleküle mittels makromolekularer Kristallographie (MX) bleibt die Herstellung von gut beugenden Kristallen in einer erschwinglichen Größe. Es gibt viele Strategien, um dieses Ziel zu erreichen, vom design rekombinanter Proteingenkonstrukte bis hin zu großen spärlichen Matrixsuchen nach chemischen Cocktails, die anfängliche Kristalle erzeugen können2. Bei letzterem ist es oft der Fall, dass der Kristallograph anfängliche Treffer optimieren muss, um Kristalle mit ausreichender Beugungsqualität und -größe für Strukturbestimmungsstudien zu erhalten3. Trotz dieser Optionen können einige Zielmoleküle niemals große (>10 μm), gut beugende Kristalle erzeugen, und infolgedessen muss der Kristallograph mit seinen Mikrokristallen und den Herausforderungen, die solche Proben darstellen, durchhalten. Dazu gehören die angemessene Montage und der Kryoschutz der Kristalle, die Behandlung einer von Natur aus schwächeren Beugung und eine erhöhte Strahlungsempfindlichkeit. Mikrokristalle werden aus weniger Einheitszellen und Molekülen gebildet als größere Kristalle und als solche wird die Beugung im Vergleich zu größeren Kristallen nicht im gleichen Maße verstärkt, was zu inhärent schwächeren Beugungsdichten führt. Es ist wichtig, dass das Hintergrundsignal diese Reflexionen nicht maskiert, insbesondere bei höherer Auflösung, wo schwache Reflexionsdichten verloren gehen können4. Darüber hinaus sind Mikrokristalle empfindlicher gegenüber Strahlungsschäden und trotz der Aufzeichnung der Beugung bei Flüssigstickstofftemperaturen 5 ist es möglicherweise nicht möglich, vollständige Daten voneinemEinkristall zu sammeln, so dass es notwendig ist, Daten von einer sehr großen Anzahl von Kristallen zu sammeln, um einen einzigen vollständigen Datensatz zu erstellen6.
Die zunehmende Verfügbarkeit von Röntgenlasern für freie Elektronen (XFELs) und die Entwicklung serieller Kristallographiemethoden (SFX)7 haben Wege zur Datenerfassung von kleineren Mikrokristallen geschaffen. Dies sind jedoch maßgeschneiderte Probenabgabemethoden, die ein erhebliches Maß an Hardware- und Software-Know-how erfordern, bei denen Experimente auf Raumtemperatur beschränkt sind und der Probenverbrauch in der Regel hoch ist (Hunderte von Mikrolitern) und dennoch weitere Optimierungen erfordern kann8. Daher sind Projekte, bei denen nur eine begrenzte Menge an Mikrokristallen hergestellt werden kann, für SFX nicht geeignet.
In der Zwischenzeit hat sich die Synchrotron-Beamline-Technologie in den letzten Jahrzehnten weiterentwickelt, um kleinere, stabilere Strahlen9 mit einer Brillanz zu erzeugen, die die Datenerfassung von immer kleineren Kristallen ermöglicht hat10,11. Mikrofokus-Beamlines wie FMX bei NSLS-II und I24 bei Diamond Light Source konnten neuartige Strukturen aus Kristallen mit maximalen Abmessungen von ~3 μm12 bestimmen und die Fähigkeit demonstrieren, nutzbare Daten von noch kleineren Kristallen mit einer Größe von ~1 μm13zu sammeln. Die Beamline muss präzise konfiguriert sein, mit einer exzellenten, hochauflösenden On-Axis-Betrachtungsoptik, einer minimalen Verwechslungskugel für die Probenrotation und einer präzise ausgerichteten Rotationsachse, die mit dem Röntgenstrahl zusammenfällt. Es ist wichtig, das Röntgenstrahlprofil eng an das Kristallvolumen anzupassen und sicherzustellen, dass der Kristall im Röntgenstrahl präzise ausgerichtet ist - eine Herausforderung für Kristalle <5 μm14. Die Erfüllung dieser experimentellen Bedingungen an der Beamline ist unerlässlich, um Daten von Mikrokristallen in bester Qualität aufzuzeichnen.
Der verbleibende und möglicherweise wichtigste Aspekt der Datenerhebung aus Mikrokristallen ist die Präsentation des Kristalls zum Röntgenstrahl. Mikrokristalle wurden oft auf Micromesh-Probenhalterungen montiert, die aus Polyimid hergestellt wurden, einem Röntgenstreumaterial mit Aperturen von nur 10 μm15,16. Das Polyimid-Netz ist auf einem Standardstift montiert, der in eine magnetische SPINE-Basis eingelegt ist, wodurch es mit den meisten MX-Beamlines17kompatibel ist. Die Mesh-Halterung wird verwendet, um Kristalle aus dem Kristallisationstropfen zu fischen, oft nach dem gleichen Verfahren wie die Montage eines 100-μm-Kristalls mit einer Standard-Loop-Mount. Während die Kristalle über das Netz verteilt sein können, besteht ein wesentlicher Nachteil darin, dass während der Ernte ein relativ großes Flüssigkeitsvolumen durch das Netz und den Stift getragen werden kann (Abbildung 1C, D). Dieses Flüssigkeitsvolumen, das um ein Vielfaches größer sein kann als die Kristalle selbst, trägt bei Röntgenstrahlen zu Hintergrundgeräuschen bei. Diese Hintergrundstreuung kann noch stärker sein, wenn die Flüssigkeit während der Blitzkühlung kristallines Eis bildet, wodurch das Signal-Rausch-Verhältnis bereits schwacher Dichten innerhalb der Auflösungen der Eisbeugung verringert wird. Daher ist es wichtig, dass überschüssige Flüssigkeit aus der Probe entfernt wird, um sicherzustellen, dass alle möglichen Signale aufgezeichnet werden können. Diese Herausforderung ist noch größer bei Membranproteinkristallen, die innerhalb der lipidkubischen Phase (LCP) gebildet werden, wo das LCP eine starke Hintergrundstreuung erzeugt und auch schwer aus den Kristallen entfernt werden kann 18.
Die neue Versatile Macromolecular Crystallography Microfocus (VMXm) Beamline an der Diamond Light Source bietet die Voraussetzungen, um Daten von Kristallen zu sammeln, die möglicherweise weniger als einen Mikrometer groß sind. Die Beamline wurde entwickelt, um ein Strahlprofil von 0,3 μm x 0,5 μm (VxH)1, ein Goniometer mit einer Verwirrungskugel von nicht mehr als 60 nm und eine Probenumgebung im Vakuum zu liefern. Diese Konstruktionsmerkmale der VMXm-Endstation minimieren die Erzeugung von Hintergrundröntgenrauschen durch die Beamline-Apparatur während der Datenerfassung mit der größten verbleibenden Hintergrundquelle, die von der Probe erzeugt wird14.
Spezifische Probenvorbereitungsmethoden, die für die VMXm-Beamline entwickelt wurden, bieten die Möglichkeit, diesen Hintergrund zu reduzieren und das Signal-Rauschen von Beugungsdaten weiter zu verbessern, wodurch die Qualität der Daten maximiert wird, die von Mikrokristallen mit einer Messung von <10 μm aufgezeichnet werden können. Viele der hier beschriebenen Anforderungen an die Low-Background-Beugung von Mikrokristallen sind auch für die kryogene Transmissionselektronenmikroskopie (CryoTEM)19 und die Mikrokristall-Elektronenbeugung (microED)20üblich. Infolgedessen eignen sich viele der Werkzeuge, die bereits für die Vorbereitung von KryoTEM-Proben entwickelt wurden, mit einigen Anpassungen für die Herstellung von Mikrokristallen. Bei der Vorbereitung von Proben für Einzelpartikel-KryoTEM werden die untersuchten Partikel in sehr dünne Schichten (typischerweise <100 nm) aus Glaseis eingebettet, so dass Elektronen durch die Probe übertragen können. Die dünne gleichmäßige Schicht wird durch Abtränken überschüssiger Flüssigkeit erreicht und die Vitrifizierung der Probe wird durch schnelles Abkühlen der Probe (~104 Ks-1)21durch Eintauchen in flüssiges Ethan erreicht, das bei ~93K22gehalten wird. Im Gegensatz dazu ist flüssiger Stickstoff, wie er routinemäßig für die MX-Probenvorbereitung verwendet wird, ein weniger effizientes Kryogen als Ethan und hat eine größere Neigung zur kristallinen Eisbildung innerhalb der Probe21. Die Bildung von kristallinem Eis, das die Beugung abbauen und Hintergrundgeräusche erzeugen kann, wird normalerweise durch den Einsatz von kryoschützenden Verbindungen gemildert23. Niedermolekulare Polymere wie Polyethylenglykol (PEG) 400 und Methyl-2,4-pentandiol (MPD), Zucker, Öle oder gesättigte Salze können einer aliquoten Kristallisationslösung in niedrigen Konzentrationen zugesetzt werden24- es gibt keine "Einheitslösung" für die Auswahl des am besten geeigneten Kryoprotektivums und dies erfordert oft eine Optimierung25 . Der Kristall durchläuft auch mehrere Manipulationen während des Ernte- und Kryoschutzprozesses, die zu einer Schädigung des Kristalls führen können, die Möglichkeit, flüssiges Ethan zu verwenden, ermöglicht das Weglassen dieses Schritts und trägt zum Schutz der Integrität des Kristalls bei.
Während flüssiges Ethan aufgrund der Dünnheit der Probe ein wirksames Kryogen für Mikrokristalle (<10 μm) ist, gibt es alternative Methoden zur Verhinderung der Kristalleisbildung, insbesondere in größeren Kristallen, einschließlich der Verringerung des Wassergehalts des Kristalls durch Verwendung einer streng kontrollierten feuchten Umgebung26oder durch den Ableitung überschüssiger Flüssigkeit weg von der Schleife und Oberfläche des Kristalls27 Diese erfordern jedoch wiederum eine stärkere Manipulation der Probe. Die Verwendung von automatisiertem Blotting und Tauchgefrieren mit flüssigem Ethan, wie in KryoTEM, entfernt zusammen überschüssige Kristallisationslösung und bietet ein Mittel, um Kühle von Mikrokristallen auf kontrollierte Weise zu blitzen, während versucht wird, Manipulationen zu minimieren.
Hier stellen wir ein Protokoll vor, das nicht nur von Benutzern der VMXm-Beamline und an anderen Mikrofokus-Beamlines verwendet werden kann, um daten mit hoher Signal-Rausch-Beugung zu sammeln, sondern auch für diejenigen nützlich sein kann, die lösliche Proteinkristall- und waschmittelbasierte Membranproteinkristallproben für microED-Experimente herstellen. Während bei VMXm alle Einrichtungen zur Vorbereitung und Bewertung von Proben zur Verfügung stehen, sind viele strukturbiologische Labore zunehmend für die KryoTEM-Probenvorbereitung ausgestattet. Infolgedessen gehen wir davon aus, dass einige Benutzer ihre eigenen Einrichtungen nutzen möchten, um ihre Proben für die Strahlzeit bei VMXm vorzubereiten.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated Cryo-EM plunge freezing instrument</td>
			<td>Leica or ThermoFisher</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop light microscope with light source</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade/Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 &#181;m holes</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C16nCu20-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTEM grid storage boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>146750010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12383118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>455732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharging device</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film (Parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small, fine forceps</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetting devices</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape for crystallisation plates.</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small/medium liquid nitrogen dewars</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprung circlip clipping tool</td>
			<td>Subangstrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann No.1 pre-cut filter paper</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sample preparation pipeline for microcrystals at the vmxm beamline

Die Montage von Mikrokristallen (<10 μm) für die einkristalline Kryokristallographie stellt eine nicht triviale Herausforderung dar. Verbesserungen in der Datenqualität wurden für Mikrokristalle mit der Entwicklung von Beamline-Optiken, Strahlstabilität und variabler Strahlgrößenfokussierung von Submikron bis Mikrometer beobachtet, wie bei der VMXm-Beamline an der Diamond Light Source1. Weitere Verbesserungen der Datenqualität werden durch Verbesserungen der Probenumgebung und der Probenvorbereitung erzielt. Mikrokristalle erzeugen von Natur aus eine schwächere Beugung, daher ist die Verbesserung des Signal-Rauschens der Schlüssel zur Erfassung hochwertiger Röntgenbeugungsdaten und wird hauptsächlich durch die Verringerung des Hintergrundrauschens entstehen. Hauptquellen für Röntgenhintergrundgeräusche in einem Beugungsexperiment sind ihre Wechselwirkung mit dem Luftweg vor und nach der Probe, überschüssige Kristallisationslösung, die die Probe umgibt, das Vorhandensein von kristallinem Eis und Streuung von anderen Beamline-Instrumenten oder Röntgenfenstern. Die VMXm-Beamline umfasst Instrumentierung und ein Probenvorbereitungsprotokoll, um all diese Rauschquellen zu reduzieren.
Erstens entfernt eine In-Vakuum-Probenumgebung bei VMXm den Luftweg zwischen Röntgenquelle und Probe. Als nächstes verwenden Probenvorbereitungsprotokolle für die makromolekulare Kristallographie bei VMXm eine Reihe von Prozessen und Werkzeugen, die von kryoTEM angepasst wurden. Dazu gehören Kupfergitter mit löchrigen Kohlenstoffträgerfolien, automatisiertes Blotting und Tauchkühlrobotik unter Verwendung von flüssigem Ethan. Diese Werkzeuge ermöglichen die Herstellung von Hunderten von Mikrokristallen auf einem einzigen KryoTEM-Gitter mit minimaler Umgebungsflüssigkeit auf einer geräuscharmen Unterstützung. Sie minimieren auch die Bildung von kristallinem Eis aus der verbleibenden Flüssigkeit, die die Kristalle umgibt. Wir stellen das Verfahren zur Vorbereitung und Beurteilung der Qualität löslicher Proteinmikrokristalle mit sichtbarem Licht und Rasterelektronenmikroskopie vor, bevor die Proben für Röntgenbeugungsexperimente auf die VMXm-Beamline montiert werden. Wir werden auch Beispiele für qualitativ hochwertige Proben sowie solche, die weitere Optimierungen und Strategien erfordern, zur Verfügung stellen.

Ziel dieses Protokolls ist es, verglaste Mikrokristalle mit einem minimalen Flüssigkeitsvolumen zu erreichen, das den Kristall umgibt und Röntgenbeugungsexperimente mit minimaler Hintergrundstreuung zur Verbesserung des Beugungssignals ermöglicht. Beispiel-REM-Bilder von Mikrokristallen, die auf KryoTEM-Gittern für minimale Hintergrundstreuung vorbereitet wurden, sind in Abbildung 1A, B und Abbildung 2 dargestellt. Netze mit gleichmäßig verteilten Einkristallen bieten die effizienteste Nutzung des Netzes mit gutem Signal-Rauschen. Dies ist jedoch in der Regel nicht über das gesamte Raster hinweg möglich, und einige Regionen können eine gewisse Verklumpung aufweisen (Abbildung 2A, B). Trotz dieser Verklumpung zeigen diese Beispiele immer noch eine nützliche Anzahl von isolierten Einzelkristallen, die eine niedrige Hintergrundbeugung bieten (Abbildung 5). Der Grad des Blottings, der immer noch eine niedrige Hintergrundstreuung beibehält, kann variieren. Starkes Blotting, so dass die Löcher im Kohlenstoffträgerfilm deutlich sichtbar sind, die Kristalle aber hydratisiert bleiben, ist das Ziel (Abbildung 2C,D). Qualitativ hochwertige Gitter können jedoch immer noch etwas Flüssigkeit in den Löchern der Trägerfolie anzeigen, obwohl die Position der Löcher immer noch erkennbar sein sollte (Abbildung 2A, B). Wichtig ist, dass alle diese Beispiele einzelne, isolierte Kristalle mit einem verglasten Flüssigkeitshalos zeigen, der den Kristall umgibt, um die Hydratation zwischen Blotting und Tauchgefrieren aufrechtzuerhalten.
Viele Proben erfordern möglicherweise eine weitere Optimierung (Abbildung 3), die eine Variation der Löschzeit oder der Konzentration der Mikrokristalle umfassen kann. Mit Kristallen überladene Gitter zeigen eine verminderte Blotting-Effizienz und können dazu führen, dass mehrere Gitter in Einzelbeugungsbildern aufgezeichnet werden (Abbildung 3A,B). Viskosere Kristallisationsbedingungen, wie die für Trypsin, das 8% PEG 4000 und 15% Ethylenglykol enthält(Abbildung 3C),können zu längeren Löschzeiten (>10 s) führen. Umgekehrt können Kristallisationsbedingungen mit sehr niedriger Viskosität, die sehr schnell abplatzen, aufgrund der Schwerkraft zu Verteilungsproblemen führen, die zu Einem absetzen, bevor blotting auftritt, was dazu führt, dass sich alle Mikrokristalle entlang einer Seite des Gitters absetzen (Abbildung 3D).
Durch die optimale Probenvorbereitung können die vollen Möglichkeiten von VMXm genutzt werden, um qualitativ hochwertige Röntgenbeugungsdaten mit höchstmöglicher Auflösung bei hohem Signal-Rauschen zu sammeln (Abbildung 5). Diese Proben profitieren von der Kompatibilität mit der Umgebung im Vakuum, was zu sehr niedrigen oder null durchschnittlichen Hintergrundzahlen in Beugungsbildern führt. Die Verwendung von flüssigem Ethan ohne Kryoschutzmittel führt zu einem Fehlen von Eisringen (Abbildung 5), obwohl dort, wo Kristalle in der Nähe der Kupfergitterstäbe liegen, der Röntgenstrahl die Stäbe sehen kann, was zu Kupferpulverbeugungsringen bei ~ 2,1 Å und ~ 1,8 Å führt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig01.jpg"> Abbildung 1: Vergleich der Mikrokristallmontage auf Micromesh-Halterungen und CyoTEM-Gittern. Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von gefrorenen Mikrokristallen von Polyedern des Virus mit einer Größe von 2,5 μm über(A, B)5 kV Beschleunigungsspannung, einer Spotgröße von 39 (beliebige Einheiten) und einer Verweilzeit von 16 μs. Das Gitter ist frei von überschüssiger Flüssigkeit (A), ein schmaler Halo von Flüssigkeit wird beobachtet, der die Kristalle umgibt (B). Die gleichen Proben, die vor der Blitzkühlung in flüssigem Stickstoff auf einem Mikromesh (20 μm Öffnungen) montiert und mit dem On-Axis-Viewing-System an der Beamline I24 face-on (C) und side on (D) beobachtet wurden. Die optischen Verzerrungen (C) beim Betrachten von Face-on geben einen Hinweis auf das Ausmaß der Flüssigkeitsdicke über das Micromesh, dies ist deutlicher, wenn das Micromesh side-on (D) betrachtet wird. Das rote Ziel in C und D stellt die Position und Größe des Röntgenstrahls dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig02.jpg"> Abbildung 2: Beispiele für Proben guter Qualität. Polyederkristalle (A) beobachtet über ein einzelnes ~ 100 μm Gitterquadrat. Während einige der Kristalle leicht verklumpt sind und eine gewisse Konnektivität der umgebenden Flüssigkeit zeigen, gibt es eine Reihe von isolierten Einkristallen mit einem kleinen Flüssigkeitshalo, der den Kristall umgibt. Etwas größere Insulinkristalle (B) mit den Maßen ~ 5 x 5 μm zeigen ebenfalls eine gewisse Verklumpung, aber auch hier gibt es gut isolierte Einzelkristalle. Nadelkristalle können eine sehr enge Dimension haben und benötigen einen Mikrostrahl, wie diese nadelförmigen Lysozymkristalle (C). Ein schmales Flüssigkeitsband umgibt diese Kristalle (hellgrauer Halo). Größere Mikrokristalle bis zu Dutzenden von Mikrometern können auch gut auf KryoTEM-Gittern montiert werden, wie diese ~ 7 μm Proteinase K Kristalle (D). Sowohl in (C) als auch in (D) und in geringerem Maße in (A) sind die Löcher des Kohlenstoffträgerfilms deutlich sichtbar, was das Vorhandensein von sehr wenig/keiner Flüssigkeit zeigt. In Beispiel B werden zwar keine leeren Löcher beobachtet, aber die Position der Löcher kann immer noch identifiziert werden, was darauf hindeutet, dass die Flüssigkeit nur die Löcher in der Trägerfolie füllt. In all diesen Beispielen ist ein Halo aus Flüssigkeit um den Rand des Gitterquadrates (ein abgerundetes inneres Quadrat) zu sehen, wo die Löcher ein helleres graues Aussehen haben. Dies ist ein gemeinsames Merkmal gut vorbereiteter Gitter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig03.jpg"> Abbildung 3: Beispiele für Proben, die einer weiteren Optimierung bedürfen. Mit Mikrokristallen überladene Gitter (A, B) können die Hintergrundstreuung erhöhen, da die Proben die Löcher in der Trägerfolie blockieren, wodurch die Blotting-Effizienz verringert wird, und bei einer höheren Oberflächenspannung zwischen den Kristallen bleibt mehr Flüssigkeit übrig. Neben einer Verschlechterung des Signal-Rauschens, die zu einem Informationsverlust führt, ist es wahrscheinlich, dass mehrere Gitter aufgezeichnet werden. Die Verwendung einer Löschzeit, die nicht lang genug ist, oder einer hochviskosen Kristallisationslösung kann zu einer zu nassen Probe (C) führen, die auch ein geringes Signal-Rauschen erzeugt. Kristallisationsbedingungen ohne Abscheidungsmittel, wie die für Rinderinsulin (D), haben eine sehr niedrige Viskosität. Dies führt zwar zu einer sehr kurzen Löschzeit, kann aber aufgrund der Auswirkungen der Schwerkraft auch zur Bewegung von Kristallen über das Gitter vor und während des Blottens führen. Dies führt in der Regel zu einem weitgehend leeren Gitter mit einer hohen Konzentration von Kristallen entlang einer Kante (D). Es kann vorteilhaft sein, der Kristallaufschlämmung kurz vor dem Auftragen auf das Gitter ein viskoses Mittel wie Ethylenglykol hinzuzufügen, um den Kristallfluss zu reduzieren und die Verteilung der Kristalle zu verbessern. Dies kann auch die Löschzeit verlängern, was die Beobachtung des Blottings erleichtert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig04.jpg"> Abbildung 4:Tools zum Laden von Beispielen bei VMXm. Ein maßgeschneiderter Satz von Tools wurde entwickelt, um die VMXm-Probenhalter (A) zu laden. Der Sample Loader (B) bietet Platz für einen einzelnen VMXm Probenhalter, eine Gridbox und einen Werkzeugspeicher während der Arbeit. Es ist auch so konzipiert, dass es direkt unter der Oberfläche des flüssigen Stickstoffs arbeiten und die Probenkartusche unter (B) passen kann. Die Luftschleuse dewar (C), die in die Stickstoffgasbox der Schleuse auf der VMXm-Endstation passt, wird verwendet, um die beladene Probenkartusche vom Labor zum Beamline-Versuchsstall zu bringen. Um Proben im Offline-REM zu betrachten, wurde ein maßgeschneidertes Shuttle (D) bestehend aus dem VMXm-Probenhalter ohne Basis hergestellt, um eine Beurteilung im Probenhalter zu ermöglichen, der auf der Beamline verwendet wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig05.jpg"> Abbildung 5: Beispielbeugung von Mikrokristallen bei VMXm. Ein einzelnes Beugungsbild, das mit einem Pilatus 3 6M-Detektor bei VMXm eines ~3 μm Virus-Polyederkristalls aufgenommen wurde, der mit der Plunge-Freezing-Methode auf einem KryoTEM-Gitter montiert ist. Die Beugung wird bis über 1,7 Å hinaus beobachtet und eine Reflexion (blaues Quadrat) bei 1,74 Å wird eingelassen, was die geringe Hintergrundstreuung mit einer hohen Anzahl von Pixeln mit Nullzählungen zeigt. Ethylenglykol mit einer Endkonzentration von 50% v/v wurde der Kristallaufschlämmung zugesetzt, bevor es auf das Gitter auftönt wurde. Der niedrige Hintergrundcharakter der VMXm-Probenposition wird durch den konstanten Hintergrund im gesamten Bild veranschaulicht, wie durch Die unter der blauen gestrichelten Linie dargestellten Dichten, sogar in der Nähe des Strahlzentrums, dargestellt wird. Die geplotteten Intensitäten zeigen, dass der Hintergrund unter 3 Zählungen bleibt. Bei 2,15 Å und 1,86 Å werden zwei schwache Ringe beobachtet, die durch Pulverbeugung des Kupfers des KryoTEM-Gitters erzeugt werden. Es gibt keine nachweisbaren Eisringe, was die Wirksamkeit des Blottings mit anschließender Kühlung mit flüssigem Ethan zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Das Signal-Rausch-Verhältnis von Daten ist eine der wichtigsten Überlegungen bei der Durchführung von Röntgenbeugungsmessungen an Mikrokristallen. Die VMXm-Beamline bietet eine geräuscharme Umgebung und mikrostrahlend für solche Experimente. Hier beschreiben wir Probenvorbereitungsmethoden zur Montage und Kühlung von Mikrokristallen für VMXm und andere makromolekulare Kristallographie-Beamlines mit Mikrofokus.

Eine Probenvorbereitungspipeline für Mikrokristalle an der VMXm-Beamline

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Die Standardprobenvorbereitung erschwert es, bei Röntgenbeugungsexperimenten von Mikrokristallen ein gutes Signal-Rausch-Signal zu erreichen. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Quellen von hintergrundgeformten Kristallen kontrolliert zu reduzieren. Der Einsatz von Stanzgefrierrobotern und KryoTEM-Gittern bietet eine robuste Plattform für die wiederholte Manipulation der Mikrokristalle, die Reduzierung des umgebenden Flüssigkeitsvolumens und eine schnelle Vitrifizierung der Probe.Die Geschicklichkeit, die für den Umgang mit Gittern erforderlich ist, ähnelt der für die traditionelle Kristallernte. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Bestimmung der anfänglichen Blotting-Parameter mit der Kristallisationslösung, die der Schlüssel zur Reduzierung des Probenverbrauchs ist. Um zu beginnen, richten Sie den automatisierten Tauchfroster gemäß den Anweisungen des Herstellers ein und kühlen Sie ihn.Kurz vor Gebrauch entladen Sie die cryoTEM-Gitter für 25 Sekunden mit einem Strom von 15 Milliampere und einem Druck von 0,39 Millibar und halten dann die Glühentladungsgitter in einer abgedeckten Petrischale. Stellen Sie die relative Luftfeuchtigkeit der Probenkammer auf 90% und die Löschzeit auf fünf Sekunden ein. Stellen Sie sicher, dass der Tauchfroster so eingestellt ist, dass die Probe nach Abschluss des Löschvorgangs automatisch eingetaucht ist.Öffnen Sie die Dichtung des Kristallisationsbrunnens und des Reservoirs. Fügen Sie schnell zwei bis fünf Mikroliter der Reservoirlösung in den Kristalltropfen hinzu, um das Volumen des Tropfens zu erhalten. 10 Mikroliter der Reservoirlösung zur späteren Verwendung in ein 0,5-Milliliter-Röhrchen geben und den Brunnen wieder veralten, um zu verhindern, dass der Kristallisationstropfen austrocknet.Verwenden Sie die Tauchgefrierzzette, um ein einzelnes Glühentladungsgitter auszuwählen und das Gitter im Instrument zu laden, wobei die Kohlenstoffseite vom Löscharm abwandt. Drehen Sie die Zette, die das Gitter hält, so, dass die Carbonseite dem Löscharm zugewandt ist. Verwenden Sie eine 2,5-Mikroliter-Pipette, um zwei Mikroliter Reservoirlösung auf die nicht unterstützende Seite des KryoTEM-Gitters aufzutragen.Drehen Sie das Gitter mit der Vom Löscharm weggerichteten Kohlenstoffseite und tragen Sie die Reservoirflüssigkeit vorsichtig auf die Kohlenstofffilmträgerseite des Gitters auf. Initiieren Sie den Blotting-Prozess und beobachten Sie die Flüssigkeit, die von der Kohlenstoffoberfläche gezogen wird, bis die Welle des Knallens über die Oberfläche des Gitters sichtbar ist. Wenn die Popping-Welle nicht sichtbar ist, erhöhen Sie die Löschzeit um ein bis zwei Sekunden, bevor sich der Löscharm aus dem Raster zurückzieht.Legen Sie die Kristallisationsplatte unter das Lichtmikroskop und positionieren Sie das Ziel gut im Sichtfeld. Legen Sie ein frisches Glühentladungsgitter in den Tauchgefrierschrank und tragen Sie die Reservoirflüssigkeit wie zuvor gezeigt auf die nicht stützende Seite des Gitters auf. Drehen Sie das Gitter mit der Carbonfolienträgerseite zum Probenanschluss des Tauchgefrierschranks.Schälen Sie die temporäre Versiegelung von der Kristallisationsplatte und verwenden Sie die pipetten gesetzte Pipette, um den Kristallisationstropfen wiederholt sanft anzusaugen. Zwei Mikroliter der abgesaugten Mikrokristallaufschlämmung in den Tauchfroster übertragen und die gesamte Probe auf die Kohlenstoffseite des KryoTEM-Gitters auftragen. Initiieren Sie das Blotting und beobachten Sie die Welle des Knallens, dann leiten Sie sofort das Eintauchen ein.Übertragen Sie das Gitter schnell vom flüssigen Ethan in die gitterbox, die in flüssigen Stickstoff getaucht ist. Ziehen Sie nach dem Ablöschen und Einfrieren des Gitters das eingetauchte Gitter aus dem flüssigen Ethan zurück, indem Sie den Tauchfroster zurücksetzen. Entfernen Sie die Zette, die das Gitter aus dem Tauchgefrierschrank hält, und legen Sie das Gitter unter das Lichtmikroskop.Passen Sie den Feinfokus an und beurteilen Sie die Dichte der Kristalle über das Gitter. Nachdem Sie das CryoTEM-Gitter in das REM geladen haben, richten Sie die Probe aus und schalten Sie den Elektronenstrahl ein. Bewerten Sie zunächst das gesamte Raster mit einer 45-fachen Vergrößerung und zeichnen Sie das Bild auf, dann erhöhen Sie die Vergrößerung für eine genauere Betrachtung der einzelnen Gitterquadrate, bis die einzelnen Kristalle deutlich beobachtet sind.Bewegen Sie sich um das Gitter und erfassen Sie die Standbilder, um sicherzustellen, dass die Gitter flach sind und die Kohlenstoffträgerfolie weitgehend intakt ist. Stellen Sie sicher, dass sich zahlreiche Einkristalle mit einem schmalen Halo aus verglaster Flüssigkeit um den Kristall herum befinden und die Löcher im Kohlenstoffträgerfilm sichtbar sind. Stellen Sie bei der Beobachtung und Aufnahme der Bilder des Gitters sicher, dass die großen Bereiche der verglasten Flüssigkeit fehlen, hexagonales Eis oder Oberflächeneis nicht über das Gitter verstreut ist und dass sich die Kristalle nicht überlappen und gleichmäßig über den Trägerfilm verteilen.Kühlen Sie in einem großen Schaumstoff-Dewar die erforderliche Anzahl von VMXm-Probenhaltern, die in die Probenkartusche geladen sind. Fügen Sie flüssigen Stickstoff über der Probenposition im Probenlader hinzu. Übertragen Sie die Gitterbox mit mikrokristallbeladenen Gittern schnell in die Gitterkastenmulde am Probenlader und schrauben Sie den Deckel leicht ab, um den Deckel locker und drehbar zu halten.Heben Sie das Gitter aus dem Rasterkasten und drehen Sie das Gitter, um das Gitter flach auf den Probenhalter zu legen. Legen Sie das vorgekühlte circlip-Werkzeug schnell über das Gitter in der Rasteröffnung und drücken Sie die Taste, um den circlip zu installieren. Fügen Sie flüssigen Stickstoff etwa 1,5 Zentimeter über dem Probenhalter hinzu.Verwenden Sie die VMXm-Probenzette, um den geladenen Probenhalter vorsichtig anzuheben und wieder in die Probenkassette zu legen. Ersetzen Sie den Deckel der Patrone und stellen Sie sicher, dass der Stift auf der Oberseite der Patrone mit dem Loch im Deckel eingreift. Die Rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen von Mikrokristallen, die auf KryoTEM-Gittern hergestellt wurden, zeigten eine minimale Hintergrundstreuung.Das Gitter war frei von überschüssiger Flüssigkeit und ein schmaler Flüssigkeitshalos wurde beobachtet, der die Kristalle umgab. Die polyedrischen Kristalle wurden sowohl einzeln als auch in Klumpen beobachtet. Etwas größere Insulinkristalle zeigten auch eine gewisse Verklumpung zusammen mit isolierten Kristallen.Sehr große Mikrokristalle wurden auch erfolgreich auf KryoTEM-Gittern montiert. Die Löcher in der Kohlenstoffträgerfolie waren deutlich sichtbar, was auf eine starke Blottung hindeutet. Viele Proben erforderten eine weitere Optimierung aufgrund der unterschiedlichen Löschzeit und Konzentration der Mikrokristalle.Die mit Kristallen überlasteten Gitter verringern die Blotting-Effizienz und mehrere Gitter wurden in einem einzigen Beugungsbild aufgezeichnet. Kurze Löschzeit für hochviskose Kristallisationslösungen kann zu einer zu nassen Probe führen. Bei einer Kristallisationslösung mit niedrigerer Viskosität führt eine kurze Löschzeit zum Diebstahl von Mikrokristallen auf einer Seite der Gitter.Eine optimale Probenvorbereitung ermöglicht es, die volle Leistungsfähigkeit von VMXm auszuschöpfen, um hochwertige Röntgenbeugungsdaten mit höchstmöglicher Auflösung bei hohem Signal-Rausch-Verhältnis zu sammeln. Die Bestimmung des anfänglichen Blottings einer Kristallisationslösung ist der Schlüssel zur Verwendung einer minimalen Probe. Wenn die Probe sehr begrenzt ist, überspringen Sie die Dichtebewertung.Letztendlich ist es besser, eine verdünnte Probe zu haben. Diese Proben sind nun bereit für Röntgenbeugungsexperimente an der VMXm Beamline, Mikrokristall-Elektronenbeugung oder fokussiertes Ionenstrahlfräsen vor der Mikro-ED.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Herstellung und Lieferung von Protein Microcrystals in Lipidische Cubic Phase für Serial Femtosekunden Kristallographie

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Forschung

Biochemie

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Eine Plasma-Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie mit einer automatisierten Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Zellkultur auf Siliziumnitridmembranen und Kryovorbereitung für Synchrotron-Röntgenfluoreszenz Nano-Analyse

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Workflow und Tools für das kristallographische Fragmentscreening am Helmholtz-Zentrum Berlin

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Probenvorbereitung mit einer Lipid-Monolayer-Methode für elektronenkristallographische Untersuchungen

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...