Name: a sample preparation pipeline for microcrystals at the vmxm beamline
Uploaded: 2021-06-17T13:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline at JoVE.com

המחברים רוצים להודות לג'רמי קיוון, ג'ון גריימס, ג'ף סאטון ודייב סטיוארט, אוניברסיטת STRUBI של אוקספורד ורייצ'ל בולטון, אוניברסיטת סאות'המפטון על שסיפקו באדיבות דוגמאות מיקרוקריסטליות לפיתוח והדגמה של שיטות הכנה לדוגמה עבור קו הקרן VMXm בנוסף לאפשר הזמנת קו הקורה. המחברים גם רוצים להודות ל- iNEXT-Discovery (מספר פרוייקט 871037) על ההזדמנות והתמיכה בפרסום כתב יד זה.

<ol>
	<li>Laundy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multi-lane+X-ray+mirror+providing+variable+beam+sizes.">Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+conditions+for+biological+macromolecules.">Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).</li><li>Holton, J. M., Frankel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+crystal+size+needed+for+a+complete+diffraction+data+set.">The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set.</a> Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).</li><li>Garman, E. F., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryocooling+and+radiation+damage+in+macromolecular+crystallography.">Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).</li><li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+indexing+multi-lattice+diffraction+data.">New methods for indexing multi-lattice diffraction data.</a> Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).</li><li>Chapman, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-Ray+Free-Electron+Lasers+for+the+Structure+and+Dynamics+of+Macromolecules.">X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).</li><li>Beale, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+sample+preparation+for+serial+crystallography+experiments.">Successful sample preparation for serial crystallography experiments.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).</li><li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-crystallography+comes+of+age.">Micro-crystallography comes of age.</a> Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).</li><li>Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+synchrotron+radiation+instrumentation+for+MX+experiments.">Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).</li><li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), 496 (2019).</li><li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin.">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyhedra+structures+and+the+evolution+of+the+insect+viruses.">Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses.</a> Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).</li><li>Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The design of macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).</li><li>. MiTeGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.mitegen.com/product/micromeshes/">https://www.mitegen.com/product/micromeshes/</a> (2020)</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+manipulation+and+data+assembly+for+robust+microcrystal+synchrotron+crystallography.">Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography.</a> IUCrJ. 5, 238-246 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+the+lipid+cubic+phase+or+in+mesomethod+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+and+complexes.">A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).</li><li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology.">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li><li>Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+methodology+and+development.">MicroED methodology and development.</a> Structural Dynamics. , 1-8 (2020).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cryogen+for+plunge+freezing.">An improved cryogen for plunge freezing.</a> Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).</li><li>Garman, E. F., Schneider, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Cryocrystallography.">Macromolecular Cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).</li><li>Pflugrath, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+macromolecular+cryocrystallography.">Practical macromolecular cryocrystallography.</a> Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).</li><li>Alcorn, T., Juers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+rational+methods+of+cryoprotection+in+macromolecular+crystallography.">Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+improvements+in+order+and+diffraction+limit+of+crystals+of+bovine+mitochondrial+F(1)-ATPase+by+controlled+dehydration.">Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration.</a> Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).</li><li>Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cryocooling+of+naked+crystals:+are+cryoprotection+agents+always+necessary.">Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary.</a> Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).</li><li>Beale, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+as+a+method+for+sample+visualization+in+protein+X-ray+crystallography.">Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography.</a> IUCrJ. , 1-9 (2020).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Global+and+Site-Specific+Radiation+Damage+in+Cryo-EM.">Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM.</a> Structure. 26 (5), 759-766 (2018).</li><li>Sanchez-Weatherby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diffraction+by+humidity+control:+a+novel+device+compatible+with+X-ray+beamlines.">Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines.</a> Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).</li><li>Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through-grid+wicking+enables+high-speed+cryoEM+specimen+preparation.">Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Determination+from+Lipidic+Cubic+Phase+Embedded+Microcrystals+by+MicroED.">Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED.</a> Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).</li><li>Polovinkin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+electron+diffraction+from+membrane+protein+crystals+grown+in+a+lipidic+mesophase+after+lamella+preparation+by+focused+ion+beam+milling+at+cryogenic+temperatures.">Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).</li><li>Storm, S. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy-dependent+photoelectron+escape+in+microcrystals.">Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals.</a> IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים להצהיר.

פרוטוקול זה מדגים כיצד כלים מהכנת מדגם cryoTEM יכולים לשמש להכנת מיקרוקריסטלים לניסויי עקיפה של קרני רנטגן בקווי קרן מיקרופוקוס. מכשור קו קרן סטנדרטי מרוכז סביב מדגם רכוב על סיכה ובעוד נעשו מאמצים לספק תמיכה לדוגמה על תושבות אלה עבור microcrystals, הם לעתים קרובות מאתגר לטעון עם מדגם תוך הקפדה כי האות הגבוה ביותר לרעש מושגת (איור 1C,D). רבות מהדגימות הללו עשויות גם לדרוש אופטימיזציה של תנאי ההגנה מפני הקפאה כדי להבטיח את המדגם הוא הזגום. שיטת הקפאת הצלילה מספקת דרך חוזרת להסיר נוזלים עודפים ולקרר את המדגם בקריוגן יעיל(איור 1A,B). בעוד שהרשת יכולה להיות מותקנת על קו קרן סטנדרטי עם הרכבה על פינים על פינצטה, מחזיקי דגימת VMXm תוכננו במיוחד כדי לקבל רשתות ולהחזיק אותם מתחת לטמפרטורת המעבר מזכוכית בסביבת ואקום באמצעות קירור מוליך. הסביבה לדוגמה של VMXm מאפשרת איסוף נתוני רקע נמוך, כאשר המדגם הוא המקור הנותר של הרקע, ומספק מיקרואורגניזמים שניתן להשתמש בו כדי להתאים גבישים עם ממדים פחות מ 10 מיקרומטר. שיטת הכנת מדגם זו יכולה לשמש גם להכנת nanocrystals עבור עקיפה אלקטרונים שבו יש גם דרישה נוזל עודף מעט מאוד מדגם הזגוגית בשל חדירה חלשה של אלקטרונים. בעוד רשתות cryoTEM שבריריות, אלה מנוסים בקציר של גבישים בלולאות יסתגלו במהירות לטיפול ברשתות. עם כמות קטנה של ניסיון, כמה רשתות יאבדו במהלך שלבי הכתם, ההקפאה והעמסה של הפרוטוקול. עם זאת, שלבי האופטימיזציה חיוניים להצלחה זו והכנה זהירה יפחיתו את הסיכויים לאבד גבישים או להפחית את שלמות הגביש.
רשתות CryoTEM מספקות הרכב יחיד גדול יחסית שיכול להכיל מאות רבות של גבישים, ובכך לשפר את התפוקה שבה ניתן רק לתעד טריז קטן של נתוני עקיפה. רשת אחת עשויה גם לספק מספיק גבישים כדי לקבוע את מבנה החלבון, במיוחד בגבישים של סימטריה גבוהה. כאשר רק טיפת התגבשות אחת או שתיים בודדות יצרו מיקרוקריסטלים, ניסיון כתמים של מצב התגבשות לבד יכול לעזור להבטיח כי כאשר microcrystals הם blotted, הזמנים המשמשים קרובים ככל האפשר לאלה הדרושים כדי ליצור דגימות באיכות טובה ראשונית. תומכי סרט הפחמן אינם נראים לצילומי רנטגן וזמינים עם מרווח חורים שונה, אשר ניתן להשתמש בהם כדי להתאים למורפולוגיה מסוימת. בדרך כלל אנו משתמשים בסרטי תמיכה עם 2 חורי מיקרומטר בריווח של 2 מיקרומטר, אך חורים קטנים יותר עם מרווח גדול יותר עשויים להתאים יותר לגבישים הקטנים מ- 2 מיקרומטר. סרטי תמיכה אחרים כגון אלה עם חורי 1 מיקרומטר עם מרווח של 4 מיקרומטר, כמו גם סרטי תמיכה עם חורים בצורת שונה זמינים, כל אלה ישפיעו על זמן הכתם. רשת רשת מרובעת בגודל של 200 (200 ריבועים לאינץ') מספקת גם מספיק מקום (~ 100 מיקרומטר) בין מוטות רשת הנחושת, כך שקרן הרנטגן אינה מקיימת אינטראקציה חזקה עם הנחושת תוך מתן תמיכה מבנית מספקת לסרט הפחמן העמוס בגבישים. השימוש באתאן נוזלי שולל את הצורך cryoprotectants, אשר בתורו מפחית את הדרישה על נפח המדגם כי היה בשימוש באופטימיזציה של תנאים cryoprotectant.
הפרמטרים העיקריים שיש למטב במהלך התהליך הם זמני הכתם ודילול המדגם. זמני הכתמים צריכים להיות ארוכים מספיק כדי לצפות בהשפעה 'קופצת' על פני כל הרשת לפני הקפאת הצלילה. סופג מעל יכול לגרום להתייבשות של הגבישים, עם זאת, שליטה על הלחות בתוך תא המדגם משמש כדי למזער את האפקט הזה. אמנם הוא הציע כי לחות יחסית של 90% בשימוש, כמה דגימות עשוי להפיק תועלת אופטימיזציה של הלחות. הלחות עשויה להשפיע על יעילות הכתם של נייר סופג אשר יכול לאט להיות רווי במים. בנוסף, בקרת לחות בתוך תא המדגם יכול לשמש כדי לשפר את איכות עקיפה של גבישים30. מומלץ לבצע שינויים קטנים (<5%) בלחות לפני בדיקת תקינות עקיפה כדי להבטיח שאיכות עקיפה לא תיפגע.
אופטימיזציה של דגימות לא יקרות יכולה להתבצע באמצעות מיקרוסקופ אור במקום SEM. למרות הרסני, זה שימושי להערכת צפיפות הגבישים על פני הרשת ולאפשר קבלת החלטות אם מדגם צריך להיות מדולל או מרוכז כדי לפזר טוב יותר גבישים על פני הרשת. שלב זה הוא שימושי ביותר כאשר יש מספר רב של גבישים זמינים במיוחד דגימות מרוכזות מאוד. יש להימנע מהתנגשות של גבישים (איור 3),שכן אמנם אין בעיה משמעותית אם שני גבישים מוארים בו זמנית במהלך איסוף הנתונים6,אך סביר להניח שיהיה נפח גדול יותר של נוזל המקיף את הגוש, ובכך להפחית את האות לרעש(איור 5). בעוד שניתן לצפות בהפרזות גדולות של נוזל ברחבי העולם על פני הרשת באמצעות מיקרוסקופ אור, הערכת נפח הנוזל המקיף את microcrystals ואת נוכחותו של קרח גבישי יכול להיעשות רק באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים מצויד מערכת העברת ואקום קריוגני שלב. לפעמים, לאחר יישום הגבישים לרשת ולפני סופג מתרחשת, גבישים בפתרונות צמיגות נמוכה עשויים להתיישב לאורך קצה אחד של הרשת. גילינו שהוספת ריכוז סופי של 50% של אתילן גליקול יכולה להאט את תנועת הגבישים דרך הטיפה, להבטיח חלוקה טובה יותר של מיקרוקריסטלים ברחבי הרשת, כמו גם לספק שליטה רבה יותר על הכתמים על ידי הגדלת זמן ההכתמה (איור 3D).
כמה פתרונות התגבשות המכילים סוכני מזרז צמיג כגון PEGs במשקל מולקולרי גבוה יכול להוכיח מאתגר כתם, הדורש יותר ויותר פעמים סופגות ארוכות (>10 s). במקרים כאלה, זה יכול להיות מועיל כדי להפחית את נפח הנוזל המופקד על הגב של הרשת, כמו גם את נפח של הגביש המכיל פתרון לצד סרט התמיכה של הרשת. אסטרטגיות כגון שימוש 2 שכבות של נייר סופג או סיבי זכוכית עשוי גם לסייע blotting במקרים קשים אלה31.
בעוד צינור זה מתאים גבישי חלבון מסיסים, אלה שנוצרים במדיומים צמיגים מאוד כגון חלבוני ממברנה ב LCP מציגים אתגר אחר שעבורו פרוטוקול זה אינו מתאים. עם זאת, אסטרטגיות מתגבשות להכנת גבישי LCP על רשתות cryoTEM עבור microED הכוללים הפחתת הצמיגות של הדגימות על ידי גרימת שינוי פאזה LCP. הדבר מאפשר להחיל את הדגימות על רשתות באופן דומה לזה המתואר במאמר זה. לבסוף, המדגם יכול להיות כרסום עם קרן יון ממוקדת כדי להסיר עודף חומר שאינו קריסטל32,33,34.
בסך הכל, צינור זה ייקח בדרך כלל 1-2 שעות (כולל זמן התקנת ציוד) לעקוב מן המדגם המגיע VMXm כדי לספק רשתות ממוטבות עם דגימות מפוזרות היטב, vitrified, בהתאם לזמינות מדגם, ריכוז הגבישים ואת הצמיגות של פתרון התגבשות. שיטות אלה כבר הועסקו בהצלחה להכנת microcrystals לניסויי עקיפה קרני רנטגן לחקור נזקי קרינה על microcrystals שבו נפח מינימלי של נוזל סביב המדגם היה חיוני28,35. יש לציין כי הפרוטוקול יכול להיות מיושם על כל דגימות microcrystal מסיס, לא רק כדי לנטרל היטב דגימות שכבר עברו אופטימיזציה. ניסוי התגבשות המייצר חומר microcrystalline באופן מסורתי יהיה יעד לאופטימיזציה במטרה להשיג גבישים גדולים יותר, עם זאת, שיטת הכנת מדגם זו ואת היכולות של VMXm עשוי לאפשר איסוף נתונים נאותים מדגימות כאלה ללא אופטימיזציה נוספת. לחלופין, אם דגימות microcrystalline כאלה diffract בצורה גרועה, הנתונים שנאספו מ- VMXm באמצעות שיטת הכנה מדגם זה עדיין יכול לשמש מדריך שימושי לאופטימיזציה נוספת של תנאי התגבשות. הכלים להכנת רשתות, כולל פריקת זוהר והקפאת צלילה זמינים כעת באופן נרחב במכוני מחקר המצוידים בניסויי cryoTEM ויהיו זמינים למשתמשים רבים המאפשרים להם להכין דגימות לקראת זמן הקרן ב- VMXm.

מחסום מרכזי לקביעת מבנים ברזולוציה גבוהה של מולקולות ביולוגיות על ידי קריסטלוגרפיה מקרומולקולרית (MX) נשאר הייצור של גבישים מפוזרים היטב בגודל נוח. ישנן אסטרטגיות רבות להשגת מטרה זו מעיצוב מבנה גן חלבון רקומביננטי דרך חיפושי מטריצה דלילה גדולים אחר קוקטיילים כימיים שעשויים ליצור גבישים ראשוניים2. עבור האחרון, זה לעתים קרובות המקרה כי קריסטלוגרף יצטרך לייעל כל להיטים ראשוניים כדי להשיג גבישים עם איכות עקיפה מספיק וגודל עבור מחקרים קביעת מבנה3. למרות אפשרויות אלה, ייתכן שמולקולות מטרה מסוימות לעולם לא ייצרו גדולים (>10 מיקרומטר), גבישים מנטרלים היטב וכתוצאה מכך הקריסטלוגרף חייב להתמיד עם המיקרו-קריסטלים שלהם והאתגרים שדגימות כאלה מציבות. אלה כוללים הרכבה מתאימה והגנה על הקריו, ניהול עקיפה חלשה יותר מטבעה ורגישות מוגברת לקרינה. מיקרוקריסטלים נוצרים מפחות תאים ומולקולות יחידה מאשר גבישים גדולים יותר וככזה, עקיפה אינה מוגברת באותה מידה לעומת גבישים גדולים יותר, וכתוצאה מכך עוצמות עקיפה חלשות מטבען. חשוב כי אות הרקע אינו להסוות השתקפויות אלה, במיוחד ברזולוציה גבוהה יותר שבו עוצמות השתקפות חלשות ניתן לאבד4. בנוסף, microcrystals רגישים יותר לנזקי קרינה ולמרות רישום עקיפה בטמפרטורות חנקן נוזלי5, ייתכן שלא ניתן יהיה לאסוף נתונים מלאים מגביש אחד, מה שהופך את הצורך לאסוף נתונים ממספר גדול מאוד של גבישים כדי לייצר ערכת נתונים מלאה אחת6.
הזמינות הגוברת של לייזרים אלקטרונים ללא קרני רנטגן (XFELs) והאבולוציה של שיטות קריסטלוגרפיה סדרתיות (SFX)7 סיפקו נתיבים לאיסוף נתונים ממיקרו-קריסטלים קטנים יותר. עם זאת, אלה שיטות מסירת מדגם מותאמות, הדורשות כמות משמעותית של חומרה ומומחיות תוכנה, שבהן הניסויים מוגבלים לטמפרטורת החדר ובדרך כלל צריכת הדגימה גבוהה (מאות מיקרוליטרים) ועדיין עשויות לדרוש מיטוב נוסף8. ככזה, פרויקטים שבהם ניתן לבצע רק כמות מוגבלת של מיקרו-קריסטלים אינם מתאימים ל- SFX.
בינתיים, טכנולוגיית קו הקרן סינכרוטרון בעשורים האחרונים התקדמה לייצר קורות קטנות ויציבות יותר9 עם זוהר שאיפשר איסוף נתונים מגבישים קטנים יותר10,11. קווי קרן מיקרופוקוס כגון FMX ב- NSLS-II ו- I24 במקור אור היהלום הצליחו לקבוע מבנים חדשניים מגבישים עם ממדים מרביים של ~ 3 מיקרומטר12 ולהדגים את היכולת לאסוף נתונים שמיש מגבישים קטנים עוד יותר בגודל ~ 1 מיקרומטר13. קו הקרן חייב להיות מוגדר במדויק, עם אופטיקה מצוינת ברזולוציה גבוהה על ציר צפייה, כדור מינימלי של בלבול לסיבוב מדגם וציר סיבוב מיושר בדיוק כי הוא בקנה אחד עם קרן הרנטגן. חשוב להתאים באופן הדוק את פרופיל קרן הרנטגן לנפח הגביש ולהבטיח שהקריסטל מיושר במדויק בקרן הרנטגן - אתגר עבור גבישים <5 מיקרומטר14. עמידה בתנאי ניסוי אלה בקו הקרן חיונית להקלטת הנתונים האיכותיים ביותר ממיקרו-קריסטלים.
ההיבט הנותר ואולי החשוב ביותר של איסוף נתונים ממיקרו-קריסטלים הוא הצגת הגביש לקרן הרנטגן. מיקרוקריסטלים הותקנו לעתים קרובות על תושבות דגימת מיקרומש, המיוצרות מפולימיד, חומר פיזור קרני רנטגן נמוך עם פתחים קטנים כמו 10 מיקרומטר15,16. רשת הפולימיד מותקנת על סיכה סטנדרטית המוגדרת לבסיס SPINE מגנטי, מה שהופך אותה לתואמת לרוב קווי הקרן MX17. הר הרשת משמש לדגי גבישים מסירת ההתגבשות לעתים קרובות בעקבות אותו הליך כמו הרכבה על גבישי 100 מיקרומטר באמצעות הרכבה בסגנון לולאה סטנדרטית. בעוד הגבישים עשויים להיות מופצים על פני הרשת, חיסרון מרכזי הוא כי נפח גדול יחסית של נוזל יכול להיות נישא על ידי הרשת ואת הסיכה בעת הקציר (איור 1C,D). נפח זה של נוזל, שיכול להיות גדול פי כמה מהגבישים עצמם, יתרום לרעשי רקע כאשר הוא מואר בצילומי רנטגן. פיזור רקע זה יכול להיות אפילו חזק יותר אם הנוזל יוצר קרח גבישי במהלך קירור הבזק, ומפחית את יחס האות לרעש של עוצמות חלשות כבר ברזולוציות של עקיפה של קרח. לכן, זה המפתח כי נוזל עודף מוסר מן המדגם, כדי להבטיח כי כל האותות האפשריים ניתן להקליט. אתגר זה הוא אפילו גדול יותר במקרה של גבישי חלבון ממברנה שנוצר בתוך שלב מעוקב השומנים (LCP), שבו LCP מייצר פיזור רקע חזק והוא גם קשה להסיר מסביב גבישים 18.
קו הקרן החדש של מיקרופוקוס קריסטלוגרפי (VMXm) ב-Diamond Light Source מספק את התנאים שבהם ניתן לאסוף נתונים מגבישים שגודלם עשוי להיות קטן ממיקרון. קו הקרןתוכנןלספק פרופיל קרן בגודל 0.3 מיקרומטר x 0.5 מיקרומטר (VxH) 1 , גוניומטר עם כדור של בלבול לא יותר מ 60 ננומטר וסביבת מדגם vacuo. תכונות עיצוב אלה של תחנת הקצה VMXm למזער את הדור של רעש רנטגן רקע על ידי מנגנון קו הקרן במהלך איסוף נתונים עם המקור הגדול ביותר שנותר של רקע שנוצר על ידי מדגם14.
שיטות הכנה ספציפיות לדוגמה המיועדות לקו הקרן VMXm מספקות הזדמנות להפחית רקע זה ולשפר עוד יותר את האות לרעש של נתוני עקיפה, תוך מקסום איכות הנתונים שניתן לרשום ממיקרו-קריסטלים המודדים <10 מיקרומטר. רבות מהדרישות המתוארות כאן לעקיפת רקע נמוך ממיקרו-קריסטלים נפוצות גם במיקרוסקופיית אלקטרונים שידור קריוגנית (cryoTEM)19 וחקיפת אלקטרונים מיקרוקריסטליים (microED)20. כתוצאה מכך, רבים מהכלים שכבר פותחו להכנת דגימות cryoTEM מתאימים, עם כמה התאמות, להכנת מיקרוקריסטלים. בהכנת דגימות עבור cryoTEM חלקיק יחיד, החלקיקים הנחקרים מוטבעים בשכבות דקות מאוד (בדרך כלל <100 ננומטר) של קרח זגוכי, כך שאלקטרונים מסוגלים לשדר דרך המדגם. השכבה האחודה הדקה מושגת על ידי פירוק נוזל עודף ו- vitrification של המדגם מושגת על ידי קירור מהיר של המדגם (~ 104 K s-1)21 באמצעות צלילה לתוך אתאן נוזלי המוחזק ~ 93 K22. לעומת זאת, חנקן נוזלי, כפי המשמש באופן שגרתי להכנת מדגם MX, הוא קריוגן יעיל פחות מאשר אתאן ויש לו נטייה גדולה יותר להיווצרות קרח גבישי בתוך מדגם21. היווצרות של קרח גבישי, אשר יכול לבזות עקיפה וליצור רעשי רקע, הוא בדרך כלל מקל באמצעות שימוש של תרכובות מגן קריו23. פולימרים במשקל מולקולרי נמוך כגון פולי-אתילן גליקול (PEG) 400 ומתיל-2,4-פנטנדיול (MPD), סוכרים, שמנים או מלחים רוויים ניתן להוסיף אליקואט של פתרון התגבשות בריכוזים נמוכים24- אין פתרון 'גודל אחד מתאים לכולם' לבחירת קריו-הגנה המתאימה ביותר וזה דורש לעתים קרובותאופטימיזציה 25 . הגביש גם עובר מניפולציות מרובות במהלך תהליך הקציר וההגנה מפני הקפאה אשר עלול לגרום נזק לקריסטל, ההזדמנות להשתמש באתאן נוזלי מאפשרת את השמטת צעד זה ומסייעת להגן על שלמות הגביש.
בעוד אתאן נוזלי הוא קריוגן יעיל עבור microcrystals (<10 מיקרומטר) בשל הרזון של המדגם, ישנן שיטות חלופיות למניעת היווצרות קרח גבישי, במיוחד בגבישים גדולים יותר, כולל הפחתת תכולת המים של הגביש על ידי שימוש בסביבה לחה מבוקרת היטב26, או באמצעות פתילת נוזל עודף הרחק הלולאה ואת פני השטח של הגביש27 עם זאת, אלה שוב דורשים מניפולציה גדולה יותר של המדגם., השימוש בכתמים אוטומטיים ומקפיא לצלול עם אתאן נוזלי, כמו cryoTEM, יחד להסיר פתרון התגבשות עודף ולספק אמצעי להבהב microcrystals מגניב באופן מבוקר תוך ניסיון למזער את המניפולציה.
כאן, אנו מציגים פרוטוקול שניתן להשתמש בו לא רק על ידי שני המשתמשים בקו הקרן VMXm ובקווי קרן מיקרופוקוס אחרים כדי לאסוף נתוני עקיפה גבוהים של אותות לרעש, אלא עשויים גם להיות שימושיים למי שמכין דגימות קריסטל חלבון מסיסות וממברנה מבוססת דטרגנט לניסויים במיקרו-ED. בעוד כל המתקנים כדי להכין ולהעריך דגימות זמינים ב- VMXm, מעבדות ביולוגיה מבנית רבות מצוידות יותר ויותר להכנת מדגם cryoTEM. כתוצאה מכך, אנו מדמיינים כי משתמשים מסוימים עשויים לרצות להשתמש במתקנים שלהם כדי להכין את הדגימות שלהם עבור beamtime ב- VMXm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated Cryo-EM plunge freezing instrument</td>
			<td>Leica or ThermoFisher</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop light microscope with light source</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade/Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 &#181;m holes</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C16nCu20-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTEM grid storage boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>146750010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12383118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>455732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharging device</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film (Parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small, fine forceps</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetting devices</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape for crystallisation plates.</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small/medium liquid nitrogen dewars</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprung circlip clipping tool</td>
			<td>Subangstrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann No.1 pre-cut filter paper</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sample preparation pipeline for microcrystals at the vmxm beamline

הרכבה של מיקרוקריסטלים (<10 מיקרומטר) עבור קריו-קריסטלוגרפיה אחת קריסטל מציג אתגר לא טריוויאלי. שיפורים באיכות הנתונים נצפו עבור microcrystals עם התפתחות של אופטיקה קו קרן, יציבות קרן וגודל קרן משתנה התמקדות מתת מיקרון, כגון בקו הקרן VMXm במקור אור יהלום1. שיפורים נוספים באיכות הנתונים יקבלו באמצעות שיפורים בסביבה מדגם והכנת מדגם. מיקרוקריסטלים מטבעם יוצרים עקיפה חלשה יותר, ולכן שיפור האות לרעש הוא המפתח לאיסוף נתוני עקיפה איכותיים של קרני רנטגן ויגיע בעיקר מהפחתות ברעשי הרקע. מקורות עיקריים של רעשי רקע רנטגן בניסוי עקיפה הם מהאינטראקציה שלהם עם נתיב האוויר לפני ואחרי הדגימה, פתרון התגבשות עודף המקיף את המדגם, נוכחות של קרח גבישי ופיזור מכל מכשור קו קרן אחר או חלונות רנטגן. קו הקרן VMXm כולל מכשור ופרוטוקול הכנה לדוגמה כדי להפחית את כל מקורות הרעש האלה.
ראשית, סביבת דגימה בריק ב- VMXm מסירה את נתיב האוויר בין מקור רנטגן לדגימה. לאחר מכן, פרוטוקולי הכנה לדוגמה עבור קריסטלוגרפיה macromolecular ב- VMXm להשתמש במספר תהליכים וכלים המותאמים CryoTEM. אלה כוללים רשתות נחושת עם סרטי תמיכה בפחמן חורי, סופג אוטומטי ורובוטיקה קירור צוללת עושה שימוש באתאן נוזלי. כלים אלה מאפשרים הכנת מאות מיקרו-קריסטלים ברשת קריומטם אחת עם נוזל מינימלי סביב על תמיכה ברעש נמוך. הם גם למזער את היווצרות של קרח גבישי מכל נוזל שנותר סביב הגבישים. אנו מציגים את התהליך להכנת והערכה של איכות מיקרוקריסטלים חלבון מסיס באמצעות אור גלוי סורק מיקרוסקופיית אלקטרונים לפני הרכבה הדגימות על קו הקרן VMXm לניסויי עקיפה קרני רנטגן. אנו גם נספק דוגמאות של דגימות באיכות טובה, כמו גם אלה הדורשים אופטימיזציה נוספת ואסטרטגיות לעשות זאת.

מטרת פרוטוקול זה היא להשיג מיקרוקריסטלים מבעבעים עם נפח מינימלי של נוזל המקיף את הגביש המאפשרים ניסויי עקיפה של קרני רנטגן עם פיזור רקע מינימלי כדי לשפר את אות עקיפה. תמונות SEM לדוגמה של מיקרו-קריסטלים שהוכנו ברשתות cryoTEM לפיזור רקע מינימלי מוצגות באיור 1A, B ובאיור 2. רשתות עם גבישים בודדים מבוזרים באופן שווה יספקו את השימוש היעיל ביותר ברשת, עם אות לרעש טוב. עם זאת, הדבר אינו אפשרי בדרך כלל לאורך כל הרשת ואזורים מסוימים עשויים להציג כמות מסוימת של גושים(איור 2A,B). למרות הגוש הזה, דוגמאות אלה עדיין מציגות מספר שימושי של גבישים בודדים מבודדים שיספקו עקיפה עם רקע נמוך (איור 5). רמת הנפיחות שעדיין שומרת על פיזור נמוך ברקע יכולה להשתנות. כתמים חזקים כך החורים בסרט התמיכה בפחמן נראים בבירור אבל הגבישים נשארים hydrated היא המטרה (איור 2C,D). עם זאת, רשתות באיכות טובה עדיין יכולות להציג נוזל כלשהו בתוך החורים של סרט התמיכה אם כי המיקום של החורים עדיין צריך להיות מזוהה (איור 2A,B). חשוב לציין, כל הדוגמאות הללו מציגות גבישים בודדים ומבודדים עם הילה מנוצלת של נוזל המקיפה את הגביש כדי לשמור על הידרציה בין סופג להקפאה.
דגימות רבות עשויות לדרוש אופטימיזציה נוספת (איור 3), אשר יכול לכלול וריאציה של זמן הכתם או הריכוז של microcrystals. רשתות עמוסות בגבישים יפגינו יעילות סופגת מופחתת ועלולים לגרום לכך שנרשמו סתתים מרובים בתמונות עקיפה בודדות (איור 3A,B). תנאי התגבשות צמיגים נוספים, כגון זה של טריפסין המכיל 8% PEG 4000 ו-15% אתילן גליקול(איור 3C),עלולים לגרום לצורך בזמני חלוקה ארוכים יותר (>10 s). לעומת זאת, תנאי התגבשות עם צמיגות נמוכה מאוד שנפגמים מהר מאוד, יכולים לסבול מבעיות הפצה עקב כוח המשיכה הגורמות להתיישבות לפני שמתרחשת סופגת, וכתוצאה מכך כל המיקרו-קריסטלים מתיישבים בצד אחד של הרשת (איור 3D).
הכנה אופטימלית של דגימות מאפשרת לנצל את מלוא היכולות של VMXm כדי לאסוף נתוני עקיפה באיכות גבוהה של קרני רנטגן ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית עם איתות לרעש גבוה (איור 5). דגימות אלה נהנות מלהיות תואמות לסביבת הדגימה in-vacuo, וכתוצאה מכך ספירת רקע נמוכה מאוד או אפס ממוצעת בתמונות עקיפה. השימוש באתאן נוזלי, ללא מגן קריו, גורם להיעדר טבעות קרח (איור 5),אם כי היכן שהגבישים מונחים קרוב לסורגי רשת הנחושת, קרן הרנטגן יכולה להציץ בסורגים וכתוצאה מכך טבעות עקיפה של אבקת נחושת ב- ~ 2.1 Å ו- ~ 1.8 Å.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig01.jpg"> איור 1: השוואה בין הרכבה מיקרו-קריסטלית על תושבות מיקרומש ורשתות cyoTEM. סריקת מיקרוגרפים אלקטרונים של מיקרוקריסטלים קפואים לצלול של polyhedral וירוס מדידה 2.5 מיקרומטר על פני (A, B) 5 kV האצת מתח, גודל ספוט של 39 (יחידות שרירותיות) וזמן השתהות של 16 מיקרומטר. הרשת נקייה מעודף נוזלים (A), הילה צרה של נוזל נצפית סביב הגבישים (B). אותן דגימות המותקנות על מיקרומש (20 מיקרומטר צמצם) לפני קירור הבזק בחנקן נוזלי ונצפתה באמצעות מערכת הצפייה על הציר בקו הקרן I24 פנים אל פנים (C) ובצד על (D). העיוותים האופטיים (C) בעת צפייה פנים אל פנים נותנים אינדיקציה להיקף העובי הנוזלי על פני המיקרומש, הדבר ברור יותר בעת הצגת המיקרומש בצד(D). המטרה האדומה ב-C ו-D מייצגת את מיקום וגודל קרן הרנטגן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig02.jpg"> איור 2: דוגמאות לדגימות באיכות טובה. גבישי Polyhedra (A) נצפו על פני ריבוע רשת יחיד ~ 100 מיקרומטר. בעוד שחלק מהגבישים מעט מגובשים ומראים קישוריות מסוימת של הנוזל שמסביב, ישנם מספר גבישים בודדים מבודדים עם הילה קטנה של נוזל המקיפה את הגביש. גבישי אינסולין מעט גדולים יותר (B) מדידה ~ 5 x 5 מיקרומטר גם להראות כמה גושים אבל שוב יש גבישים בודדים מבודדים היטב. גבישי מחט יכולים להיות ממד צר מאוד ודורשים microbeam, כגון אלה בצורת מחט גבישי ליזוזים (C). רצועת נוזל צרה ניתן לראות סביב גבישים אלה (הילה אפורה בהירה). מיקרוקריסטלים גדולים יותר עד עשרות מיקרונים יכולים גם להיות מותקנים היטב על רשתות cryoTEM, כגון גבישי חלבון ~ 7 מיקרומטר K (D). הן(C)והן (D) ובמידה פחותה יותר ב- (A), החורים של סרט התמיכה בפחמן נראים בבירור, ומדגים את נוכחותם של מעט מאוד / ללא נוזלים. לדוגמה B, בעוד שלא נצפו חורים ריקים, עדיין ניתן לזהות את מיקום החורים, מה שמצביע על כך שהנוזל רק ממלא את החורים בסרט התמיכה. בכל הדוגמאות הללו, הילה של נוזל ניתן לראות סביב קצה ריבוע הרשת (ריבוע פנימי מעוגל), שבו החורים יש מראה אפור בהיר יותר. זוהי תכונה נפוצה של רשתות מוכנות היטב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig03.jpg"> איור 3: דוגמאות לדוגמה הדורשות מיטוב נוסף. רשתות עמוסות במיקרו-קריסטלים(A, B)יכולות להגביר את פיזור הרקע כאשר הדגימות חוסמות את החורים בסרט התמיכה המפחיתות את יעילות הכתמים, ועם מתח משטח גבוה יותר בין הגבישים נשאר נוזלים נוספים. כמו גם השפלה באות לרעש וכתוצאה מכך אובדן מידע, סביר להניח כי סתימות מרובות יירשמו. באמצעות זמן סופג שאינו ארוך מספיק, או פתרון התגבשות צמיג מאוד יכול לגרום מדגם רטוב מדי (C), גם לייצר אות לרעש נמוך. תנאי התגבשות ללא משקעים, כגון אלה לאינסולין בקר (D), יש צמיגות נמוכה מאוד. בעוד זה גורם זמן סופג קצר מאוד, זה יכול גם לגרום לתנועה של גבישים על פני הרשת לפני ובמהלכו סופג בשל ההשפעות של כוח המשיכה. התוצאה היא בדרך כלל רשת ריקה ברובה עם ריכוז גבוה של גבישים לאורך קצה אחד (D). זה יכול להיות יתרון להוסיף סוכן צמיג כגון אתילן גליקול לסלעת הגביש זמן קצר לפני החלתם על הרשת כדי להפחית את זרימת הגביש ולשפר את התפלגות הגבישים. זה יכול גם להאריך את זמן הכתם, מה שמקל על התבוננות בכתמים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig04.jpg"> איור 4: כלים לטעינת דגימה ב-VMXm. ערכת כלים מותאמת במיוחד תוכננה לטעון את מחזיקי מדגם VMXm (A). למטען לדוגמה (B) יש מקום עבור מחזיק דגימה VMXm יחיד, תיבת רשת ואחסון כלים במהלך העבודה. הוא גם נועד לאפשר עבודה ממש מתחת לפני השטח של החנקן הנוזלי ולאפשר מחסנית המדגם להתאים מתחת (B). מנעל האוויר dewar (C), אשר מתאים את תיבת גז חנקן מנעל האוויר בתחנת הקצה VMXm, משמש כדי לקחת את מחסנית מדגם טעון מהמעבדה לכלוב ניסיוני beamline. כדי להציג דוגמאות ב- SEM הלא מקוון, נעשה מעבורת מותאמת אישית (D) המורכבת ממחזיק הדגימה VMXm ללא בסיס כדי לאפשר הערכה במחזיק המדגם המשמש בקו הקרן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig05.jpg"> איור 5: עקיפה לדוגמה ממיקרו-קריסטלים ב-VMXm. תמונת עקיפה אחת שתועדה באמצעות גלאי פילטוס 3 6M ב- VMXm של גביש פוליהדרלי של וירוס ~ 3 מיקרומטר המותקן על רשת cryoTEM בשיטת הקפאת הצלילה. עקיפה נצפתה מעבר 1.7 Å והשתקפות (ריבוע כחול) ב 1.74 Å הוא inset, מדגים את פיזור הרקע הנמוך, עם מספר גבוה של פיקסלים עם אפס ספירות. אתילן גליקול לריכוז סופי של 50% v/v נוספה לתחבולת הגביש לפני החלתה על הרשת. אופי הרקע הנמוך של מיקום המדגם VMXm מודגם על ידי הרקע הקבוע לאורך התמונה כפי שמוצג על ידי עוצמות המותרות מתחת לקו המקווקו הכחול, אפילו ליד מרכז הקרן. העוצמה המותווה מראה שהרקע נשאר מתחת ל-3 ספירות. שתי טבעות קלושות נצפות ב 2.15 Å ו 1.86 Å אשר נוצרים על ידי עקיפה אבקה של הנחושת של רשת cryoTEM. אין טבעות קרח לגילוי, המדגים את האפקטיביות של סופג ואחריו קירור עם אתאן נוזלי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline at JoVE.com

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

יחס אות לרעש של נתונים הוא אחד השיקולים החשובים ביותר בביצוע מדידות עקיפה של קרני רנטגן ממיקרו-קריסטלים. קו הקרן VMXm מספק סביבה עם רעש נמוך ומיקרואורגניזם לניסויים כאלה. כאן, אנו מתארים שיטות הכנה לדוגמה עבור microcrystals הרכבה וקירור עבור VMXm וקווי קרן קריסטלוגרפיה מיקרומוקולריים אחרים.

צינור הכנה לדוגמה עבור מיקרוקריסטלים בקו הקרן VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

הכנת מדגם סטנדרטית מקשה על השגת אות לרעש טוב במהלך ניסויי עקיפה של מיקרו-קריסטלים. פרוטוקול זה נועד להפחית את מקורות הגבישים שנוצרו ברקע באופן מבוקר. השימוש ברובוטיקה הקפאת אגרוף ורשתות cryoTEM מספק פלטפורמה חזקה למניפולציה של microcrystals שוב ושוב, הפחתת נפח הנוזל שמסביב ומתן vitrification מהיר של המדגם.המיומנות הדרושה לטיפול ברשתות דומה לזו הדרושה לקצירת קריסטלים מסורתית. גורם חשוב נוסף הוא קביעת הפרמטרים הראשוניים של סופגות באמצעות פתרון התגבשות, שהוא המפתח להפחתת השימוש במדגם. כדי להתחיל, להגדיר ולקרר את מקפיא הצלילה האוטומטי על פי הוראות היצרן.רגע לפני השימוש, זוהר לפרוק את רשתות cryoTEM במשך 25 שניות עם זרם 15 מיליאמפר ולחץ 0.39 מיליבר, ולאחר מכן לשמור על רשתות הפרשה זוהר בצלחת פטרי מכוסה. הגדר את הלחות היחסית של תא המדגם ל -90% ואת זמן הכתם לחמש שניות. ודא כי מקפיא הצלילה מוגדר לצלול באופן אוטומטי את המדגם לאחר סופג הושלמה.פתח את חותם ההתגבשות היטב ואת המאגר. הוסף במהירות שניים עד חמישה מיקרוליטרים של פתרון המאגר בטיפת הגביש כדי לשמור על נפח הטיפה. העבר 10 מיקרוליטרים של פתרון המאגר לצינור 0.5 מיליליטר לשימוש מאוחר יותר ולאחם מחדש את הבאר כדי למנוע את טיפת ההתגבשות מהייבוש.השתמש במלקחיים הקפואים לצלול כדי לבחור רשת פריקה זוהרת אחת ולהעמיס את הרשת במכשיר כשצד הפחמן פונה הרחק מזרוע הכתם. סובבו את המלקחיים המחזיקים ברשת כך שצד הפחמן יעמוד מול הזרוע הנפוחה. השתמש בצינור מיקרוליט 2.5 כדי להחיל שני מיקרוליטרים של פתרון המאגר על הצד שאינו תומך של רשת cryoTEM.סובב את הרשת כשצד הפחמן פונה הרחק מזרוע הכתם והחיל בזהירות את נוזל המאגר על צד התמיכה בסרט הפחמן של הרשת. ליזום את תהליך הכתם ולהתבונן בנוזל שנמשך מפני השטח של הפחמן עד שגל הקפיצה על פני השטח של הרשת נראה. אם גל הקפיצה אינו נראה לעין, הגדל את זמן ההכתמה בשניה עד שתי שניות לפני שזרוע הכתם נסוגה מהרשת.מניחים את לוח ההתגבשות מתחת למיקרוסקופ האור וממקם היטב את המטרה בתוך שדה הראייה. מניחים רשת פריקה זוהרת טרייה במקפיא הצלילה ומחילים את נוזל המאגר על הצד הלא תומך של הרשת כפי שהודגם בעבר. סובב את הרשת כשצד התמיכה בסרט הפחמן פונה ליציאת הדגימה של מקפיא הצלילה.מקלפים את החותם הזמני מצלחת ההתגבשות ומשתמשים בפיפטה שנקבעה בשני מיקרוליטרים כדי לשאוף בעדינות את טיפת ההתגבשות שוב ושוב. מעבירים שני מיקרוליטרים של תרחיף המיקרו-קריסטל השאיפה למקפיא הצלילה ומחילים את כל הדגימה על צד הפחמן של רשת cryoTEM. ליזום את סופג ולהתבונן על גל של צץ, ואז מיד ליזום את הקפאת הצלילה.מעבירים במהירות את הרשת מהאיתאן הנוזלי לתיבת הרשת השקועה בחנקן נוזלי. לאחר סופג וצלילה הקפאת הרשת, לסגת הרשת צלל מן האתאן הנוזלי על ידי איפוס מקפיא הצלילה. הסר את המלקחיים המחזיקים את הרשת מהמקפיא לצלול ומניחים את הרשת מתחת למיקרוסקופ האור.התאם את המיקוד העדין והערך את צפיפות הגבישים על פני הרשת. לאחר טעינת רשת cryoTEM ב- SEM, יישר את המדגם והדליק את קרן האלקטרונים. בתחילה להעריך את הרשת כולה בהגדלה 45X ולתעד את התמונה, ולאחר מכן להגדיל את ההגדלה לבדיקה מדוקדקת יותר של ריבועי רשת בודדים עד גבישים בודדים נצפים בבירור.נוע סביב הרשת ולצלם את תמונות הסטילס, מה שמבטיח שהרשתות שטוחות וסרט התמיכה בפחמן יהיה שלם ברובו. ודא כי ישנם גבישים בודדים רבים עם הילה צרה של נוזל מנווט סביב הגביש ואת החורים נראים בסרט תמיכה בפחמן. תוך התבוננות ולכידת התמונות של הרשת, ודא שהאזורים הגדולים של הנוזל המשובץ נעדרים, קרח משושה או קרח על פני השטח אינם מפוזרים על פני הרשת, וכי הגבישים אינם חופפים ומופצים באופן שווה על פני סרט התמיכה.ב dewar קצף גדול, לקרר את המספר הנדרש של מחזיקי מדגם VMXm טעון במחסנית המדגם. הוסף חנקן נוזלי מעל מיקום המדגם במטען המדגם. העבר במהירות את תיבת הרשת המכילה רשתות טעונות מיקרו-קריסטליות לתקופת הרשת ההפסקה במטען הדגימה ושחרר מעט את המכסה כדי לשמור על המכסה רופף וניתן לסיבוב.הרם את הרשת מתיבת הרשת וסובב את הרשת כדי להניח את הרשת שטוחה על מחזיק המדגם. הנח במהירות את כלי הצירליפ מקורר מראש על הרשת בפתיחת הרשת ולחץ על הכפתור כדי להתקין את הצירק. מוסיפים חנקן נוזלי כ-1.5 ס"מ מעל מחזיק המדגם.השתמש במלקחיים מדגם VMXm כדי להרים בזהירות את מחזיק הדגימה הטעון ולהחזיר אותו למחסנית הדגימה. החלף את המכסה על המחסנית, והבטח שהסיכה בחלק העליון של המחסנית עוסקת בחור במכסה. מיקרוגרפים אלקטרונים סריקה של microcrystals מוכן על רשתות cryoTEM הראה פיזור רקע מינימלי.הרשת הייתה נקייה מעודף נוזלים והילה צרה של נוזל נצפתה מקיפה את הגבישים. הגבישים הפוליהדרליים נצפו בנפרד, כמו גם בגושים. גבישי אינסולין מעט גדולים יותר הראו גם כמה גושים יחד עם גבישים מבודדים.מיקרוקריסטלים גדולים מאוד הוצבו בהצלחה גם על רשתות cryoTEM. החורים בסרט התמיכה בפחמן נראו בבירור, מה שמצביע על סופג חזק. דגימות רבות דרשו אופטימיזציה נוספת בגלל וריאציה בזמן הכתם וריכוז של microcrystals.הרשתות העמוסות בגבישים מפחיתות את יעילות הכתמים וסבים מרובים נרשמו בתמונת עקיפה אחת. זמן קצר של התגבשות צמיגה לפתרונות התגבשות צמיגים עלול לגרום לדגימה רטובה מדי. עבור פתרון התגבשות צמיגות נמוך יותר, זמן קצר של גניבה של microcrystals בצד אחד של הרשתות.הכנת מדגם אופטימלית מאפשרת לנצל את היכולות המלאות של VMXm כדי לאסוף נתוני עקיפה באיכות גבוהה של קרני רנטגן ברזולוציה הגבוהה ביותר האפשרית עם יחס אות לרעש גבוה. קביעת סופגות ראשוניות של פתרון התגבשות היא המפתח לשימוש במדגם מינימלי. אם המדגם מוגבל מאוד, דלג על הערכת הצפיפות.בסופו של דבר, עדיף שתהיה דגימה מדוללת. דגימות אלה מוכנות כעת לניסויי עקיפה של קרני רנטגן בקו הקרן VMXm, עקיפה של אלקטרונים מיקרוקריסטליים, או כרסום קרן יונים ממוקד לפני מיקרו אד.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

הכנה והגשת microcrystals חלבון בשלב lipidic מעוקב עבור קריסטלוגרפיה Femtosecond סידורי

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

תרבות התא על ממברנות הסיליקון נידהר וקריופיקציה עבור סינכרוטרון X-ray פלואורסצנטית ננו-ניתוח

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

פרוטוקול הכנה והעברה לדוגמה לקריסטלוגרפיה באורך גל ארוך בוואקום בקו קרן I23 במקור אור יהלום

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

הכנה לדוגמה באמצעות שיטת חד שכבתית שומנים למחקרים קריסטלוגרפיים אלקטרונים

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...