Name: a sample preparation pipeline for microcrystals at the vmxm beamline
Uploaded: 2021-06-17T13:00:00
Duration: 9 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить Джереми Киоуна, Джона Граймса, Джеффа Саттона и Дэйва Стюарта, Strubi University of Oxford и Rachel Bolton, Университет Саутгемптона, за любезное предоставление микрокристаллических образцов для разработки и демонстрации методов подготовки образцов для лучевой линии VMXm в дополнение к возможности ввода в эксплуатацию лучевой линии. Авторы также хотели бы поблагодарить iNEXT-Discovery (номер проекта 871037) за возможность и поддержку в публикации этой рукописи.

<ol>
	<li>Laundy, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+multi-lane+X-ray+mirror+providing+variable+beam+sizes.">Development of a multi-lane X-ray mirror providing variable beam sizes.</a> Review of Scientific Instruments. 87 (5), 051802-051806 (2016).</li><li>McPherson, A., Gavira, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+protein+crystallization.">Introduction to protein crystallization.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, 2-20 (2014).</li><li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+crystallization+conditions+for+biological+macromolecules.">Optimization of crystallization conditions for biological macromolecules.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70 (11), 1445-1467 (2014).</li><li>Holton, J. M., Frankel, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+minimum+crystal+size+needed+for+a+complete+diffraction+data+set.">The minimum crystal size needed for a complete diffraction data set.</a> Acta Crystallographica Section D. 66, 393-408 (2010).</li><li>Garman, E. F., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryocooling+and+radiation+damage+in+macromolecular+crystallography.">Cryocooling and radiation damage in macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (1), 32-47 (2005).</li><li>Gildea, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+methods+for+indexing+multi-lattice+diffraction+data.">New methods for indexing multi-lattice diffraction data.</a> Acta Crystallographica Section D. 70, 2652-2666 (2014).</li><li>Chapman, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-Ray+Free-Electron+Lasers+for+the+Structure+and+Dynamics+of+Macromolecules.">X-Ray Free-Electron Lasers for the Structure and Dynamics of Macromolecules.</a> Annual Review of Biochemistry. 88 (1), 35-58 (2019).</li><li>Beale, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+sample+preparation+for+serial+crystallography+experiments.">Successful sample preparation for serial crystallography experiments.</a> Journal of Applied Crystallography. 52, 1385-1396 (2019).</li><li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-crystallography+comes+of+age.">Micro-crystallography comes of age.</a> Current Opinion in Structural Biology. 22 (5), 602-612 (2012).</li><li>Owen, R. L., Juanhuix, J., Fuchs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+synchrotron+radiation+instrumentation+for+MX+experiments.">Current advances in synchrotron radiation instrumentation for MX experiments.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 21-31 (2016).</li><li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+the+Most+Out+of+Your+Crystals:+Data+Collection+at+the+New+High-Flux,+Microfocus+MX+Beamlines+at+NSLS-II.">Getting the Most Out of Your Crystals: Data Collection at the New High-Flux, Microfocus MX Beamlines at NSLS-II.</a> Molecules. 24 (3), 496 (2019).</li><li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin.">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Crystallographica Section D. 70, 1435-1441 (2014).</li><li>Ji, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyhedra+structures+and+the+evolution+of+the+insect+viruses.">Polyhedra structures and the evolution of the insect viruses.</a> Journal of structural biology. 192 (1), 88-99 (2015).</li><li>Evans, G., Axford, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+design+of+macromolecular+crystallography+diffraction+experiments.">The design of macromolecular crystallography diffraction experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 67, 261-270 (2011).</li><li>. MiTeGen Available from: <a target="_blank" href="https://www.mitegen.com/product/micromeshes/">https://www.mitegen.com/product/micromeshes/</a> (2020)</li><li>Guo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+manipulation+and+data+assembly+for+robust+microcrystal+synchrotron+crystallography.">Sample manipulation and data assembly for robust microcrystal synchrotron crystallography.</a> IUCrJ. 5, 238-246 (2018).</li><li>Cipriani, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automation+of+sample+mounting+for+macromolecular+crystallography.">Automation of sample mounting for macromolecular crystallography.</a> Acta Crystallographica Section D. 62 (10), 1251-1259 (2006).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comprehensive+review+of+the+lipid+cubic+phase+or+in+mesomethod+for+crystallizing+membrane+and+soluble+proteins+and+complexes.">A comprehensive review of the lipid cubic phase or in mesomethod for crystallizing membrane and soluble proteins and complexes.</a> Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71 (1), 3-18 (2015).</li><li>Thompson, R. F., Walker, M., Siebert, C. A., Muench, S. P., Ranson, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+introduction+to+sample+preparation+and+imaging+by+cryo-electron+microscopy+for+structural+biology.">An introduction to sample preparation and imaging by cryo-electron microscopy for structural biology.</a> Methods. 100, 3-15 (2016).</li><li>Nannenga, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+methodology+and+development.">MicroED methodology and development.</a> Structural Dynamics. , 1-8 (2020).</li><li>Dubochet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryo-electron+microscopy+of+vitrified+specimens.">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 21 (2), 129-228 (1988).</li><li>Tivol, W. F., Briegel, A., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+cryogen+for+plunge+freezing.">An improved cryogen for plunge freezing.</a> Microscopy and Microanalysis. 14 (5), 375-379 (2008).</li><li>Garman, E. F., Schneider, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+Cryocrystallography.">Macromolecular Cryocrystallography.</a> Journal of Applied Crystallography. 30 (3), 211-237 (1997).</li><li>Pflugrath, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+macromolecular+cryocrystallography.">Practical macromolecular cryocrystallography.</a> Acta Crystallographica Section F. 71 (6), 622-642 (2015).</li><li>Alcorn, T., Juers, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+rational+methods+of+cryoprotection+in+macromolecular+crystallography.">Progress in rational methods of cryoprotection in macromolecular crystallography.</a> Acta crystallographica Section D. 66, 366-373 (2010).</li><li>Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G. W., Walker, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproducible+improvements+in+order+and+diffraction+limit+of+crystals+of+bovine+mitochondrial+F(1)-ATPase+by+controlled+dehydration.">Reproducible improvements in order and diffraction limit of crystals of bovine mitochondrial F(1)-ATPase by controlled dehydration.</a> Acta Crystallographica Section D. 62, 991-995 (2006).</li><li>Pellegrini, E., Piano, D., Bowler, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+cryocooling+of+naked+crystals:+are+cryoprotection+agents+always+necessary.">Direct cryocooling of naked crystals: are cryoprotection agents always necessary.</a> Acta Crystallographica Section D. 67, 902-906 (2011).</li><li>Beale, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+as+a+method+for+sample+visualization+in+protein+X-ray+crystallography.">Scanning electron microscopy as a method for sample visualization in protein X-ray crystallography.</a> IUCrJ. , 1-9 (2020).</li><li>Hattne, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Global+and+Site-Specific+Radiation+Damage+in+Cryo-EM.">Analysis of Global and Site-Specific Radiation Damage in Cryo-EM.</a> Structure. 26 (5), 759-766 (2018).</li><li>Sanchez-Weatherby, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+diffraction+by+humidity+control:+a+novel+device+compatible+with+X-ray+beamlines.">Improving diffraction by humidity control: a novel device compatible with X-ray beamlines.</a> Acta crystallographica Section D. 65 (12), 1237-1246 (2009).</li><li>Tan, Y. Z., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Through-grid+wicking+enables+high-speed+cryoEM+specimen+preparation.">Through-grid wicking enables high-speed cryoEM specimen preparation.</a> Acta Crystallographica Section D. 76 (11), 1092-1103 (2020).</li><li>Martynowycz, M. W., Khan, F., Hattne, J., Abramson, J., Gonen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroED+structure+of+lipid-embedded+mammalian+mitochondrial+voltage-dependent+anion+channel.">MicroED structure of lipid-embedded mammalian mitochondrial voltage-dependent anion channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (51), 32380-32385 (2020).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+Determination+from+Lipidic+Cubic+Phase+Embedded+Microcrystals+by+MicroED.">Structure Determination from Lipidic Cubic Phase Embedded Microcrystals by MicroED.</a> Structure. 28 (10), 1149-1159 (2020).</li><li>Polovinkin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Demonstration+of+electron+diffraction+from+membrane+protein+crystals+grown+in+a+lipidic+mesophase+after+lamella+preparation+by+focused+ion+beam+milling+at+cryogenic+temperatures.">Demonstration of electron diffraction from membrane protein crystals grown in a lipidic mesophase after lamella preparation by focused ion beam milling at cryogenic temperatures.</a> Journal of Applied Crystallography. 53 (6), 1416-1424 (2020).</li><li>Storm, S. L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+energy-dependent+photoelectron+escape+in+microcrystals.">Measuring energy-dependent photoelectron escape in microcrystals.</a> IUCrJ. 7 (1), 129-135 (2020).</li></ol>

Никаких конфликтов интересов для декларирования.

Этот протокол демонстрирует, как инструменты из пробоподготовки cryoTEM могут быть использованы для подготовки микрокристаллов для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей на линиях пучка микрофокуса. Стандартные приборы лучевой линии сосредоточены вокруг установленного на штифте образца, и, хотя были предприняты усилия для обеспечения поддержки образца на этих креплениях для микрокристаллов, их часто сложно загрузить образцом, гарантируя при этом достижение самого высокого уровня сигнал-шум(рисунок 1C, D). Многие из этих образцов могут также потребовать оптимизации условий криозащиты, чтобы убедиться, что образец стекловидного. Метод погружной заморозки обеспечивает повторяемый способ удаления лишней жидкости и мгновенного охлаждения образца в эффективномкриогене (рисунок 1A, B). В то время как сетка может быть установлена на стандартной линии луча с помощью пинцета на основе штифтового крепления, держатели образцов VMXm были специально разработаны для приема решеток и удержания их ниже температуры стеклования в вакуумной среде посредством проводящего охлаждения. Выборонная среда VMXm обеспечивает сбор данных с низким фоном, где образец является оставшимся источником фона, и обеспечивает микролуч, который можно использовать для сопоставления кристаллов с размерами менее 10 мкм. Этот метод пробоподготовки также может быть использован для подготовки нанокристаллов к дифракции электронов, где также требуется очень мало избыточной жидкости и стекловидного тела из-за слабого проникновения электронов. В то время как сетки cryoTEM хрупки, те, кто занимается сбором кристаллов в петлях, быстро адаптируются к обработке сеток. При небольшом количестве опыта несколько сеток будут потеряны во время этапов промокания, замораживания и загрузки протокола. Однако шаги оптимизации имеют решающее значение для этого успеха, и тщательная подготовка уменьшит вероятность потери кристаллов или снижения целостности кристаллов.
Сетки CryoTEM обеспечивают относительно большое одиночное крепление, которое может содержать многие сотни кристаллов, тем самым повышая пропускную способность, где можно записать только небольшой клин дифракционных данных. Одна сетка может также обеспечить достаточное количество кристаллов для определения структуры белка, особенно в кристаллах высокой симметрии. В тех случаях, когда только одна или две капли монокристаллизации привели к микрокристаллу, только пробное промокание состояния кристаллизации может помочь гарантировать, что при смачивании микрокристаллов используемое время максимально приближено к тем, которые необходимы для создания исходных образцов хорошего качества. Опоры из углеродной пленки невидимы для рентгеновских лучей и доступны с различным расстоянием между отверстиями, которые могут быть использованы в соответствии с определенной морфологией. Чаще всего мы используем опорные пленки с отверстиями 2 мкм на расстоянии 2 мкм, но меньшие отверстия с большим расстоянием могут быть более подходящими для кристаллов менее 2 мкм. Доступны другие опорные пленки, такие как пленки с отверстиями 1 мкм с расстоянием 4 мкм, а также опорные пленки с отверстиями различной формы, все из которых будут влиять на время промокания. Квадратная сетка размером 200 (200 квадратов на дюйм) также обеспечивает достаточно места (~ 100 мкм) между медными стержнями сетки, чтобы рентгеновский луч не сильно взаимодействовал с медью, обеспечивая при этом достаточную структурную поддержку для углеродной пленки, загруженной кристаллами. Использование жидкого этана сводит на нет потребность в криопротекторах, что, в свою очередь, снижает требования к объему образца, которые использовались бы при оптимизации криопротекторных условий.
Основными параметрами, которые необходимо оптимизировать в процессе, являются время промокления и разбавление образца. Время промокания должно быть достаточно длинным, чтобы наблюдать эффект «хлопка» по всей сетке до погружения в замерзание. Чрезмерное промокание может привести к обезвоживанию кристаллов, однако контроль влажности в камере образца используется для минимизации этого эффекта. Хотя предполагается, что используется относительная влажность 90%, некоторые образцы могут извлечь выгоду из оптимизации влажности. Влажность может повлиять на эффективность промокательной бумаги, которая может медленно насыщаться водой. Кроме того, контроль влажности в камере образца может быть использован для улучшения дифракционного качества кристаллов30. Рекомендуется внести небольшие изменения (<5%) влажности перед проверкой дифракционной целостности, чтобы убедиться, что качество дифракции не ухудшается.
Оптимизация недрагоценных образцов может проводиться с помощью светового микроскопа вместо SEM. Несмотря на деструктивность, он полезен для оценки плотности кристаллов по всей сетке и для принятия решения о том, следует ли разбавлять или концентрировать образец для лучшего диспергирования кристаллов по всей сетке. Этот шаг наиболее полезен, когда имеется большое количество кристаллов и особенно высококонцентрированные образцы. Следует избегать слипания кристаллов(рисунок 3),так как, хотя это не является существенной проблемой, если два кристалла освещаются одновременно во время сбора данных6,вероятно, будет больший объем жидкости, окружающей сгусток, тем самым уменьшая сигнал-шум(рисунок 5). Хотя можно наблюдать большие избытки жидкости глобально по всей сетке с помощью светового микроскопа, оценка объема жидкости, окружающей микрокристаллы, и присутствия кристаллического льда может быть произведена только с помощью электронного микроскопа, оснащенного криогенной системой вакуумного переноса и ступенью. Иногда, после нанесения кристаллов на сетку и до того, как происходит промокание, кристаллы в растворах с низкой вязкостью могут оседать вдоль одного края сетки. Мы обнаружили, что добавление до 50% конечной концентрации этиленгликоля может замедлить движение кристаллов через каплю, обеспечивая лучшее распределение микрокристаллов по сетке, а также обеспечивая больший контроль над блоттингом за счет увеличения времени промоктирования(рисунок 3D).
Некоторые кристаллизационные растворы, содержащие вязкие осадители, такие как высокомолекулярные ПЭГ, могут оказаться сложными для промоктирования, требуя все более длительного времени промоктирования (>10 с). В таких случаях может быть полезно уменьшить объем жидкости, осажденной на задней части сетки, а также объем кристаллического раствора на стороне опорной пленки сетки. Такие стратегии, как использование 2 слоев промокатурной бумаги или стеклянных волокон, также могут помочь в этом сложном случае31.
Хотя этот конвейер подходит для растворимых белковых кристаллов, те, которые образуются в очень вязких средах, таких как мембранные белки в LCP, представляют собой другую проблему, для которой этот протокол не подходит. Тем не менее, появляются стратегии подготовки кристаллов LCP на сетках cryoTEM для microED, которые включают снижение вязкости образцов путем индуцирования фазового изменения lcp. Это позволяет наносить образцы на сетки аналогично тому, что описано в этой статье. Наконец, образец может быть измельчен сфокусирован ионным пучком для удаления излишков некристаллического материала32,33,34.
В целом, этот трубопровод, как правило, занимает 1-2 ч (включая время настройки оборудования), чтобы проследить от образца, поступающего в VMXm, до обеспечения оптимизированных сеток хорошо диспергированными, остеклованными образцами, в зависимости от наличия образцов, концентрации кристаллов и вязкости кристаллизационного раствора. Эти методы уже успешно применяются для подготовки микрокристаллов для рентгеновских дифракционных экспериментов, изучающих радиационное повреждение микрокристаллов, где минимальный объем жидкости, окружающей образец, был существенным28,35. Следует отметить, что протокол может быть применен ко всем растворимым микрокристаллическим образцам, а не только к хорошо дифрактируемым образцам, которые уже были оптимизированы. Эксперимент по кристаллизации, который производит микрокристаллический материал, традиционно будет целью для оптимизации с целью получения более крупных кристаллов, однако этот метод подготовки образцов и возможности VMXm могут позволить собирать адекватные данные из таких образцов без дальнейшей оптимизации. В качестве альтернативы, если такие микрокристаллические образцы плохо дифрагированы, данные, собранные из VMXm с использованием этого метода пробоподготовки, могут по-прежнему служить полезным руководством для дальнейшей оптимизации условий кристаллизации. Инструменты для подготовки сеток, включая разгрузку накаливания и погружную заморозку, в настоящее время широко доступны в научно-исследовательских институтах, оборудованных для экспериментов криотем, и будут доступны многим пользователям, что позволит им готовить образцы до начала времени луча на VMXm.

Основным барьером для определения структур биологических молекул с высоким разрешением методом высокомолекулярной кристаллографии (MX) остается получение кристаллов, дифракционизируемых скважин в податливом размере. Существует множество стратегий для достижения этой цели от проектирования конструкции гена рекомбинантного белка до поиска химических коктейлей в большой разреженной матрице, которые могут генерировать начальные кристаллы2. Для последнего часто бывает так, что кристаллографу необходимо оптимизировать любые начальные попадания для получения кристаллов с достаточным дифракционным качеством и размером для исследований определенияструктуры 3. Несмотря на эти варианты, некоторые молекулы-мишени могут никогда не генерировать большие (>10 мкм), хорошо дифрагирующие кристаллы, и в результате кристаллограф должен упорствовать с их микрокристаллами и проблемами, которые представляют такие образцы. К ним относятся надлежащая установка и криозащита кристаллов, управление по своей сути более слабой дифрацией и повышенной радиационной чувствительностью. Микрокристалы образуются из меньшего количества единичных клеток и молекул, чем более крупные кристаллы, и поэтому дифракция не усиливается в той же степени по сравнению с более крупными кристаллами, что приводит к более слабым интенсивностям дифракции. Важно, чтобы фоновый сигнал не маскировывал эти отражения, особенно при более высоком разрешении, где слабая интенсивность отражения может быть потеряна4. Кроме того, микрокристалла более чувствительны к радиационному повреждению и, несмотря на регистрацию дифракции при температуре жидкого азота5,может оказаться невозможным собрать полные данные из монокристалла, что делает необходимым сбор данных из очень большого количества кристаллов для получения единого полного набора данных6.
Растущая доступность рентгеновских лазеров на свободных электронах (XFELs) и эволюция методов серийной кристаллографии (SFX)7 обеспечили пути сбора данных из небольших микрокристаллов. Тем не менее, это индивидуальные методы доставки образцов, которые требуют значительного количества аппаратных и программных знаний, где эксперименты ограничены комнатной температурой и, как правило, потребление образца велико (сотни микролитров) и все еще может потребовать дальнейшей оптимизации8. Таким образом, проекты, в которых может быть изготовлено только ограниченное количество микрокристаллов, не подходят для SFX.
Между тем, технология синхротронных лучевых линий за последние десятилетия прогрессировала в создании меньших, более стабильных пучков9 с блеском, который позволил сбор данных из все меньших кристаллов10,11. Микрофокусные линии пучка, такие как FMX в NSLS-II и I24 в Diamond Light Source, смогли определить новые структуры из кристаллов с максимальными размерами ~ 3 мкм12 и продемонстрировать способность собирать полезные данные из еще меньших кристаллов размером ~ 1 мкм13. Линия луча должна быть точно сконфигурирована, с отличной оптикой с высоким разрешением по оси, минимальной сферой путаницы для вращения образца и точно выровненной осью вращения, которая совпадает с рентгеновским лучом. Важно точно сопоставить профиль рентгеновского пучка с объемом кристалла и убедиться, что кристалл точно выровнен в рентгеновском пучке - проблема для кристаллов <5 мкм14. Выполнение этих экспериментальных условий на линии луча имеет важное значение для записи данных наилучшего качества из микрокристаллов.
Оставшимся и, возможно, наиболее важным аспектом сбора данных из микрокристаллов является представление кристалла рентгеновскому пучку. Микрокристаллы часто монтировались на микросетчатых образцовых креплениях, изготовленных из полиимида, материала с низким рентгеновским рассеянием с отверстиями размером до 10 мкм15,16. Полиимидная сетка установлена на стандартном штифте, который устанавливается в магнитное основание SPINE, что делает ее совместимой с большинством лучевых линий MX17. Сетчатое крепление используется для ловли кристаллов из кристаллизации, часто следуя той же процедуре, что и монтаж кристалла 100 мкм с использованием стандартного петлевого крепления. В то время как кристаллы могут быть распределены по сетке, ключевым недостатком является то, что относительно большой объем жидкости может переноситься сеткой и штифтом во время сбора урожая(рисунок 1C,D). Этот объем жидкости, который может быть во много раз больше, чем сами кристаллы, будет способствовать фоновому шуму при освещении рентгеновскими лучами. Этот фоновый рассеяние может быть еще сильнее, если жидкость образует кристаллический лед во время внезапного охлаждения, уменьшая отношение сигнал/шум и без того слабых интенсивностей в пределах разрешений дифракции льда. Поэтому важно, чтобы избыток жидкости удалялся из образца, чтобы гарантировать, что все возможные сигналы могут быть записаны. Эта проблема еще больше в случае кристаллов мембранного белка, образующихся в липидной кубической фазе (LCP), где LCP генерирует сильное фоновое рассеяние и также трудно удалить из кристаллов 18.
Новая универсальная микрофокусная линия микрофокуса макромолекулярной кристаллографии (VMXm) в Diamond Light Source обеспечивает условия для сбора данных из кристаллов размером менее микрона. Линия луча была разработана для доставки профиля пучка размером 0,3 мкм x 0,5 мкм (VxH)1,гониометра со сферой путаницы не более 60 нм и среды образца в вакууме. Эти конструктивные особенности конечной станции VMXm минимизируют генерацию фонового рентгеновского шума аппаратом beamline во время сбора данных с наибольшим оставшимся источником фона, генерируемого образцом14.
Специальные методы пробоподготовки, разработанные для линии луча VMXm, дают возможность уменьшить этот фон и еще больше улучшить сигнал-шум дифракционных данных, максимизируя качество данных, которые могут быть записаны из микрокристаллов, измеряющих <10 мкм. Многие из требований, изложенных здесь для низкофоновой дифракции от микрокристаллов, также являются общими для криогенной просвечивающих электронных микроскопий (криотЭМ)19 и микрокристаллической электронной дифракции (микроED)20. В результате многие из инструментов, которые уже были разработаны для подготовки образцов криотЭМ, подходят, с некоторыми адаптациями, для приготовления микрокристаллов. При подготовке образцов для криотем для одиночных частиц исследуемые частицы встроены в очень тонкие слои (обычно <100 нм) стекловидного льда, так что электроны способны передаваться через образец. Тонкий однородный слой достигается путем смывания лишней жидкости, а витрификация образца достигается быстрым охлаждением образца (~104Кс-1)21путем погружения в жидкий этан, удерживаемый при ~93 К22. Напротив, жидкий азот, обычно используемый для пробоподготовки MX, является менее эффективным криогеном, чем этан, и имеет большую склонность к образованию кристаллического льда в образце21. Образование кристаллического льда, который может разлагать дифракцию и генерировать фоновый шум, обычно смягчается за счет использования криопротекторных соединений23. Низкомолекулярные полимеры, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ) 400 и метил-2,4-пентанедиол (MPD), сахара, масла или насыщенные соли, могут быть добавлены к аликвоте кристаллизационного раствора в низких концентрациях24- не существует универсального решения для выбора наиболее подходящего криопротектора, и это часто требует оптимизации25 . Кристалл также подвергается множественным манипуляциям во время сбора и криозащитного процесса, что может привести к повреждению кристалла, возможность использования жидкого этана позволяет пропускать этот этап и помогает защитить целостность кристалла.
В то время как жидкий этан является эффективным криогеном для микрокристаллов (<10 мкм) из-за тонкости образца, существуют альтернативные методы предотвращения образования кристаллического льда, особенно в более крупных кристаллах, включая снижение содержания воды в кристалле путем использования жестко контролируемой влажной среды26или путем впитывания избыточной жидкости как от петли, так и от поверхности кристалла27. , однако они снова требуют больших манипуляций с образцом. Использование автоматизированного промокания и погружной заморозки жидким этаном, как в криотэме, вместе удаляет избыточный кристаллизационный раствор и обеспечивает средство для контролируемой вспышки холодных микрокристаллов, пытаясь свести к минимуму манипуляции.
Здесь мы представляем протокол, который может быть использован не только пользователями лучевой линии VMXm и другими микрофокусными линиями пучка для сбора данных о дифракции высокого сигнал-шум, но также может быть полезен для тех, кто готовит образцы кристаллов мембранного белка на основе мембранных белков и детергентов для экспериментов с микроЭД. В то время как все средства для подготовки и оценки образцов доступны в VMXm, многие лаборатории структурной биологии все больше оснащаются для подготовки образцов cryoTEM. В результате мы предполагаем, что некоторые пользователи, возможно, пожелают использовать свои собственные средства для подготовки своих образцов к времени луча на VMXm.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Automated Cryo-EM plunge freezing instrument</td>
			<td>Leica or ThermoFisher</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop light microscope with light source</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blade/Scalpel</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTEM Copper 200 mesh grids with carbon support film with 2 &#181;m holes</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>N1-C16nCu20-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoTEM grid storage boxes</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>AGG3727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethane gas supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Glycol</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>146750010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass microscope slides</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>12383118</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass petri dish</td>
			<td>FisherBrand</td>
			<td>455732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glow discharging device</td>
			<td>Pelco</td>
			<td>91000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory wrapping film (Parafilm)</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>HS234526B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small, fine forceps</td>
			<td>Agar Scientific</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen supply</td>
			<td>n/a</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipetting devices</td>
			<td>Various</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealing tape for crystallisation plates.</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD6-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small/medium liquid nitrogen dewars</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>Various</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprung circlip clipping tool</td>
			<td>Subangstrom</td>
			<td>SCT08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatmann No.1 pre-cut filter paper</td>
			<td>Leica</td>
			<td>16706440</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a sample preparation pipeline for microcrystals at the vmxm beamline

Монтаж микрокристаллов (<10 мкм) для монокристаллической криокристаллографии представляет собой нетривиальную задачу. Улучшения качества данных были замечены для микрокристаллов с развитием лучевой оптики, стабильности луча и фокусировки переменного размера луча от субмикрона до микронов, например, на линии луча VMXm в Diamond Light Source1. Дальнейшее повышение качества данных будет получено за счет улучшения выборочной среды и подготовки образцов. Микрокристалла по своей природе генерируют более слабую дифракцию, поэтому улучшение сигнал-шум является ключом к сбору качественных данных о рентгеновской дифракции и будет преимущественно происходить за счет снижения фонового шума. Основными источниками рентгеновского фонового шума в дифракционном эксперименте являются их взаимодействие с воздушным трактом до и после образца, избыток кристаллизационного раствора, окружающий образец, наличие кристаллического льда и рассеяние от любых других лучевых приборов или рентгеновских окон. Лучевая линия VMXm включает в себя контрольно-измерительные приборы и протокол пробоподготовки для уменьшения всех этих источников шума.
Во-первых, вакуумная среда для отбора проб в VMXm удаляет воздушный путь между источником рентгеновского излучения и образцом. Далее, протоколы пробоподготовки для макромолекулярной кристаллографии в VMXm используют ряд процессов и инструментов, адаптированных из cryoTEM. К ним относятся медные решетки с дырянистыми углеродными опорными пленками, автоматизированная робототехника для промокления и погружного охлаждения с использованием жидкого этана. Эти инструменты позволяют получать сотни микрокристаллов на одной криотемной сетке с минимальным количеством окружающей жидкости на малошумной опоре. Они также минимизируют образование кристаллического льда из любой оставшейся жидкости, окружающей кристаллы. Представлен процесс подготовки и оценки качества растворимых белковых микрокристаллов с использованием видимого света и сканирующей электронной микроскопии перед установкой образцов на лучевую линию VMXm для экспериментов по дифракции рентгеновских лучей. Мы также предоставим примеры образцов хорошего качества, а также те, которые требуют дальнейшей оптимизации и стратегий для этого.

Целью этого протокола является получение остеклованных микрокристаллов с минимальным объемом жидкости, окружающей кристалл, которые позволяют проводить эксперименты по дифракции рентгеновских лучей с минимальным фоновым рассеянием для улучшения дифракционного сигнала. Примеры SEM-изображений микрокристалл, подготовленных на сетках cryoTEM для минимального фонового рассеяния, показаны на рисунках 1A, B и 2. Сетки с равномерно распределенными монокристаллами обеспечат наиболее эффективное использование сетки, с хорошим сигналом-шумом. Однако обычно это невозможно по всей сетке, и некоторые области могут отображать некоторое количество слипания(рисунок 2A, B). Несмотря на это слипание, эти примеры по-прежнему отображают полезное количество моноизолированных кристаллов, которые обеспечат низкую фоновую дифракцию(рисунок 5). Уровень блоттинга, который по-прежнему поддерживает низкий фоновый разброс, может варьироваться. Сильная промокающая так, что отверстия в углеродной опорной пленке хорошо видны, но кристаллы остаются гидратированными, является целью(рисунок 2C, D). Тем не менее, сетки хорошего качества все еще могут отображать некоторую жидкость в отверстиях опорной пленки, хотя положение отверстий все еще должно быть идентифицируемым(рисунок 2A, B). Важно отметить, что все эти примеры отображают одиночные, изолированные кристаллы с оципированным ореолом жидкости, окружающей кристалл, для поддержания гидратации между пятном и погружением замораживания.
Многие образцы могут потребовать дальнейшей оптимизации(рисунок 3),которая может включать изменение времени блоттинга или концентрации микрокристаллов. Сетки, перегруженные кристаллами, продемонстрируют снижение эффективности блоттинга и могут привести к тому, что несколько решеток будут записаны на одиночных дифракционных изображениях(рисунок 3A, B). Более вязкие условия кристаллизации, такие как для трипсина, который содержит 8% ПЭГ 4000 и 15% этиленгликоля(рисунок 3C),могут привести к необходимости более длительного времени промокления (>10 с). И наоборот, условия кристаллизации с очень низкой вязкостью, которые очень быстро промокают, могут страдать от проблем с распределением из-за гравитации, вызывающей оседание до того, как произойдет пятно, в результате чего все микрокристаллы оседают вдоль одной стороны сетки(рисунок 3D).
Оптимальная подготовка образцов позволяет использовать все возможности VMXm для сбора высококачественных рентгеновских дифракционных данных с максимально возможным разрешением с высоким соотношением сигнал-шум(рисунок 5). Эти образцы выигрывают от совместимости с средой выборки in-vacuo, что приводит к очень низкому или нулевому среднему количеству фона в дифракционных изображениях. Использование жидкого этана без криопротектора приводит к отсутствию ледяных колец(рисунок 5),хотя там, где кристаллы лежат близко к медным стержням решетки, рентгеновский пучок может заглядывать в стержни, что приводит к дифракционным кольцам медного порошка при ~2,1 Å и ~1,8 Å.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig01.jpg"> Рисунок 1:Сравнение микрокристаллического монтажа на микросетчатых креплениях и сетках cyoTEM. Сканируемые электронные микроснимки погруженных замороженных микрокристаллов вируса многогранник размером 2,5 мкм поперек(А, В)напряжение ускорения 5 кВ, размер пятна 39 (произвольные единицы) и время выдержки 16 мкс. Сетка свободна от избытка жидкости(А),вокруг кристаллов наблюдается узкий ореол жидкости(В). Те же образцы, установленные на микросетчатой (20 мкм апертуры) перед вспышкой охлаждения в жидком азоте и наблюдаемые с помощью системы осевого обзора на линии луча I24 лицевой стороной(C)и боковой стороной(D). Оптические искажения(C)при просмотре лицевой стороной дают представление о протяженности толщины жидкости по микросетчатой сетке, это более четко при просмотре микросетки сбоку(D). Красная мишень в C и D представляет положение и размер рентгеновского пучка. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig02.jpg"> Рисунок 2:Примеры образцов хорошего качества. Многогранные кристаллы(A),наблюдаемые на одном квадрате сетки ~100 мкм. В то время как некоторые кристаллы слегка слипаются и показывают некоторую связность окружающей жидкости, существует ряд изолированных монокристаллов с небольшим ореолом жидкости, окружающим кристалл. Немного более крупные кристаллы инсулина(B)размером ~ 5 х 5 мкм также показывают некоторое слипание, но опять же есть хорошо изолированные отдельные кристаллы. Игольчатые кристаллы могут иметь очень узкий размер и требовать микролуча, такого как эти игольчатые кристаллы лизоцима(C). Вокруг этих кристаллов можно увидеть узкую полосу жидкости (светло-серый гало). Более крупные микрокристаллы до десятков микрон также могут быть хорошо установлены на сетках cryoTEM, таких как эти ~ 7 мкм кристаллы протеиназы K(D). Как в(C),так и(D)и в меньшей степени в(A)отверстия углеродной опорной пленки хорошо видны, демонстрируя присутствие очень мало /вообще никакой жидкости. В примере В, хотя пустых отверстий не наблюдается, положение отверстий все еще может быть идентифицировано, что указывает на то, что жидкость только заполняет отверстия в опорной пленке. Во всех этих примерах ореол жидкости можно увидеть вокруг края квадрата сетки (округлый внутренний квадрат), где отверстия имеют более светло-серый вид. Это общая черта хорошо подготовленных сеток. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig03.jpg"> Рисунок 3:Примеры образцов, требующих дальнейшей оптимизации. Сетки, перегруженные микрокристаллами(А, В),могут увеличивать фоновое рассеяние, так как образцы блокируют отверстия в опорной пленке, снижая эффективность промокления, а при более высоком поверхностном натяжении между кристаллами остается больше жидкости. Помимо деградации сигнал-шум, приводящей к потере информации, вполне вероятно, что будут записаны несколько решеток. Использование времени промокания, которое недостаточно долго, или высоковязкого кристаллизационного раствора может привести к чрезмерно влажному образцу(C),также производящего низкий уровень сигнал-шум. Условия кристаллизации без осадителей, такие как условия для быжьего инсулина(D),имеют очень низкую вязкость. Хотя это приводит к очень короткому времени промоктирования, это также может привести к движению кристаллов по сетке до и во время пятнистости из-за воздействия гравитации. Это обычно приводит к в значительной степени пустой сетке с высокой концентрацией кристаллов вдоль одного края(D). Может быть выгодно добавлять вязкий агент, такой как этиленгликоль, в кристаллическую суспензию незадолго до нанесения их на сетку, чтобы уменьшить поток кристаллов и улучшить распределение кристаллов. Это также может удлинить время блоттинга, что облегчает наблюдение за блоттингом. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig04.jpg"> Рисунок 4:Инструменты для загрузки образцов в VMXm. Для загрузки держателей образцов VMXm(A)был разработан индивидуальный набор инструментов. Загрузчик образцов(B)имеет место для одного держателя образца VMXm, коробки сетки и хранения инструмента во время работы. Он также предназначен для работы чуть ниже поверхности жидкого азота и позволяет картриджу образца поместиться под ним(B). Воздушный шлюз dewar(C),который подходит к газовой коробке с азотом на конечной станции VMXm, используется для взятия загруженного картриджа образца из лаборатории в экспериментальную хотчу. Для просмотра образцов в автономном SEM был изготовлен изготовленный на заказ шаттл(D),состоящий из держателя образца VMXm без основания, чтобы обеспечить оценку в держателе образца, который используется на линии луча. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62306/62306fig05.jpg"> Рисунок 5: Пример дифракции от микрокристаллов в VMXm. Одно дифракционное изображение, записанное с помощью детектора Pilatus 3 6M на VMXm многогранного кристалла вируса ~3 мкм, установленного на сетке cryoTEM с использованием метода погружного замораживания. Дифракция наблюдается выше 1,7 Å, а отражение (синий квадрат) при 1,74 Å является вставкой, демонстрирующей низкий фоновый разброс с большим количеством пикселей с нулевыми значениями. Этиленгликоль до конечной концентрации 50% v/v добавляли к кристаллической суспензии перед нанесением ее на сетку. Низкий фоновый характер положения образца VMXm демонстрируется постоянным фоном по всему изображению, как показано интенсивностью, нанесенной под синей пунктирной линией, даже вблизи центра луча. Построенная интенсивность показывает, что фон остается ниже 3 отсчетов. Наблюдаются два слабых кольца при 2,15 Å и 1,86 Å, которые генерируются порошковой дифрацией меди сетки cryoTEM. Отсутствуют обнаруживаемые ледяные кольца, демонстрирующие эффективность промокления с последующим охлаждением жидким этаном. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62306/62306fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline at JoVE.com

A Sample Preparation Pipeline for Microcrystals at the VMXm Beamline

Отношение сигнал/шум данных является одним из наиболее важных соображений при выполнении измерений дифракции рентгеновских лучей из микрокристаллов. Лучевая линия VMXm обеспечивает среду с низким уровнем шума и микролуч для таких экспериментов. Здесь описаны методы пробоподготовки для монтажа и охлаждения микрокристаллов для VMXm и других микрофокусных макромолекулярных кристаллографических лучевых линий.

Конвейер пробоподготовки микрокристаллов на лучевой линии VMXm

The mounting of microcrystals (&#60;10 &#181;m) for single crystal cryo-crystallography presents a non-trivial challenge. Improvements in data quality ...

Стандартная пробоподготовка затрудняет достижение хорошего сигнала-шума во время рентгеновских дифракционных экспериментов микрокристаллов. Этот протокол направлен на контролируемое сокращение источников фоновых образованных кристаллов. Использование робототехники перфораторной заморозки и сеток cryoTEM обеспечивает надежную платформу для многократного манипулирования микрокристаллами, уменьшая объем окружающей жидкости и обеспечивая быструю витрификацию образца.Ловкость, необходимая для обработки сеток, аналогична той, которая необходима для традиционного сбора кристаллов. Другим важным фактором является определение начальных параметров промокшивания с использованием кристаллизационного раствора, что является ключом к сокращению использования образца. Для начала настройте и охладите автоматизированную морозильную камеру в соответствии с инструкциями производителя.Непосредственно перед использованием разряжайте сетки cryoTEM в течение 25 секунд с током 15 миллиампер и давлением 0,39 миллибар, затем храните сетки тлеющего разряда в покрытой чашке Петри. Установите относительную влажность пробной камеры на 90%, а время промоктирования на пять секунд. Убедитесь, что морозильная камера настроена на автоматическое погружение образца после завершения блоттинга.Откройте уплотнение кристаллизационого колодца и резервуара. Быстро добавляйте от двух до пяти микролитров резервуарного раствора в кристаллическую каплю для поддержания объема капли. Переложите 10 микролитров пластового раствора в трубку объемом 0,5 миллилитра для последующего использования и повторно засвершите скважину, чтобы предотвратить высыхание капли кристаллизации.Используйте погружные морозильные щипцы, чтобы выбрать одну сетку нагнетания на тлеющего нагнетания и загрузить сетку в инструмент углеродной стороной, обращенной в сторону от пятнистого рычага. Поверните щипцы, удерживающие сетку, так, чтобы карбоновая сторона была обращена к пятнистой руке. Используйте пипетку объемом 2,5 микролитра для нанесения двух микролитров резервуарного раствора на ненесущую сторону сетки cryoTEM.Поверните сетку углеродной стороной, обращенной в сторону от пятнистого рычага, и осторожно нанесите резервуарную жидкость на опорную сторону сетки из углеродной пленки. Инициируйте процесс промоктирования и наблюдайте за жидкостью, извлеченной из углеродной поверхности, пока не будет видна волна хлопнувания по поверхности сетки. Если волна хлопка не видна, увеличьте время пятнистости на одну-две секунды, прежде чем пятнистая рука втянется из сетки.Поместите кристаллизуальную пластину под световой микроскоп и поместите цель в поле зрения. Поместите свежую сетку тлеющего разряда в погружную морозильную камеру и нанесите резервуарную жидкость на неокрепежную сторону сетки, как показано ранее. Поверните сетку стороной опоры из углеродной пленки лицом к отверстию для отбора проб погружной морозильной камеры.Снимите временное уплотнение с кристаллизационный лист и используйте пипетку, установленную на два микролитра, чтобы аккуратно аспирировать каплю кристаллизации многократно. Перенесите два микролитра аспирированной микрокристаллической суспензии в погружную морозильную камеру и нанесите весь образец на углеродную сторону сетки cryoTEM. Инициируйте блоттинг и наблюдайте за волной хлопка, затем немедленно инициируйте погружение замораживания.Быстро перенесите сетку из жидкого этана в сетку, погруженную в жидкий азот. После промокания и погружения, замораживания сетки, втяните погруженную сетку из жидкого этана, сбросив морозильную камеру. Извлеките щипцы, удерживающие сетку, из морозильной камеры и поместите сетку под световой микроскоп.Отрегулируйте тонкую фокусировку и оцените плотность кристаллов по всей сетке. После загрузки сетки cryoTEM в SEM выровняйте образец и включите электронный пучок. Первоначально оцените всю сетку при 45-кратном увеличении и запишите изображение, затем увеличьте увеличение для более тщательного изучения отдельных квадратов сетки до тех пор, пока отдельные кристаллы не будут четко замечены.Перемещайтесь по сетке и захватывайте неподвижные изображения, гарантируя, что решетки плоские, а углеродная опорная пленка в значительной степени неповреждена. Убедитесь, что в кристалле есть многочисленные монокристаллы с узким ореолом остеклованной жидкости, и отверстия видны в углеродной опорной пленке. Наблюдая и захватывая изображения сетки, убедитесь, что большие области остеклованной жидкости отсутствуют, гексагональный лед или поверхностный лед не разбросаны по сетке, и что кристаллы не перекрываются и равномерно распределены по опорной пленке.В большом пенопластовом дьюаре охладите необходимое количество держателей образцов VMXm, загруженных в картридж для образцов. Добавьте жидкий азот выше положения образца в загрузчике проб. Быстро перенесите сетчатый ящик, содержащий сетки, нагруженные микрокристаллом, в углубление сетчатого ящика на загрузчике образцов и слегка открутите крышку, чтобы крышка была свободной и вращающейся.Поднимите сетку из коробки сетки и поверните сетку, чтобы положить сетку плоско на держатель образца. Быстро поместите предварительно охлажденный инструмент кругового скольжения над сеткой в отверстии сетки и нажмите кнопку, чтобы установить циркульпан. Добавьте жидкий азот примерно на 1,5 сантиметра выше держателя образца.Используйте щипцы для образцов VMXm, чтобы осторожно поднять держатель загруженного образца и поместить его обратно в картридж для образцов. Замените крышку картриджа, убедив, что штифт в верхней части картриджа взаимодействует с отверстием в крышке. Сканирующая электронная микрофотография микрокристалла, подготовленная на сетках cryoTEM, показала минимальный фоновый рассеяние.Сетка была свободна от избыточной жидкости, и вокруг кристаллов наблюдался узкий ореол жидкости. Многогранные кристаллы наблюдались как по отдельности, так и в сгустках. Немного более крупные кристаллы инсулина также показали некоторое слипание вместе с изолированными кристаллами.Очень крупные микрокристалла также были успешно установлены на сетках cryoTEM. Отверстия в углеродной опорной пленке были хорошо видны, что указывает на сильное пятно. Многие образцы требовали дальнейшей оптимизации из-за изменения времени блоттинга и концентрации микрокристаллов.Сетки, перегруженные кристаллами, снижают эффективность промокления, и несколько решеток были записаны на одном дифракционном изображении. Короткое время промокания для высоковязких кристаллизационных растворов может привести к чрезмерно влажному образцу. Для раствора кристаллизации с более низкой вязкостью короткое время промокшения приводит к краже микрокристаллов на одной стороне решеток.Оптимальная пробоподготовка позволяет использовать все возможности VMXm для сбора высококачественных рентгеновских дифракционных данных с максимально возможным разрешением с высоким отношением сигнал/шум. Определение начального промокления кристаллизационного раствора является ключом к использованию минимального образца. Если выборка очень ограничена, пропустите оценку плотности.В конечном счете, лучше иметь разбавленный образец. Эти образцы теперь готовы к экспериментам по дифракции рентгеновских лучей на VMXm Beamline, микрокристаллической электронной дифракции или фрезерованию сфокусированного ионного пучка до микро ЭД.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Подготовка и поставка белка микрокристаллов в липидной кубической фазе для последовательного фемтосекундного кристаллографии

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Пробоподготовка для массы на основе спектрометрии идентификации RNA-связывая регионов

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Подготовка образца плазмы для масс-спектрометрии с использованием автоматизированной рабочей станции

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Образец Подготовки для зонда Электроспрей ионизации масс-спектрометрии

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Клеточная культура на силиконовых нитридных мембранах и криопрепарат для синхротронного рентгеновского флуоресценции Нано-анализа

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Workflow and Tools for Crystallographic Fragment Screening at the Helmholtz-Zentrum Berlin

Рабочий процесс и инструменты для скрининга кристаллографических фрагментов в Берлинском центре Гельмгольца

Fragment screening is a technique that helps to identify promising starting points for ligand design. Given that crystals of the target protein are ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Протокол подготовки и передачи образцов для внутривакуумной длинноволновой кристаллографии на лучевой линии I23 на алмазном источнике света

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

Sample Preparation using a Lipid Monolayer Method for Electron Crystallographic Studies

Пробоподготовка липидным монослойным методом для электронно-кристаллографических исследований

Electron crystallography is a powerful tool for high-resolution structure determination. Macromolecules such as soluble or membrane proteins can be grown ...