Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Nous tenons à remercier Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli et Sadegh Davoudi d’avoir contribué à l’invention de la plateforme de culture MyoTACTIC et d’avoir établi les méthodes de fabrication et d’analyse décrites ici. HL a reçu un financement d’un programme de formation en génie du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie (CRSNG) en génie et en entrepreneuriat d’organes sur puce et d’une bourse d’études supérieures Wildcat de l’Université de Toronto. PMG est titulaire de la Chaire de recherche du Canada en réparation endogène et a reçu le soutien de l’Institut ontarien de médecine régénérative, du Réseau de cellules souches et de Medicine by Design, un programme d’excellence en recherche Canada First. Des diagrammes schématiques ont été créés avec BioRender.com.

1. Fabrication de plaques MYOCTACTIQUES PDMS
REMARQUE: La fabrication de plaques myotactices PDMS nécessite un moule négatif PU, qui peut être fabriqué comme décrit précédemment30. Le fichier SolidWorks de conception assistée par ordinateur (CAO) pour la conception de plaques MyoTACTIC a été mis à disposition sur GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
<ol><li>Préparer ~ 110 g de solution de polymère PDMS dans un gobelet e...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+price+of+innovation:+New+estimates+of+drug+development+costs.">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts.">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

Ce manuscrit décrit des méthodes pour fabriquer et analyser un modèle de culture 3D hMMT qui peut être appliqué à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. La plate-forme MyoTACTIC est économique, facile à fabriquer et nécessite un nombre relativement faible de cellules pour produire des microtissus musculaires squelettiques. Les mmTh formés au sein de la plateforme de culture MyoTACTIC sont constitués de myotubes alignés, multinuclé...

Le muscle squelettique est l’un des tissus les plus abondants dans le corps humain et soutient les fonctions clés du corps telles que la locomotion, l’homéostasie thermique et le métabolisme1. Historiquement, des modèles animaux et des systèmes de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) ont été utilisés pour étudier les processus biologiques et la pathogenèse des maladies, ainsi que pour tester des composés pharmacologiques dans le traitement des maladies musculaires squelettiques2,3. Alors que les modèles animaux ont grandement amélioré nos connaissances sur les muscles squelettiques en santé et en maladie, leur impact translationnel a été entravé par des coûts élevés, des considérations éthiques et des différences inter-espèces2,4. En se tournant vers les systèmes à base de cellules humaines pour étudier le muscle squelettique, les systèmes de culture cellulaire 2D sont favorables en raison de leur simplicité. Cependant, il y a une limite. Ce format échoue souvent à récapituler les interactions cellule-cellule et cellule-matrice extracellulaire qui se produisent naturellement dans le corps5,6. Au cours des dernières années, les modèles de muscles squelettiques tridimensionnels (3D) sont apparus comme une alternative puissante aux modèles animaux entiers et aux systèmes de culture 2D conventionnels en permettant la modélisation de processus physiologiquement et pathologiquement pertinents ex vivo7,8. En effet, une pléthore d’études ont rapporté des stratégies pour modéliser le muscle squelettique humain dans un format de culture 3D bioartificiel1. Une limite pour beaucoup de ces études est que la force active est quantifiée après le retrait des tissus musculaires des plates-formes de culture et la fixation à un transducteur de force, ce qui est destructeur et donc limité à servir de test final9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. D’autres ont conçu des systèmes de culture qui permettent des méthodes non invasives de mesure de la force active, mais tous ne se prêtent pas à des applications de test de molécules à haute teneur7,8,9,10,14 , 18,22,23, 24,25,26,27,28 ,29.
Ce protocole décrit une méthode détaillée pour fabriquer des microtissus musculaires humains (hMMT) dans la plate-forme de muscle squelettique (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC); un dispositif à plaque de 96 puits qui prend en charge la production en vrac de microtissus musculaires squelettiques3D 30. La méthode de fabrication de plaques MyoTACTIC permet la génération d’une plaque de culture de polydiméthylsiloxane (PDMS) de 96 puits et de toutes les caractéristiques de puits correspondantes en une seule étape de coulée, chaque puits nécessitant un nombre relativement faible de cellules pour la formation de microtissu. Les microtissus formés dans MyoTACTIC contiennent des myotubes alignés, striés et multinucléés qui sont reproductibles de puits en puits de l’appareil et, à maturation, peuvent répondre à des stimuli chimiques et électriques in situ30. Ici, la technique de fabrication d’un dispositif de plaque de culture PDMS MyoTACTIC à partir d’une réplique en polyuréthane (PU), une méthode optimisée pour mettre en œuvre des cellules progénitrices myogéniques humaines immortalisées pour fabriquer des hMMT, et l’évaluation fonctionnelle de la génération de force hMMT et des propriétés de manipulation du calcium sont décrites et discutées.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

Les modèles in vitro tridimensionnels (3D) du muscle squelettique constituent une avancée précieuse dans la recherche biomédicale, car ils offrent la possibilité d’étudier la réforme et le fonctionnement des muscles squelettiques dans un format évolutif qui se prête à des manipulations expérimentales. Les systèmes de culture musculaire 3D sont souhaitables car ils permettent aux scientifiques d’étudier le muscle squelettique ex vivo dans le contexte des cellules humaines. Les modèles 3D in vitro imitent étroitement certains aspects de la structure tissulaire native du muscle squelettique adulte. Cependant, leur application universelle est limitée par la disponibilité de plates-formes simples à fabriquer, coûteuses et conviviales, et produisant des quantités relativement élevées de tissus musculaires squelettiques humains. De plus, étant donné que le muscle squelettique joue un rôle fonctionnel important qui est altéré au fil du temps dans de nombreux états pathologiques, une plate-forme expérimentale pour les études de microtissu est plus pratique lorsque des mesures de force transitoire et contractile de calcium mini-invasives peuvent être effectuées directement dans la plate-forme elle-même. Dans ce protocole, la fabrication d’une plate-forme de 96 puits connue sous le nom de « MyoTACTIC » et la production en masse de microtissus musculaires squelettiques humains 3D (hMMT) sont décrites. En outre, les méthodes pour une application mini-invasive de la stimulation électrique qui permet des mesures répétées de la force musculaire squelettique et de la manipulation du calcium de chaque microtissu au fil du temps sont rapportées.

Les méthodes décrites ici sont les méthodes permettant de couler une plate-forme de culture myoTACtique à base de PDMS à 96 puits à partir d’un moule PU, de fabriquer des réseaux de tissus répliques hMMT et d’analyser deux aspects de la fonction hMMT dans la génération de force du dispositif de culture et la manipulation du calcium. La figure 1 offre un aperçu schématique de la préparation des puits de culture myotactique avant l’ensemencement de la hMMT. PDMS est un polym...

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Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour produire des réseaux de microtissus musculaires squelettiques humains en 3D et des tests de fonction in situ en aval mini-invasifs, y compris des analyses de force contractile et de manipulation du calcium.

Évaluation des mesures fonctionnelles de la santé des muscles squelettiques dans les microtissus musculaires squelettiques humains

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Notre protocole décrit des méthodes détaillées pour fabriquer et analyser une culture de microtissu de muscle squelettique humain en 3D. Les microtissus musculaires peuvent être appliqués à des études de biologie musculaire de base, à la modélisation de maladies ou à des tests de molécules candidates. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’évaluer in situ la force contractile et les transitoires calciques.Pour cette raison, vous pouvez mener des études longitudinales de la fonction du tissu musculaire. Brennen Musgrave et Heta Lad, des étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure. Deux à trois heures avant l’ensemencement cellulaire, placez une portion de six plaques tactiques bien douces dans un plat de culture cellulaire de 10 centimètres.Préparez bien chaque culture myotactique individuelle en ajoutant 100 microlitres d’une solution de F-127 pluronique à 5%. Utilisez le couvercle pour couvrir les puits et appliquez un film de paraffine pour sceller le plat. Centrifugez la boîte à 1 550 fois G pendant une minute dans une centrifugeuse équipée d’un adaptateur de spinner à plaque.Conservez la boîte de culture à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que les cellules soient prêtes pour l’ensemencement. Ensuite, décongelez lentement 150 microlitres aliquotes d’extrait de membrane basale et 110 microlitres aliquotes de thrombine sur la glace dans la hotte de culture. En travaillant dans la hotte de culture cellulaire, ajoutez 700 microlitres de solution saline à 0,9% à un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant sept milligrammes de fibrinogène en poudre.Placez le tube dans un incubateur de culture cellulaire de 37 degrés Celsius pendant trois à cinq minutes sans vortex. Retirez et faites glisser doucement le tube, puis faites tourner la solution dissoute dans une microcentrifugation avant de la renvoyer dans la hotte de culture. Filtrer la solution de fibrinogène à l’aide d’une seringue d’un millilitre équipée d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre.Ensuite, transférez la solution de fibrinogène dissoute dans la glace à côté de l’extrait de membrane basale et des aliquotes de thrombine. Préparez et préchauffez le milieu de croissance tissulaire à 37 degrés Celsius, qui sera introduit dans les puits de culture après l’ensemencement des tissus. Retirez les plaques de culture cellulaire de l’incubateur et aspirez le milieu de culture.Ensuite, lavez les cellules une fois en ajoutant cinq millilitres de DPBS dans chaque plaque de culture. Aspirer le DPBS et détacher les cellules en ajoutant un millilitre de 0,25% de trypsine EDTA dans chaque boîte de culture. Placez la plaque dans l’incubateur de culture cellulaire pendant trois minutes, maintenez la trypsine en ajoutant trois millilitres de milieu de lavage à la boîte de culture, puis transférez les cellules dans un tube conique de taille appropriée.Abattez les cellules en les centrifugant à 400 fois G pendant 10 minutes. Aspirer soigneusement le milieu sans endommager la pastille cellulaire, puis suspendre à nouveau les cellules dans un millilitre du milieu de lavage. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et d’un colorant bleu trypan sous microscopie à champ lumineux.Pour ensemencer six tissus, préparez suffisamment de cellules et de matrice extracellulaire pour huit tissus, tenant ainsi compte des pertes et de la formation de bulles. Transférez 1,2 million de cellules dans un nouveau tube conique, puis augmentez le volume à 10 millimètres avec un milieu de lavage. Abattez les cellules en les centrifugant à 400 fois G pendant 10 minutes.Préparer 150 microlitres de mélange ECM dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre et stocker le mélange sur de la glace jusqu’à utilisation. Aspirer le milieu du tube conique contenant les cellules, en prenant soin d’éviter la pastille cellulaire. Agitez vigoureusement l’extrémité du tube avec un doigt ganté jusqu’à ce que la pastille apparaisse comme une boue cellulaire.Transférer 120 microlitres de la solution ECM dans le tube contenant la boue cellulaire et pipeter soigneusement de haut en bas pour suspendre complètement les cellules dans l’ECM afin de générer une suspension à cellule unique. Évitez de créer des bulles, puis placez la suspension ECM cellulaire sur de la glace jusqu’à l’utilisation. Placez le plat réfrigéré de 10 centimètres contenant les puits myotactiques sur un sac de glace à l’intérieur de la hotte de culture cellulaire et aspirez la solution pluronique de F-127 de chaque puits.Laissez la solution pluronique résiduelle de F-127 se libérer du PDMS poreux et déposez-la au fond du puits en laissant les puits reposer pendant cinq minutes sur la glace, puis aspirer à nouveau. Pipettez soigneusement la suspension ECM de la cellule pour les remettre en suspension, puis transférez 105 microlitres de la suspension dans un tube frais et pré-réfrigéré de 1,5 millilitre en le saisissant près du sommet. Ajouter 0,84 microlitre de 100 unités par millilitre de solution mère de thrombine aux 105 microlitres de suspension ECM cellulaire.Pipette rapide et complète pour mélanger, en évitant l’introduction de bulles. Ajouter 15 microlitres du mélange ECM cellulaire à chaque puits sans presser la pipette dans le fond du puits. Avec deux mouvements légers, étalez la suspension cellulaire derrière chaque poteau du puits.Placez le couvercle sur la plaque de culture de 10 centimètres et transférez-le dans un incubateur de culture tissulaire de 37 degrés Celsius pendant environ cinq minutes. Ajouter 200 microlitres de milieux de croissance tissulaire préchauffés à chaque puits myotactique après la polymérisation du mélange ECM cellulaire. Remplacez le couvercle du plat de 10 centimètres et conservez-le dans l’incubateur jusqu’à la différenciation.Au cours d’une période de culture de 14 jours, les myoblastes ont montré les aspects du tissu natif en s’auto-organisant dans le puits de tactique douce pour former un microtissu 3D avec des myotubes striés multi-nucléés. Les myotubes ont des stries de sarcomères, qui ont été visualisées par immunocoloration pour l’alpha-actinine sarcomérique. Pour obtenir des myotubes bien alignés, les erreurs techniques telles que la formation de bulles lors du pipetage ou l’endommagement du revêtement pluronique lors de l’aspiration doivent être évitées.Un déplacement représentatif du poteau de la plaque de puits myotactique en réponse à une stimulation électrique à basse et haute fréquence est montré ici, indiquant que les myotubes répondent à des stimuli électriques variables et se contractent en conséquence. La quantification du post-déplacement permet la conversion en force contractile absolue des HMMT. L’éphémère en calcium sur les HMMT fabriqués à partir de myoblastes transduis par GCaMP6 a également été analysé en réponse à une stimulation à basse et haute fréquence.La quantification de l’intensité fluorescente peut être utilisée comme mesure des propriétés de manipulation du calcium des HMMT. La plupart des personnes qui effectuent cet ensemencement tissulaire pour la première fois ont du mal à ajouter la matrice extracellulaire cellulaire aux puits et à former des bulles. Nous recommandons de pratiquer la technique sur certains puits de culture de microtissu de rechange avec une solution visqueuse très simple avant la première tentative avec des cellules.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Les tissus d&#39;ingénierie muscle squelettique de myoblastes murins cellules progénitrices et application d&#39;une stimulation électrique

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Mesure de la force maximale isométrique généré par perméabilisées fibres du muscle squelettique

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Conçu vascularisé Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Tomodensitométrie et l&#39;imagerie optique du couplage de l&#39;ostéogenèse-angiogenèse à évaluer l&#39;intégration des crâniens autogreffes et allogreffes

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

des applications de<em&gt; In Vivo</em&gt; Tests fonctionnels du Rat jambier antérieur pour l&#39;évaluation de l&#39;ingénierie tissulaire Skeletal Muscle Repair

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Actionneur à base de cellules musculaires cardiaques et Biorobot auto-stabilisant - PARTIE 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Actionneur à base de cellules musculaires cardiaques et Biorobot auto-stabilisant - Partie 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Semi-automatisées longitudinale axée sur les Microcomputed tomographie Quantitative analyse structurale d’un modèle de Rat nu Fracture vertébrale liée à l’ostéoporose

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Faire fondre électrofilage écrit d’échafaudages Poly(ε-caprolactone) en trois dimensions avec des Morphologies contrôlables pour les Applications de génie tissulaire

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...