Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Wir danken Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli und Sadegh Davoudi für ihren Beitrag zur Erfindung der MyoTACTIC-Kulturplattform und zur Etablierung der hier beschriebenen Herstellungs- und Analysemethoden. HL erhielt Mittel aus einem Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Training Program in Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship und einem University of Toronto Wildcat Graduate Scholarship. PMG ist der Canada Research Chair in Endogenous Repair und erhielt für diese Studie Unterstützung vom Ontario Institute for Regenerative Medicine, dem Stem Cell Network und von Medicine by Design, einem Canada First Research Excellence Program. Schematische Diagramme wurden mit BioRender.com erstellt.

1. PDMS MyoTACTIC Plattenherstellung
HINWEIS: PDMS MyoTACTIC Plattenherstellung erfordert eine PU-Negativform, die wie zuvor beschrieben hergestellt werden kann30. Die CAD-SolidWorks-Datei (Computer-Aided Design) für die MyoTACTIC-Plattenkonstruktion wurde auf GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file) zur Verfügung gestellt.
<ol><li>Bereiten Sie ~ 110 g PDMS-Polymerlösung in einem Einweg-Kunststoffbecher im Verhältnis 1:15 von Monomer...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. 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H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

Dieses Manuskript beschreibt Methoden zur Herstellung und Analyse eines 3D-hMMT-Kulturmodells, das auf Studien der grundlegenden Muskelbiologie, Krankheitsmodellierung oder für die Prüfung von Kandidatenmolekülen angewendet werden kann. Die MyoTACTIC-Plattform ist kostengünstig, einfach herzustellen und benötigt eine relativ kleine Anzahl von Zellen, um Skelettmuskel-Mikrogewebe herzustellen. hMMTs, die innerhalb der MyoTACTIC-Kulturplattform gebildet werden, bestehen aus ausgerichteten, mehrkernigen und quergestrei...

Die Skelettmuskulatur ist eines der am häufigsten vorkommenden Gewebe im menschlichen Körper und unterstützt wichtige Körperfunktionen wie Fortbewegung, Wärmehomöostase und Stoffwechsel1. In der Vergangenheit wurden Tiermodelle und zweidimensionale (2D) Zellkultursysteme verwendet, um biologische Prozesse und Krankheitspathogenese sowie pharmakologische Verbindungen bei der Behandlung von Skelettmuskelerkrankungen zu untersuchen2,3. Während Tiermodelle unser Wissen über die Skelettmuskulatur in Gesundheit und Krankheit stark verbessert haben, wurde ihre translationale Wirkung durch hohe Kosten, ethische Überlegungen und Unterschiede zwischen den Artenbehindert 2,4. Bei der Hinwendung zu menschlichen zellbasierten Systemen zur Untersuchung der Skelettmuskulatur sind 2D-Zellkultursysteme aufgrund ihrer Einfachheit günstig. Es gibt jedoch eine Einschränkung. Dieses Format versäumt es oft, die Zell-Zell- und Zell-extrazellulären Matrix-Interaktionen zu rekapitulieren, die natürlich im Körper auftreten5,6. In den letzten Jahren haben sich dreidimensionale (3D) Skelettmuskelmodelle als leistungsfähige Alternative zu Ganzentiermodellen und herkömmlichen 2D-Kultursystemen herauskristallisiert, indem sie die Modellierung physiologisch und pathologisch relevanter Prozesse ex vivoermöglichen 7,8. Tatsächlich haben eine Vielzahl von Studien über Strategien zur Modellierung der menschlichen Skelettmuskulatur in einem bioartifiziellen 3D-Kulturformatberichtet 1. Eine Einschränkung für viele dieser Studien besteht darin, dass die aktive Kraft nach der Entfernung des Muskelgewebes von den Kulturplattformen und der Befestigung an einem Kraftaufnehmer quantifiziert wird, was destruktiv ist und daher darauf beschränkt ist, als Endpunkt-Assay zu dienen9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andere haben Kultursysteme entwickelt, die nicht-invasive Methoden zur Messung der Wirkkraft ermöglichen, aber nicht alle sind für Molekültestanwendungen mit hohem Gehalt geeignet7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Methode zur Herstellung von Human Muscle Microtissues (hMMTs) in der Skelettmuskel (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) Plattform; ein 96-Well-Plate-Gerät, das die Massenproduktion von 3D-Skelettmuskel-Mikrogeweben30unterstützt. Die MyoTACTIC-Plattenherstellungsmethode ermöglicht die Erzeugung einer 96-Well-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Kulturplatte und aller entsprechenden Well-Merkmale in einem einzigen Gießschritt, wobei jede Vertiefung eine relativ kleine Anzahl von Zellen für die Bildung von Mikrogeweben benötigt. Mikrogewebe, die in MyoTACTIC gebildet werden, enthalten ausgerichtete, gestreifte und mehrkernige Myotuben, die von Gut zu Brunnen des Geräts reproduzierbar sind und bei Reifung auf chemische und elektrische Reize in situ reagieren können30. Hierin werden die Technik zur Herstellung eines PDMS MyoTACTIC-Kulturplattengeräts aus einer Polyurethan (PU)-Replik, eine optimierte Methode zur Implementierung immortalisierter menschlicher myogener Vorläuferzellen zur Herstellung von hMMTs und die funktionelle Bewertung der technischen hMMT-Krafterzeugung und der Calciumhandhabungseigenschaften skizziert und diskutiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

Dreidimensionale (3D) In-vitro-Modelle der Skelettmuskulatur sind ein wertvoller Fortschritt in der biomedizinischen Forschung, da sie die Möglichkeit bieten, die Reform und Funktion der Skelettmuskulatur in einem skalierbaren Format zu untersuchen, das experimentellen Manipulationen zugänglich ist. 3D-Muskelkultursysteme sind wünschenswert, da sie es Wissenschaftlern ermöglichen, skelettierte Muskeln ex vivo im Kontext menschlicher Zellen zu untersuchen. 3D-In-vitro-Modelle ahmen Aspekte der nativen Gewebestruktur der erwachsenen Skelettmuskulatur genau nach. Ihre universelle Anwendung ist jedoch durch die Verfügbarkeit von Plattformen begrenzt, die einfach herzustellen, kostengünstig und benutzerfreundlich sind und relativ hohe Mengen an menschlichem Skelettmuskelgewebe liefern. Da die Skelettmuskulatur eine wichtige funktionelle Rolle spielt, die im Laufe der Zeit in vielen Krankheitszuständen beeinträchtigt wird, ist eine experimentelle Plattform für Mikrorisikostudien am praktischsten, wenn minimal-invasive Messungen der transienten und kontraktilen Kalziumkraft direkt in der Plattform selbst durchgeführt werden können. In diesem Protokoll wird die Herstellung einer 96-Well-Plattform namens "MyoTACTIC" und die Massenproduktion von 3D-Mikrogeweben (hMMTs) für menschliche Skelettmuskeln beschrieben. Darüber hinaus werden die Methoden für eine minimalinvasive Anwendung der elektrischen Stimulation beschrieben, die wiederholte Messungen der Skelettmuskelkraft und der Kalziumhandhabung jedes Mikrogewebes im Laufe der Zeit ermöglicht.

Beschrieben sind Hierin Verfahren zum Gießen einer 96-Well-PDMS-basierten MyoTACTIC-Kulturplattform aus einer PU-Form, zur Herstellung von Arrays von hMMT-Replikgeweben und zur Analyse von zwei Aspekten der hMMT-Funktion innerhalb der Kulturvorrichtung -Krafterzeugung und Calciumhandhabung. Abbildung 1 bietet einen schematischen Überblick über die Vorbereitung von MyoTACTIC-Kulturbohrungen vor der hMMT-Aussaat. PDMS ist ein weit verbreitetes Polymer auf Silikonbasis, das leicht geformt we...

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Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Dieses Manuskript beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Herstellung von Arrays von 3D-Mikrogeweben der menschlichen Skelettmuskulatur und minimalinvasiven Downstream-In-situ-Funktionsassays, einschließlich kontraktiler Kraft- und Kalziumhandhabungsanalysen.

Bewertung funktioneller Metriken der Skelettmuskelgesundheit in Mikrobeschwerden der menschlichen Skelettmuskulatur

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Unser Protokoll beschreibt detaillierte Methoden zur Herstellung und Analyse einer 3D-Mikrogewebekultur des menschlichen Skelettmuskels. Muskelmikrogewebe können für Studien der grundlegenden Muskelbiologie, Krankheitsmodellierung oder für Kandidatenmolekültests angewendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine In-situ-Beurteilung der kontraktilen Kraft und der Calciumtransienten ermöglicht.Aus diesem Grund können Sie Längsschnittuntersuchungen der Muskelgewebefunktion durchführen. Brennen Musgrave und Heta Lad, Doktoranden aus meinem Labor, werden das Verfahren demonstrieren. Legen Sie zwei bis drei Stunden vor der Zellaussaat eine sechs gut milde taktische Tellerportion in eine 10 Zentimeter große Zellkulturschale.Bereiten Sie jede einzelne myotaktische Kultur gut vor, indem Sie 100 Mikroliter einer 5% pluronischen F-127-Lösung hinzufügen. Verwenden Sie den Deckel, um die Vertiefungen abzudecken, und tragen Sie einen Paraffinfilm auf, um die Schüssel zu versiegeln. Zentrifugieren Sie die Schale bei 1.550 mal G für eine Minute in einer Zentrifuge, die mit einem Plattenspinneradapter ausgestattet ist.Lagern Sie die Kulturschale bei vier Grad Celsius, bis die Zellen für die Aussaat bereit sind. Dann langsam 150 Mikroliter Aliquot Basalmembranextrakt und 110 Mikroliter Aliquot Thrombin auf Eis in der Kulturhaube auftauen. In der Zellkulturhaube werden 700 Mikroliter 0,9% Kochsalzlösung zu einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen mit sieben Milligramm pulverisiertem Fibrinogen gegeben.Legen Sie das Röhrchen für drei bis fünf Minuten ohne Wirbelung in einen 37 Grad Celsius großen Zellkultur-Inkubator. Entfernen und streichen Sie das Röhrchen vorsichtig, dann pulsieren Sie die gelöste Lösung in einer Mikrozentrifuge, bevor Sie sie in die Kulturhaube zurückführen. Filtrieren Sie die Fibrinogenlösung mit einer Ein-Milliliter-Spritze, die mit einem 0,22-Mikrometer-Spritzenfilter ausgestattet ist.Dann die gelöste Fibrinogenlösung zusammen mit dem Basalmembranextrakt und den Thrombin-Aliquots auf Eis übertragen. Bereiten Sie die Gewebewachstumsmedien bei 37 Grad Celsius vor und erwärmen Sie sie vor, die nach der Aussaat der Gewebe in die Kulturtöpfe eingebracht werden. Entfernen Sie die Zellkulturplatten aus dem Inkubator und aspirieren Sie die Kulturmedien.Dann waschen Sie die Zellen einmal, indem Sie fünf Milliliter DPBS in jede Kulturplatte geben. Aspirieren Sie den DPBS und lösen Sie die Zellen, indem Sie einen Milliliter 0,25% Trypsin EDTA in jede Kulturschale geben. Legen Sie die Platte für drei Minuten in den Zellkultur-Inkubator, halten Sie das Trypsin, indem Sie drei Milliliter Waschmedium in die Kulturschale geben, und übertragen Sie die Zellen dann in ein konisches Röhrchen von geeigneter Größe.Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 mal G für 10 Minuten. Aspirieren Sie das Medium vorsichtig, ohne das Zellpellet zu beschädigen, und suspendieren Sie die Zellen dann in einem Milliliter des Waschmediums erneut. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und Trypanblaufarbstoff unter Hellfeldmikroskopie.Um sechs Gewebe zu säen, bereiten Sie genügend Zellen und extrazelluläre Matrix für acht Gewebe vor, wodurch Verluste und Blasenbildung berücksichtigt werden. Übertragen Sie 1,2 Millionen Zellen in ein neues konisches Rohr und erhöhen Sie dann das Volumen mit Waschmedium auf 10 Millimeter. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 400 mal G für 10 Minuten.Bereiten Sie 150 Mikroliter ECM-Mischung in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor und lagern Sie die Mischung bis zur Verwendung auf Eis. Aspirieren Sie das Medium aus dem konischen Röhrchen, das die Zellen enthält, und achten Sie darauf, das Zellpellet zu vermeiden. Streichen Sie kräftig mit einem behandschuhten Finger über das Ende der Röhre, bis das Pellet als Zellschlamm erscheint.Übertragen Sie 120 Mikroliter der ECM-Lösung auf das Röhrchen, das die Zellschlämme enthält, und pipettieren Sie vorsichtig auf und ab, um die Zellen innerhalb des ECM vollständig neu zu suspendieren, um eine einzelne Zellsuspension zu erzeugen. Vermeiden Sie die Bildung von Blasen und legen Sie die EcM-Suspension der Zelle bis zur Verwendung auf Eis. Legen Sie die gekühlte 10-Zentimeter-Schale mit den myotaktischen Vertiefungen auf einen Eisbeutel in der Zellkulturhaube und saugen Sie die pluronische F-127-Lösung aus jeder Vertiefung ab.Lassen Sie die verbleibende pluronische F-127-Lösung aus dem porösen PDMS austreten und setzen Sie sich auf dem Boden des Bohrlochs ab, indem Sie die Vertiefungen fünf Minuten lang auf Eis sitzen lassen und dann erneut absaugen. Pipettieren Sie die EcM-Zellsuspension vorsichtig, um die Zellen wieder zu suspendieren, und übertragen Sie dann 105 Mikroliter der Suspension in ein frisches, vorgekühltes 1,5-Milliliter-Röhrchen, indem Sie es nahe an der Oberseite greifen. Fügen Sie 0,84 Mikroliter à 100 Einheiten pro Milliliter Thrombin-Stammlösung zu den 105 Mikrolitern Zell-ECM-Suspension hinzu.Pipettieren Sie schnell und gründlich, um zu mischen, und vermeiden Sie die Einführung von Blasen. Fügen Sie 15 Mikroliter der Zell-ECM-Mischung zu jeder Vertiefung hinzu, ohne die Pipette in den Boden der Vertiefung zu drücken. Verteilen Sie mit zwei leichten Bewegungen die Zellsuspension hinter jedem Pfosten im Brunnen.Legen Sie den Deckel auf die 10 Zentimeter große Kulturplatte und geben Sie ihn für etwa fünf Minuten in einen 37 Grad Celsius großen Gewebekultur-Inkubator. Fügen Sie 200 Mikroliter vorgewärmtes Gewebewachstumsmedium zu jedem myotaktischen Brunnen hinzu, nachdem die Zell-ECM-Mischung polymerisiert wurde. Ersetzen Sie den Deckel der 10-Zentimeter-Schale und bewahren Sie ihn bis zur Differenzierung im Inkubator auf.Während einer 14-tägigen Kulturperiode zeigten Myoblasten die Aspekte des nativen Gewebes, indem sie sich in der milden Taktik gut selbst organisierten, um ein 3D-Mikrogewebe mit mehrkernigen gestreiften Myotuben zu bilden. Myotuben haben Sarkomerstreifen, die durch Immunfärbung für sarkomerisches Alpha-Actinin visualisiert wurden. Um gut ausgerichtete Myotuben zu erreichen, sollten technische Fehler wie Blasenbildung beim Pipettieren oder schädliche pluronische Beschichtungen während der Aspiration vermieden werden.Eine repräsentative Verschiebung des myotaktischen Wellplattenpfostens als Reaktion auf nieder- und hochfrequente elektrische Stimulation ist hier gezeigt, was darauf hindeutet, dass Myotuben auf unterschiedliche elektrische Reize reagieren und sich entsprechend zusammenziehen. Die Quantifizierung der Postverschiebung ermöglicht die Umwandlung der HMMTs in absolute kontraktile Kraft. Calciumtransienz auf HMMTs aus GCaMP6-transduzierten Myoblasten wurden ebenfalls als Reaktion auf nieder- und hochfrequente Stimulation analysiert.Die Quantifizierung der Fluoreszenzintensität kann als Messung der Calcium-Handling-Eigenschaften von HMMTs verwendet werden. Die meisten Menschen, die diese Gewebeaussaat zum ersten Mal durchführen, kämpfen mit der Zugabe der extrazellulären Zellmatrix zu den Vertiefungen und mit der Bildung von Blasen. Wir empfehlen, die Technik vor dem ersten Versuch mit Zellen an einigen Ersatz-Mikrogewebekulturtöpfen mit einer sehr einfachen viskosen Lösung zu üben.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Die Messung der isometrischen Maximalkraft von permeabilisierten Skelettmuskelfasern generiert

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Engineered Vaskularisierte Muskellappen

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Computertomographie und Optical Imaging von Osteogenesis-Angiogenese-Kopplung an Integration von Schädelknochen Autografts und Allografts Beurteilen

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Anwendungen<em&gt; In Vivo</em&gt; Funktionstest der Ratte Vorderer Schienbeingewebe Skeletal Muscle Repair Engineered für die Bewertung

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Herzmuskelzellbasierter Aktuator und selbststabilisierender Biorobot - TEIL 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Herzmuskelzell-basierter Aktuator und selbststabilisierender Biorobot - Teil 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Parallelisierter längs Microcomputed Tomographie-basierten quantitativen Strukturanalyse von einem nackten Rattenmodell Osteoporose bedingte Wirbelfraktur

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Elektrospinnen Schreiben von dreidimensionalen Poly(ε-caprolactone) Gerüste mit steuerbaren Morphologien für Tissue Engineering Anwendungen zu schmelzen

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...