Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

ברצוננו להודות למוחמד אפשר, הבן אברהא, מוחסן אפשר-בקושלי וסאדה דאבודי על תרומתם להמצאת פלטפורמת התרבות המיומטקטית והקמת שיטות הייצור והניתוח המתוארות כאן. HL קיבלה מימון מתוכנית הכשרה של המועצה למדעי הטבע ומחקר ההנדסה (NSERC) במלגת הנדסה ויזמות של אוניברסיטת טורונטו וילדקט. PMG הוא יו"ר המחקר בקנדה בתיקון אנדוגני וקיבל תמיכה למחקר זה ממכון אונטריו לרפואה רגנרטיבית, רשת תאי הגזע, ומרפואה על ידי עיצוב, תוכנית מצוינות מחקר ראשונה בקנדה. דיאגרמות סכמטיות נוצרו באמצעות BioRender.com.

1. ייצור צלחת מיוטקטית PDMS
הערה: ייצור צלחת MyoTACTIC PDMS דורש עובש PU שלילי, אשר ניתן לייצר כפי שתואר בעבר30. קובץ SolidWorks של עיצוב בעזרת מחשב (CAD) עבור עיצוב הלוחות MyoTACTIC הפך לזמין ב- GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
<ol><li>הכן ~ 110 גרם של פתרון פולימר PDMS בכוס פלסטיק חד פ?...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+price+of+innovation:+New+estimates+of+drug+development+costs.">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts.">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

כתב יד זה מתאר שיטות לפברק ולנתח מודל תרבות hMMT תלת-ממדי שניתן ליישם במחקרים של ביולוגיה בסיסית של שרירים, מידול מחלות או לבדיקת מולקולות מועמדות. פלטפורמת MyoTACTIC ידידותית לעלות, קלה לייצור, ודורשת מספר קטן יחסית של תאים כדי לייצר מיקרוטיסות שרירי השלד. h hMMTs שנוצר בתוך פלטפורמת התרבות MyoTACTIC מ?...

שריר השלד הוא אחת הרקמות הנפוצות ביותר בגוף האדם ותומך בתפקודי גוף מפתח כגון קטר, הומאוסטזיס חום ומטבוליזם1. מבחינה היסטורית, מודלים של בעלי חיים ומערכות תרבית תאים דו-ממדיות (2D) שימשו לחקר תהליכים ביולוגיים ופתוגנזה של מחלות, כמו גם לבדיקת תרכובות פרמקולוגיות בטיפול במחלות שרירי השלד2,3. בעוד מודלים של בעלי חיים שיפרו מאוד את הידע שלנו על שרירי השלד בבריאות ובמחלות, השפעתם התרגומית נפגעה על ידי עלויות גבוהות, שיקולים אתיים והבדלים בין המינים2,4. בפנייה למערכות מבוססות תאים אנושיים כדי לחקור את שרירי השלד, מערכות תרבית תאים דו-פעמיות הן חיוביות בשל הפשטות שלהן. עם זאת, יש מגבלה. תבנית זו לעתים קרובות נכשלת לשחזר את התא-תא ואינטראקציות מטריצה חוץ תאית המתרחשות באופן טבעי בתוך הגוף5,6. במהלך השנים האחרונות, מודלים תלת ממדיים (תלת-ממדיים) של שרירי השלד התגלו כחלופה רבת עוצמה למודלים של בעלי חיים שלמים ומערכות תרבות דו-ממדיות קונבנציונליות על ידי מתן אפשרות למודלים של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית ופתולוגית ex vivo7,8. ואכן, שפע של מחקרים דיווחו על אסטרטגיות למודל שריר השלד האנושי בפורמט תרבות תלת-ממדית ביו-ארטיפיאלית1. מגבלה אחת לרבים ממחקרים אלה היא שכוח פעיל כומת בעקבות הסרת רקמות השריר מפלטפורמות התרבות וההצמדה למתמר כוח, שהוא הרסני ומכאן מוגבל לשמש כנקודת קצה9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. אחרים עיצבו מערכות תרבות המאפשרות שיטות לא פולשניות למדידת כוח פעיל, אך לא כולן מקובלות על יישומים לבדיקת מולקולות תוכן גבוה7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
פרוטוקול זה מתאר שיטה מפורטת לפברק מיקרוטיסות שריר אנושי (hMMTs) בשריר השלד (Myo) microTissue Array סטייה כדי לחקור forCe (MyoTACTIC) פלטפורמה; התקן צלחת 96 היטב התומך בייצור בתפזורת של מיקרוטיסוסות שריר השלד30. שיטת ייצור הלוח MyoTACTIC מאפשרת ייצור של צלחת תרבות 96 טוב polydimethylsiloxane (PDMS) וכל התכונות המתאימות היטב בשלב יציקה אחד, לפיה כל באר דורשת מספר קטן יחסית של תאים להיווצרות microtissue. Microtissues שנוצר בתוך MyoTACTIC מכילים myotubes מיושר, מפוספס, רב גרעיני כי הם לשחזור מבאר לבאר של המכשיר, ועל ההתבגרות, יכול להגיב לגירויים כימיים וחשמליים במקום30. להלן, הטכניקה לייצור התקן לוח תרבות MyoTACTIC PDMS משכפול פוליאוריטן (PU), שיטה ממוטבת ליישום תאי אבות מיוגניים אנושיים מונצחים כדי לפברק hMMTs, ואת ההערכה התפקודית של ייצור כוח hMMT מהונדס תכונות טיפול בסידן מתוארים ונדונים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

מודלים תלת-ממדיים (3D) במבחנה של שריר השלד הם התקדמות חשובה במחקר הביו-רפואי מכיוון שהם מאפשרים את ההזדמנות ללמוד רפורמציה בשרירי השלד ולתפקד במתכונת מדרגית הניתנת למניפולציות ניסיוניות. מערכות תרבית שרירים תלת-ממדיות רצויות מכיוון שהן מאפשרות למדענים לחקור את שרירי השלד אקס ויו בהקשר של תאים אנושיים. מודלים במבחנה תלת-ממדית מחקים מקרוב היבטים של מבנה הרקמה המקומי של שריר השלד הבוגר. עם זאת, היישום האוניברסלי שלהם מוגבל על ידי הזמינות של פלטפורמות כי הם פשוטים לפברק, עלות וידידותי למשתמש, ולהניב כמויות גבוהות יחסית של רקמות שריר השלד האנושי. בנוסף, מכיוון ששריר השלד ממלא תפקיד תפקודי חשוב הפוגע לאורך זמן במדינות מחלה רבות, פלטפורמה ניסיונית למחקרי מיקרוטיסו היא המעשית ביותר כאשר מדידות כוח סידן חולפות וצמצמות זעיר פולשניות יכולות להתבצע ישירות בתוך הפלטפורמה עצמה. בפרוטוקול זה, ייצור של פלטפורמה 96-well המכונה 'MyoTACTIC', וייצור המוני של microtissues שריר השלד האנושי 3D (hMMTs) מתואר. בנוסף, השיטות ליישום זעיר פולשני של גירוי חשמלי המאפשר מדידות חוזרות ונשנות של כוח שריר השלד וטיפול בסידן של כל מיקרוטיסה לאורך זמן מדווחות.

מתוארות כאן שיטות להטיל פלטפורמת תרבות MyoTACTIC מבוססת PDMS בת 96 טוב מתבנית PU, לפברק מערכים של רקמות העתק hMMT, ולנתח שני היבטים של פונקציית hMMT בתוך ייצור ייצור כוח התקן התרבות וטיפול בסידן. איור 1 מציע סקירה סכמטית של הכנת בארות התרבות MyoTACTIC לפני זריעת hMMT. PDMS הוא פולימר מבוסס סיליקו...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור מערכים של מיקרוטיסות שרירי השלד האנושיים בתלת-ממד ופולשניות מינימלית במורד הזרם בתקיפות תפקודיות, כולל כוח התכווצות ניתוחי טיפול בסידן.

הערכת מדדים תפקודיים של בריאות שריר השלד במיקרוטיסוסות שריר השלד האנושי

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

הפרוטוקול שלנו מתאר שיטות מפורטות כדי לפברק ולנתח תרבית מיקרוטיסו של שלד אנושי 3D. מיקרוטיסוות שרירים ניתן ליישם מחקרים של ביולוגיה שריר בסיסית, מודל מחלות, או לבדיקת מולקולות מועמד. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת הערכה במקום של כוח התכווצות וסידן ארעי.בגלל זה, אתה יכול לנהל מחקרים אורך של תפקוד רקמת השריר. שיוכיחו את ההליך יהיו ברנן מסגרייב והטה לאד, סטודנטים לתואר שני מהמעבדה שלי. שעתיים עד שלוש שעות לפני זריעת התא, מניחים צלחת טקטיקה קלה היטב לתוך צלחת תרבית תאים 10 ס"מ.הכן כל תרבות מיוטקטית בנפרד היטב על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של פתרון F-127 פלורוני 5%. השתמש במכסה כדי לכסות את בארות, ולהחיל סרט פרפין כדי לאטום את המנה. צנטריפוגות את המנה ב 1, 550 פעמים G במשך דקה אחת בצנטריפוגה מצויד מתאם ספינר צלחת.מאחסנים את צלחת התרבות בארבע מעלות צלזיוס עד התאים מוכנים לזרוע. ואז להפשיר לאט 150 aliquot מיקרוליטר של תמצית קרום המרתף, ו 110 aliquot מיקרוליטר של תרומבין על קרח בשכונת התרבות. עבודה במכסה המנוע תרבית התא, להוסיף 700 microliters של 0.9% תמיסת מלח צינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר המכיל שבעה מיליגרם של פיברינוגן אבקת.מניחים את הצינור בחממה של 37 מעלות צלזיוס לתרבות תאים למשך שלוש עד חמש דקות ללא מערבולת. הסר ולהעיף את הצינור בעדינות, ולאחר מכן הדופק לסובב את התמיסה מומסת בצנטריפוגה מיקרו לפני החזרתו למכסה המנוע התרבותי. סנן את פתרון הפיברינוגן באמצעות מזרק מיליליטר אחד מצויד במסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.לאחר מכן להעביר את פתרון פיברינוגן מומס לקרח לצד תמצית קרום המרתף aliquots תרומבין. להכין ולחמם מראש את מדיה צמיחת הרקמות ב 37 מעלות צלזיוס, אשר יוצג בארות התרבות לאחר זריעת הרקמות. הסר את לוחות תרבית התא מן האינקובטור ושאף את התקשורת התרבותית.לאחר מכן לשטוף את התאים פעם אחת על ידי הוספת חמישה מיליליטר של DPBS לתוך כל צלחת תרבות. שאפו את ה- DPBS וניתקו את התאים על ידי הוספת מיליליטר אחד של 0.25% טריפסין EDTA לכל מנת תרבות. מניחים את הצלחת באינקובטור תרבית התא במשך שלוש דקות, מחזיקים את טריפסין על ידי הוספת שלושה מיליליטר של מדיום כביסה לצלחת התרבות, ולאחר מכן להעביר את התאים לצינור חרוטי בגודל המתאים.גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך 10 דקות. שאפו את התקשורת בזהירות מבלי לפגוע בכדור התא, ואז השעו מחדש את התאים במיליליטר אחד של מדיום הכביסה. ספירת התאים באמצעות hemocytometer וצבע כחול טריפן תחת מיקרוסקופיית שדה בהירה.כדי לזרוע שש רקמות, להכין מספיק תאים מטריצה חוץ תאית עבור שמונה רקמות, ובכך להסביר הפסדים היווצרות בועה. להעביר 1.2 מיליון תאים לצינור חרוט חדש, ולאחר מכן להגדיל את הנפח ל 10 מילימטרים עם לשטוף בינוני. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 400 פעמים G במשך 10 דקות.הכן 150 מיקרוליטרים של תערובת ECM בצינור צנטריפוגה מיקרו 1.5 מיליליטר, ולאחסן את התערובת על קרח עד השימוש. שאפו את התקשורת מן הצינור חרוטי המכיל את התאים, דואגים למנוע את גלולה התא. מעביר במרץ את קצה הצינור עם אצבע בכפפה עד שהכדור מופיע כתרנגולת.העבר 120 מיקרוליטרים של פתרון ECM לצינור המכיל את התסיסה של התא, ובזהירות pipette למעלה ולמטה כדי להשעות מחדש לחלוטין את התאים בתוך ECM כדי ליצור השעיה תא אחד. הימנע יצירת בועות, ולאחר מכן מניחים את השעיית ECM התא על קרח עד השימוש. מניחים את צלחת 10 ס"מ בקירור המכילה את בארות myotactic על גבי חבילת קרח בתוך מכסה המנוע תרבות התא, ושאפו את פתרון F-127 פלורוני מכל באר.אפשר פתרון F-127 פלורוני שיורית לשחרר מן PDMS נקבובי, להתיישב לתחתית הבאר על ידי מתן בארות לשבת במשך חמש דקות על קרח, ולאחר מכן לשאוף שוב. Pipette השעיית ECM התא בזהירות להשעות מחדש את התאים, ולאחר מכן להעביר 105 microliters של ההשעיה לתוך צינור טרי, מקורר מראש 1.5 מיליליטר על ידי אחיזתו קרוב לפסגה. הוסף 0.84 מיקרוליטרים של 100 יחידות למיליליטר פתרון מלאי תרומבין ל 105 microliters של השעיית ECM תא.Pipette במהירות וביסודיות לערבב, הימנעות כניסת בועות. מוסיפים 15 מיקרוליטרים של תערובת ECM התא לכל באר מבלי ללחוץ על הפיפטה לתחתית הבאר. בשתי תנועות אור, פזור את מתלה התא מאחורי כל עמוד בבאר.מניחים את המכסה על צלחת התרבות 10 ס"מ ומעבירים אותו לאינקובטור תרבית רקמות צלזיוס של 37 מעלות במשך כחמש דקות. הוסף 200 מיקרוליטרים של מדיה לצמיחת רקמות שחוממה מראש לכל באר מיוטקטית לאחר שתערובת ה- ECM התאית הפכה לפולימרית. החליפו את המכסה על צלחת 10 ס"מ ולשמור אותו באינקובטור עד ההבחנה.במהלך תקופת תרבית של 14 יום, myoblasts הציג את ההיבטים של רקמה מקומית על ידי ארגון עצמי בטקטיקה קלה גם כדי ליצור microtissue 3D עם מיוטיובים מפוספסים מרובי גרעין. Myotubes יש פסים sarcomere, אשר היו דמיינו על ידי חיסון עבור actinin אלפא סרקומרי. כדי להשיג מיוטיובים מיושרים היטב, שגיאות טכניות כגון היווצרות בועה בעת צנרת, או ציפוי פלורוני מזיק במהלך השאיפה, יש להימנע.תזוזה מייצגת של פוסט צלחת הבאר myotactic בתגובה לגירוי חשמלי בתדר נמוך וגבוה, מוצג כאן, המציין כי myotubes מגיב לגירויים חשמליים שונים להתכווץ בהתאם. כימות של עקירת הפוסט מאפשר המרה לכוח התכווצות מוחלט של הממ"ד. ארעיות סידן על הממ"ח העשויה ממימובלטס GCaMP6-transduced נותחו גם בתגובה לגירוי בתדר נמוך וגבוה.כימות של עוצמת פלואורסצנטית יכול לשמש מדידה עבור תכונות טיפול סידן של MMTs. רוב האנשים המבצעים זו זריעת רקמה בפעם הראשונה, נאבקים עם הוספת מטריצה חוץ תאית לבארות, ועם היווצרות בועה. אנו ממליצים לתרגל את הטכניקה על כמה בארות תרבות microtissue חילוף עם פתרון צמיג פשוט מאוד לפני הניסיון הראשון עם תאים.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

מדידה המרבית איזומטרי הכוח שנוצרה על ידי סיבי שריר שלד permeabilized

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

דש שריר כלי דם מהונדס

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

יישומים של<em&gt; In vivo</em&gt; בדיקות פונקציונליות של עכברוש השוקה הקדמי להערכת רקמות מהונדסות תיקון שרירי שלד

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

תא שריר לב מבוסס מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

שריר הלב מבוססי תא מפעיל ומייצב עצמי ביורובוט - חלק 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Semiautomated האורך מבוסס-טומוגרפיה Microcomputed כמותיים ניתוח מבנה של מודל הקשורות אוסטיאופורוזיס שבר בחוליות עכברוש עירום

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

להמיס Electrospinning הכתיבה של פיגומים Poly(ε-caprolactone) תלת מימדי עם מורפולוגיות לשליטה עבור יישומי הנדסת רקמות

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...