Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

우리는 모하마드 아프샤르, 하벤 아브라하, 모센 아프샤르-바쿠쉬리, 사데다부디에게 MyoTACTIC 문화 플랫폼의 발명에 기여하고 여기에 설명된 제조 및 분석 방법을 확립해 주셔서 감사합니다. HL은 오르간 온-칩 엔지니어링 및 기업가 정신 장학금 및 토론토 와일드캣 대학 졸업생 장학금의 자연 과학 및 공학 연구 위원회 (NSERC) 교육 프로그램에서 자금을 받았다. PMG는 내인성 수리에 있는 캐나다 연구 의자이고 재생 의학을 위한 온타리오 연구소, 줄기 세포 네트워크 및 디자인에 의하여 의학에서 이 연구 결과에 대한 지원을 수신했습니다, 캐나다 첫번째 연구 우수성 프로그램. 회로도 는 BioRender.com 함께 만들어졌습니다.

1. PDMS 심오전술 플레이트 제작
참고 : PDMS 근로식 플레이트 제작은 이전에 설명 된30과같이 제조 될 수있는 PU 음성 금형이 필요합니다. MyoTACTIC 플레이트 설계를 위한 컴퓨터 지원 설계(CAD) SolidWorks 파일은 GitHub(https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file)에서 사용할 수 있게 되었습니다.
<ol><li>실리콘 엘라스토머 키트의 성분을 이용하여 단량제에 단조량...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+price+of+innovation:+New+estimates+of+drug+development+costs.">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts.">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

이 원고는 기본 근육 생물학, 질병 모델링 또는 후보 분자 테스트에 적용할 수 있는 3D hMMT 배양 모델을 제조하고 분석하는 방법을 설명합니다. MyoTACTIC 플랫폼은 비용 친화적이고 제조가 용이하며 골격 근육 미세 조직을 생산하기 위해 상대적으로 적은 수의 세포가 필요합니다. 근로전술 배양 플랫폼 내에 형성된 hMMT는 정렬, 다핵, 및 축소된 심포우로 구성되며, 수축을 유발하는 칼슘 과도를 시동?...

골격 근은 인체에서 가장 풍부한 조직 중 하나이며 운동, 열 항상성 및 신진 대사1과같은 주요 신체 기능을 지원합니다. 역사적으로, 동물 모델 및 2차원(2D) 세포 배양 시스템은 생물학적 과정및 질병 병인을 연구하고, 골격 근질환 의 치료에 약리학적 화합물을 테스트하는 데 사용되어왔다2,3. 동물 모델은 건강과 질병에 있는 골격 근육에 대한 우리의 지식을 크게 향상시켰지만, 그들의 번역 영향은 높은 비용, 윤리적 고려 사항 및 종 간 차이2,4에의해 방해되었습니다. 골격 근육을 연구하기 위해 인간 세포 기반 시스템으로 전환할 때, 2D 세포 배양 시스템은 단순성 때문에 유리합니다. 그러나 제한사항이 있습니다. 이 형식은 종종 신체5,6내에서 자연적으로 발생하는 세포 세포 및 세포 외 세포 매트릭스 상호 작용을 다시 수적으로 회수하지 못합니다. 지난 몇 년 동안, 3차원(3D) 골격 근 모델은 생리학적 및 병리학적으로 관련된 과정의 모델링을 허용함으로써 전체 동물 모델 및 종래의 2D 배양 시스템에 대한 강력한 대안으로 등장하였다7,8. 실제로, 연구의 과다 바이오 인공 3D 배양 포맷1에서인간의 골격 근육을 모델링하는 전략을보고했다. 이러한 연구의 많은 한 가지 제한은 활성 힘이 배양 플랫폼에서 근육 조직을 제거하고 힘 변환기에 부착한 후 정량화되어 있으며, 이는파괴적이고 따라서 종점 분석9,10,12,13,14,15,16,17,18로 봉사하는 것으로 제한된다. ,19,20,21. 다른 사람들은 활성력을 측정하는 비침습적 방법을 허용하는 배양 시스템을 설계했지만, 모두 고함량 분자 테스트 응용 프로그램7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27, 27, 28에적합합니다. ,29.
이 프로토콜은 골격 근육 (Myo) 마이크로 조직 배열 편차 대한 조사를 위해 인간 근육 미세 조직 (hMMTs)을 제조하는 상세한 방법을 설명 (MyoTACTIC) 플랫폼; 3D 골격 근 미세조직(30)의벌크 생산을 지원하는 96개의 웰 플레이트 장치. 근로전술 플레이트 제조 방법은 96개의 잘 된 폴리디메틸실록산(PDMS) 배양판과 모든 상응하는 음피성을 단일 주조 단계에서 가능하게 하며, 이에 따라 각각의 우물은 미세 조직 형성을 위해 상대적으로 적은 수의 세포가 필요하다. 근로전술 내에서 형성된 미세조직은 장치의 우물에서 잘 에서 재현할 수 있는 정렬, striated 및 다핵근구를 포함하고, 성숙시, 시투30에서화학 및 전기 자극에 반응할 수 있다. 본 명세서에서, 폴리우레탄(PU) 복제본으로부터 PDMS 근구배양판 장치를 제조하는 기술은, hMMT를 제조하기 위해 불멸의 인간 근생 전조세포를 구현하는 최적화된 방법, 그리고 엔지니어링된 hMMT 력 생성 및 칼슘 취급 특성의 기능적 평가를 설명하고 논의한다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

골격 근의 체외 모델에서 3차원 (3D)은 골격 근육 개혁을 연구하고 실험 적 조작에 적합한 확장 가능한 형식으로 기능을 할 수있는 기회를 제공함에 따라 생체 의학 연구에서 귀중한 발전입니다. 3D 근육 배양 시스템은 과학자들이 인간 세포의 맥락에서 골격 근 ex vivo를 연구할 수 있게 해 주도록 하는 것이 바람직합니다. 체외 모델에서 3D는 성인 골격 근의 기본 조직 구조의 측면을 밀접하게 모방합니다. 그러나 보편적 인 응용 프로그램은 조작, 비용 및 사용자 친화적 인 플랫폼의 가용성에 의해 제한되며 상대적으로 많은 양의 인간 골격 근육 조직을 산출합니다. 또한, 골격 근은 많은 질병 상태에서 시간이 지남에 따라 손상되는 중요한 기능적 역할을 하기 때문에, 미세 조직 연구를 위한 실험 플랫폼은 최소침습칼슘 과도 및 수축력 측정이 플랫폼 자체 내에서 직접 수행될 수 있을 때 가장 실용적입니다. 본 프로토콜에서, 'MyoTACTIC'로 알려진 96웰 플랫폼의 제조, 3D 인간 골격 근육 미세 조직(hMMTs)의 대량 생산이 설명된다. 또한, 시간이 지남에 따라 각 미세 조직의 골격 근육력 및 칼슘 처리의 반복적인 측정을 가능하게 하는 전기 자극의 최소 침습적 적용 방법을 보고한다.

여기에 설명된 방법은 PU 금형으로부터 96웰 PDMS 기반 MyoTACTIC 배양 플랫폼을 캐스팅하고, hMMT 복제 조직의 배열을 제조하고, 배양 장치-힘 생성 및 칼슘 취급 내의 hMMT 기능의 두 가지 측면을 분석하는 방법이다. 도 1은 hMMT 시드 전에 근로식 문화 우물의 준비에 대한 회로도 개요를 제공합니다. PDMS는 널리 사용되는 실리콘 계 폴리머로, 복잡한장치(32)를생성하...

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Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

이 원고는 수축력 및 칼슘 취급 분석을 포함하여 기능분석에서 3D 인간 골격 근 미세 조직 및 최소 침습 다운스트림의 배열을 생성하는 상세한 프로토콜을 설명합니다.

인간 골격 근육 미세 조직에서 골격 근육 건강의 기능 메트릭 평가

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

우리의 프로토콜은 3D 인간 골격 근육 미세 조직 배양을 제조하고 분석하는 상세한 방법을 설명합니다. 근육 미세 조직은 기본적인 근육 생물학의 연구, 질병 모델링, 또는 후보 분자 테스트에 적용 될 수있다. 이 기술의 주요 장점은 수축력과 칼슘 과도의 시차 평가를 허용한다는 것입니다.이 때문에 근육 조직 기능에 대한 종방향 연구를 수행 할 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 브레넨 머스그레이브와 헤타 라드가 될 것입니다. 세포 파종 2~3시간 전에 6개의 잘 온화한 전술 플레이트 부분을 10센티미터 세포 배양 접시에 넣습니다.5%의 피루론 F-127 용액의 100마이크로리터를 추가하여 각 개별 근문 문화를 잘 준비한다. 뚜껑을 사용하여 우물을 덮고 파라핀 필름을 바르면 접시를 밀봉합니다. 접시 스피너 어댑터가 장착된 원심분리기에서 1, 550회 G로 접시를 원심분리합니다.세포가 파종 할 준비가 될 때까지 배양 접시를 섭씨 4도에 보관하십시오. 그런 다음 지하 멤브레인 추출물의 150 마이크로리터 알리쿼트와 문화 후드의 얼음에 혈소판 알리쿼트 110을 천천히 해동합니다. 세포 배양 후드에서 작업, 추가 700 0.9% 식염수 용액의 마이크로 리터 1.5 분말 피브리노겐의 7 밀리 그램을 포함 하는 1.5 밀리 리터 마이크로 원심 분리 기 튜브.튜브를 섭씨 37도 세포 배양 인큐베이터에 3~5분간 영양없이 놓습니다. 튜브를 부드럽게 제거하고 플릭한 다음 펄스는 용존 솔루션을 마이크로 원심분리기로 스핀한 다음 배양 후드로 되돌게 됩니다. 0.22 마이크로미터 주사기 필터가 장착된 1밀리리터 주사기를 사용하여 피브리노젠 용액을 필터링합니다.그런 다음 용존 피브리노겐 용액을 지하 막 추출물 및 트롬빈 알리쿼트와 함께 얼음으로 옮기습니다. 조직 을 시드 한 후 문화 우물에 소개 될 37 섭씨에서 조직 성장 미디어를 준비하고 미리 따뜻하게하십시오. 인큐베이터에서 세포 배양 판을 제거하고 배양 매체를 흡인한다.그런 다음 각 배양 판에 DPBS의 5 밀리리터를 추가하여 세포를 한 번 씻으시다. DPBS를 흡인하고 각 배양 접시에 0.25%의 트립신 EDTA1밀리리터를 추가하여 세포를 분리합니다. 3 분 동안 세포 배양 인큐베이터에 접시를 놓고 배양 접시에 세척 매체의 3 밀리리터를 추가하여 트립신을 잡고 적절한 크기의 원추형 튜브로 세포를 옮김시합니다.10 분 동안 400 회 G에서 원심 분리하여 세포를 펠렛. 세포 펠릿을 손상시키지 않고 조심스럽게 미디어를 흡인한 다음 세척 매체의 1 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다. 밝은 필드 현미경 검사의 밑에 혈우세포계 및 trypan 파란 염료를 사용하여 세포를 계산합니다.6개의 조직을 종자하기 위하여는, 8개의 조직을 위한 충분한 세포 및 세포외 매트릭스를 준비하여, 따라서 손실 및 거품 형성을 고려합니다. 120만 개의 세포를 새로운 원물 튜브로 옮은 다음 세척 매체로 부피를 10mm로 늘립니다. 10 분 동안 400 회 G에서 원심 분리하여 세포를 펠렛.1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 150 마이크로리터의 ECM 혼합물을 준비하고, 사용전까지 혼합물을 얼음에 보관합니다. 세포를 포함하는 원적 관에서 미디어를 흡인하고, 세포 펠릿을 피하기 위해 주의를 기울입니다. 펠릿이 세포 슬러리로 나타날 때까지 장갑을 낀 손가락으로 튜브 끝을 힘차게 쓸어 넘깁니다.ECM 용액120마이크로리터를 세포 슬러리를 함유하는 튜브로 옮기고, ECM 내의 세포를 완전히 다시 일시 중단하여 단일 세포 현탁액을 생성한다. 거품을 만들지 말고 셀 ECM 서스펜션을 사용할 때까지 얼음위에 놓습니다. 세포 배양 후드 내부에 얼음 팩 위에 근사 우물이 들어 있는 냉장 10센티미터 접시를 놓고 각 우물에서 플라우론 F-127 용액을 흡인시합니다.잔류 물루F-127 용액이 다공성 PDMS에서 방출하고 우물이 얼음위에 5분 동안 앉게 한 다음 다시 흡입하여 우물 바닥에 정착할 수 있습니다. 세포 ECM 현탁액을 조심스럽게 피펫하여 세포를 다시 중단한 다음, 서스펜션의 105 마이크로리터를 상한 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 상단에 가깝게 잡습니다. 셀 ECM 서스펜션의 105 마이크로리터에 밀리리터 트롬빈 스톡 솔루션당 100단위의 0.84 마이크로리터를 추가합니다.피펫은 거품의 도입을 피하고, 혼합하기 위해 신속하고 철저하게 혼합합니다. 파이펫을 우물 바닥에 누르지 않고 각 웰에 셀 ECM 혼합물의 15 마이크로리터를 추가합니다. 두 개의 가벼운 움직임으로, 우물의 각 포스트 뒤에 셀 서스펜션을 확산.뚜껑을 10센티미터 배양판에 놓고 섭씨 37도 조직 배양 배양인으로 약 5분간 옮김합니다. 전세포 ECM 혼합물이 중합된 후 각 근사에 미리 따뜻해지는 조직 성장 매체200 마이크로리터를 첨가한다. 10센티미터 접시의 뚜껑을 교체하고 분화될 때까지 인큐베이터에 보관하십시오.14일 배양 기간 동안, myoblasts는 다중 핵염기 심포투를 가진 3D 마이크로 조직을 형성하기 위하여 온화한 전술에서 잘 조직함으로써 토착 조직의 양상을 표시했습니다. Myotubes는 육종 알파 액틴에 대한 면역 스테인링에 의해 시각화 된 사코메르 규형이 있습니다. 잘 정렬된 근관을 달성하기 위해, 피펫팅 하는 동안 거품 형성, 또는 포부 동안 손상 pluronic 코팅 과 같은 기술적 인 오류를 피해야한다.저파 및 고주파 전기 자극에 대응하여 근기성 음판소의 대표적인 변위가 여기에 표시되어, 심투우가 다양한 전기 자극에 반응하고 그에 따라 수축된다는 것을 나타낸다. 포스트 변위의 정량화는 HMMT의 절대 수축력으로 변환할 수 있게 합니다. GCaMP6-트랜스포제드 근막세포로 만든 HMMT에 대한 칼슘 트랜지션도 저주파 자극에 대한 응답으로 분석되었다.형광 강도의 정량화는 HMMT의 칼슘 취급 특성에 대한 측정으로 사용될 수 있다. 처음으로이 조직 시드를 수행하는 대부분의 사람들은 우물에 세포 외 세포 매트릭스를 추가하고 거품 형성으로 어려움을 겪습니다. 우리는 세포와 첫 번째 시도 하기 전에 매우 간단한 점성 솔루션일부 예비 미세 조직 배양 우물에 기술을 연습 하는 것이 좋습니다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

연구

생체공학

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

투과성이 골격 근육 섬유에 의해 생성 된 최대 아이소 포스의 측정

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

엔지니어링 혈관을 근육 플랩

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

의 응용 프로그램<em&gt; 생체</em&gt; 조직 평가를위한 쥐 앞정 전방의 기능 테스트는 골격근 수리 엔지니어링

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

심장 근육 세포 기반 액츄에이터 및 자체 안정화 비 오로봇 - 1 부

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

심장 근육 세포 기반 액츄에이터 및 자체 안정화 바이오 오봇 - 제 2 부

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

반자동 경도 Microcomputed Tomography 기반 정량적 구조 분석 누드 쥐 척추 골절 골다공증 관련 모델의

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...