Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Vi vil takke Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli og Sadegh Davoudi for å ha bidratt til oppfinnelsen av kulturplattformen MyoTACTIC og etablering av fabrikasjons- og analysemetodene som er beskrevet her. HL mottok støtte fra et NSERC-opplæringsprogram (Natural Sciences and Engineering Research Council) i Organ-on-a-Chip Engineering and Entrepreneurship Scholarship og et stipend fra University of Toronto Wildcat. PMG er Canada Research Chair i EndogenOus Repair og fikk støtte for denne studien fra Ontario Institute for Regenerative Medicine, Stem Cell Network, og fra Medicine by Design, et Canada First Research Excellence Program. Skjematiske diagrammer ble opprettet med BioRender.com.

1. PDMS MyoTACTIC plate fabrikasjon
MERK: PDMS MyoTACTIC plate fabrikasjon krever en PU negativ mugg, som kan produseres som tidligere beskrevet30. Den dataassisterte designen (CAD) SolidWorks-filen for MyoTACTIC-platedesignet er gjort tilgjengelig på GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
<ol><li>Forbered ~ 110 g PDMS polymeroppløsning i en engangs plastkopp med et 1:15-forhold mellom monomer og herdemiddel ved hjelp av komponenten...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+price+of+innovation:+New+estimates+of+drug+development+costs.">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts.">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

Dette manuskriptet beskriver metoder for å fremstille og analysere en 3D hMMT kulturmodell som kan brukes på studier av grunnleggende muskelbiologi, sykdomsmodellering eller for kandidatmolekyltesting. MyoTACTIC-plattformen er kostnadsvennlig, enkel å produsere og krever et relativt lite antall celler for å produsere skjelettmuskulaturmikrofunksjoner. hMMTer dannet i MyoTACTIC kulturplattform består av justerte, multinukleerte og strikkede myotuber, og reagerer på elektriske stimuli ved å initiere kalsiumtransient...

Skjelettmuskulatur er et av de mest tallrike vevene i menneskekroppen og støtter viktige kroppsfunksjoner som bevegelse, varme homeostase og metabolisme1. Historisk har dyremodeller og todimensjonale (2D) cellekultursystemer blitt brukt til å studere biologiske prosesser og sykdomspatogenese, samt for å teste farmakologiske forbindelser i behandlingen av skjelettmuskulatursykdommer2,3. Mens dyremodeller har forbedret vår kunnskap om skjelettmuskulatur i helse og sykdom, har deres translasjonspåvirkning blitt hemmet av høye kostnader, etiske hensyn og interspecies forskjeller2,4. Ved å vende seg til menneskelige cellebaserte systemer for å studere skjelettmuskulatur, er 2D-cellekultursystemer gunstige på grunn av deres enkelhet. Det er imidlertid en begrensning. Dette formatet klarer ofte ikke å rekapitulere celle- og celle-ekstracellulære matriseinteraksjoner som forekommer naturlig i kroppen5,6. I løpet av de siste årene har tredimensjonale (3D) skjelettmuskulaturmodeller dukket opp som et kraftig alternativ til hele dyremodeller og konvensjonelle 2D-kultursystemer ved å tillate modellering av fysiologisk og patologisk relevante prosesser ex vivo7,8. Faktisk har en mengde studier rapportert strategier for å modellere menneskelig skjelettmuskulatur i et bioartificial 3D-kulturformat1. En begrensning for mange av disse studiene er at aktiv kraft kvantifiseres etter fjerning av muskelvev fra kulturplattformene og vedlegg til en krafttransduser, som er destruktiv og dermed begrenset til å tjene som endepunktanalyse9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Andre har designet kultursystemer som tillater ikke-invasive metoder for måling av aktiv kraft, men ikke alle er mottagelige for høykvalitets molekyltestingsapplikasjoner7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Denne protokollen beskriver en detaljert metode for å fremstille humane muskel mikrotissues (hMMTs) i skjelettmuskelen (Myo) microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) plattform; en 96 brønnplateenhet som støtter bulkproduksjonen av 3D skjelettmuskulaturmikrotissuer30. MyoTACTIC plate fabrikasjonsmetoden muliggjør generering av en 96 brønn polydimetylsiloksan (PDMS) kulturplate og alle tilsvarende brønnfunksjoner i et enkelt støpetrinn, hvorved hver brønn krever et relativt lite antall celler for mikrotissuedannelse. Mikrotissues dannet i MyoTACTIC inneholder justerte, strikkede og multinukleerte myotuber som er reproduserbare fra brønn til brønn på enheten, og ved modning kan reagere på kjemiske og elektriske stimuli in situ30. Heri, teknikken for å produsere en PDMS MyoTACTIC kultur plate enhet fra en polyuretan (PU) kopi, en optimalisert metode for å implementere udødelige menneskelige myogene stamceller for å fremstille hMMTs, og den funksjonelle vurderingen av konstruert hMMT kraft generasjon og kalsium håndtering egenskaper er skissert og diskutert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

Tredimensjonale (3D) in vitro modeller av skjelettmuskulatur er et verdifullt fremskritt i biomedisinsk forskning, da de gir muligheten til å studere skjelettmuskulaturreformering og fungere i et skalerbart format som er mottagelig for eksperimentelle manipulasjoner. 3D muskelkultursystemer er ønskelige da de gjør det mulig for forskere å studere skjelettmuskulatur ex vivo i sammenheng med menneskelige celler. 3D in vitro modeller etterligner nøye aspekter av den innfødte vevsstrukturen til voksen skjelettmuskulatur. Imidlertid er deres universelle anvendelse begrenset av tilgjengeligheten av plattformer som er enkle å fremstille, koste og brukervennlige, og gir relativt høye mengder menneskelig skjelettmuskulaturvev. I tillegg, siden skjelettmuskulatur spiller en viktig funksjonell rolle som er svekket over tid i mange sykdomstilstander, er en eksperimentell plattform for mikrotissuestudier mest praktisk når minimalt invasive kalsium forbigående og kontraktile kraftmålinger kan utføres direkte i selve plattformen. I denne protokollen beskrives fabrikasjonen av en 96-brønns plattform kjent som 'MyoTACTIC', og masseproduksjon av 3D humane skjelettmuskulaturmikrotissuer (hMMTs). I tillegg rapporteres metodene for en minimal invasiv anvendelse av elektrisk stimulering som muliggjør gjentatte målinger av skjelettmuskulaturkraft og kalsiumhåndtering av hver mikrotissue over tid.

Beskrevet heri er metoder for å kaste en 96-brønns PDMS-basert MyoTACTIC kulturplattform fra en PU-form, for å fremstille matriser av hMMT-kopivev, og for å analysere to aspekter av hMMT-funksjon innen kulturen enhetskraftgenerering og kalsiumhåndtering. Figur 1 gir en skjematisk oversikt over utarbeidelsen av MyoTACTIC kulturbrønner før hMMT-sådd. PDMS er en mye brukt silikonbasert polymer, som lett kan formes for å skape komplekse enheter32. En PDMS-basert ...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Dette manuskriptet beskriver en detaljert protokoll for å produsere matriser av 3D humane skjelettmuskulaturmikrofunksjoner og minimalt invasive nedstrøms in situ-analyser av funksjon, inkludert kontraktil kraft og kalsiumhåndteringsanalyser.

Vurdering av funksjonelle beregninger av skjelettmuskulaturhelse i humane skjelettmuskulaturmikrofunksjoner

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Vår protokoll beskriver detaljerte metoder for å fremstille og analysere en 3D human skjelettmuskelmikrotissykultur. Muskelmikrotissues kan brukes på studier av grunnleggende muskelbiologi, sykdomsmodellering eller for kandidatmolekyltesting. Den største fordelen med denne teknikken er at den tillater in-situ vurdering av kontraktil kraft og kalsium forbigående.På grunn av dette kan du gjennomføre langsgående studier av muskelvevsfunksjon. Å demonstrere prosedyren vil være Brennen Musgrave og Heta Lad, avgangsstudenter fra laboratoriet mitt. To til tre timer før cellesåing, plasser en seks godt mild taktplatedel i en 10 centimeter cellekulturrett.Forbered hver enkelt myotactisk kultur godt ved å legge til 100 mikroliter av en 5% pluronic F-127-løsning. Bruk lokket til å dekke brønnene, og påfør en parafinfilm for å forsegle parabolen. Sentrifuger retten ved 1550 ganger G i ett minutt i en sentrifuge utstyrt med en plate spinner adapter.Oppbevar kulturretten på fire grader Celsius til cellene er klare for såing. Deretter tiner du sakte 150 mikroliter aliquot av kjellermembranekstrakt, og 110 mikroliter aliquot trombin på is i kulturhetten. Arbeid i cellekulturhetten, tilsett 700 mikroliter 0,9% saltløsning til et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør som inneholder syv milligram pulverisert fibrinogen.Plasser røret i en 37 grader Celsius cellekulturinkubator i tre til fem minutter uten vortexing. Fjern og flikk røret forsiktig, og pulser deretter den oppløste løsningen i en mikrosentrifuge før du returnerer den til kulturhetten. Filtrer fibrinogenoppløsningen ved hjelp av en en milliliter sprøyte utstyrt med et 0,22 mikrometer sprøytefilter.Overfør deretter den oppløste fibrinogenløsningen til is sammen med kjellermembranekstraktet og trombin aliquots. Forbered og forvarm vevsvekstmediene ved 37 grader Celsius, som vil bli introdusert til kulturbrønnene etter sådd vevet. Fjern cellekulturplatene fra inkubatoren og aspirer kulturmediene.Vask deretter cellene en gang ved å legge til fem milliliter DPBS i hver kulturplate. Aspirer DPBS og løsne cellene ved å legge til en milliliter 0,25% trypsin EDTA i hver kulturrett. Plasser platen i cellekulturinkubatoren i tre minutter, hold trypsin ved å legge til tre milliliter vaskemedium til kulturretten, og overfør deretter cellene til et passende størrelse konisk rør.Pellet cellene ved sentrifugering ved 400 ganger G i 10 minutter. Aspirer mediet forsiktig uten å skade cellepelleten, og re-suspendere cellene i en milliliter av vaskemediet. Tell cellene ved hjelp av et hemocytometer og trypan blå fargestoff under lysfeltmikroskopi.Å frø seks vev, forberede nok celler og ekstracellulær matrise for åtte vev, og dermed ta hensyn til tap og bobledannelse. Overfør 1,2 millioner celler til et nytt konisk rør, og øk deretter volumet til 10 millimeter med vaskemedium. Pellet cellene ved sentrifugering ved 400 ganger G i 10 minutter.Forbered 150 mikroliter ECM-blanding i et 1,5 milliliter mikrosentrifugerør, og oppbevar blandingen på is til bruk. Aspirer mediet fra det koniske røret som inneholder cellene, og pass på å unngå cellepellet. Sveip enden av røret kraftig med en hanskefinger til pelletsen vises som en celleslam.Overfør 120 mikroliter av ECM-løsningen til røret som inneholder celleslammet, og rør forsiktig opp og ned for å fullstendig suspendere cellene i ECM for å generere en enkelt cellefjæring. Unngå å lage bobler, og plasser deretter celle ECM-fjæringen på is til bruk. Plasser den nedkjølte 10 centimeter store retten som inneholder de myotactiske brønnene på toppen av en ispakke inne i cellekulturhetten, og aspirer pluronic F-127-løsningen fra hver brønn.La gjenværende pluronic F-127-løsning slippe ut fra den porøse PDMS, og sett seg til bunnen av brønnen ved å la brønnene sitte i fem minutter på is, og aspirer deretter igjen. Pipette celle ECM-suspensjonen forsiktig for å suspendere cellene på nytt, og overfør deretter 105 mikroliter av suspensjonen til et friskt, forhåndskjølt 1,5 milliliterrør ved å gripe det nær toppen. Tilsett 0,84 mikroliter 100 enheter per milliliter trombin lagerløsning til 105 mikroliter celle ECM suspensjon.Pipette raskt og grundig for å blande, unngå innføring av bobler. Tilsett 15 mikroliter av celle ECM-blandingen til hver brønn uten å trykke pipetten inn i bunnen av brønnen. Med to lysbevegelser sprer du cellefjæringen bak hvert innlegg i brønnen.Plasser lokket på 10 centimeter kulturplate og overfør det til en 37 grader Celsius vevskulturinkubator i omtrent fem minutter. Tilsett 200 mikroliter av forvarmede vevsvekstmedier til hver myotactic brønn etter at celle ECM-blandingen har polymerisert. Sett lokket på 10 centimeter parabolen tilbake og oppbevar det i inkubatoren til differensieringen.I løpet av en 14 dagers kulturperiode viste myoblastene aspektene ved innfødt vev ved selvorganisering i den milde taktikken godt for å danne en 3D-mikrotissy med flerkjernede strikkede myotuber. Myotubes har sarcomere striations, som ble visualisert ved immunstaining for sarkomerisk alfa actinin. For å oppnå godt justerte myotuber, bør tekniske feil som bobledannelse under pipettering, eller skadelig pluronbelegg under aspirasjon, unngås.En representativ forskyvning av den myotactiske brønnplatestolpen som svar på lav og høyfrekvent elektrisk stimulering, vises her, noe som indikerer at myotubes reagerer på varierende elektriske stimuli og kontrakt tilsvarende. Kvantifisering av postforskyvningen muliggjør konvertering til absolutt kontraktil kraft av HMMTs. Kalsiumtransience på HMMTs laget av GCaMP6-transduced myoblaster ble også analysert som svar på lav og høyfrekvent stimulering.Kvantifisering av fluorescerende intensitet kan brukes som måling for kalsiumhåndteringsegenskapene til HMMTs. De fleste som utfører denne vevssåingen for første gang, sliter med å legge cellen ekstracellulær matrise til brønnene, og med bobledannelse. Vi anbefaler å praktisere teknikken på noen ekstra mikrotissuekulturbrønner med en veldig enkel viskøs løsning før første forsøk med celler.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering skjelettmuskulatur vev fra Murine Myoblast stamceller og anvendelse av elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Måling av maksimal isometrisk Force generert av permeabilized skjelettmuskulatur Fibers

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Konstruert vaskulariserte Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Computertomografi og optisk avbildning av Osteogenesis-angiogenese Kobling til Vurdere Integrering av kraniet autografts og allografter

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

anvendelser av<em&gt; I Vivo</em&gt; Functional Testing av Rat tibialis anterior for Vurderer Tissue Konstruert Skeletal Muscle Reparasjon

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Kardial muskelcellebasert aktuator og selvstabiliserende biorobot - DEL 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Kardial muskelcellebasert aktuator og selvstabiliserende biorobot - del 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Semiautomated langsgående Microcomputed tomografi-baserte kvantitative strukturelle analyser av en naken rotte osteoporose-relaterte vertebrale frakturer modell

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Smelt Electrospinning skriving av tredimensjonale Poly(ε-caprolactone) stillaser med kontrollerbar Morphologies for Tissue Engineering programmer

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...