Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Мы хотели бы поблагодарить Мохаммада Афшара, Хабена Абраху, Мохсена Афшар-Бакушли и Садега Давуди за вклад в изобретение платформы культуры MyoTACTIC и создание методов изготовления и анализа, описанных в настоящем документе. HL получила финансирование от Учебной программы Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям (NSERC) в области инженерии и предпринимательства Organ-on-a-Chip и стипендий для выпускников Университета Торонто Wildcat. PMG является Канадской исследовательской кафедрой эндогенного восстановления и получила поддержку для этого исследования от Института регенеративной медицины Онтарио, Сети стволовых клеток и от Medicine by Design, Канадской программы первого научного совершенства. Принципиальные схемы создавались с помощью BioRender.com.

1. Изготовление плит PDMS MyoTACTIC
ПРИМЕЧАНИЕ: Для изготовления пластин PDMS MyoTACTIC требуется pu отрицательная форма, которая может быть изготовлена, какописано ранее 30. Файл SolidWorks автоматизированного проектирования (CAD) для проектирования пластин MyoTACTIC доступен на GitHub ...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+price+of+innovation:+New+estimates+of+drug+development+costs.">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts.">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

В этой рукописи описываются методы изготовления и анализа модели культуры 3D hMMT, которая может быть применена к исследованиям базовой мышечной биологии, моделированию заболеваний или для тестирования молекул-кандидатов. Платформа MyoTACTIC является экономичной, простой в изготовлении и т?...

Скелетные мышцы являются одной из самых распространенных тканей в организме человека и поддерживают ключевые функции организма, такие как передвижение, тепловой гомеостаз и метаболизм1. Исторически сложилось так, что животные модели и двумерные (2D) системы клеточных культур использовались для изучения биологических процессов и патогенеза заболеваний, а также для тестирования фармакологических соединений при лечении заболеваний скелетных мышц2,3. В то время как животные модели значительно улучшили наши знания о скелетных мышцах в области здоровья и болезней, их трансляционное воздействие было затруднено высокими затратами, этическими соображениями и межвидовыми различиями2,4. Обращаясь к клеточным системам человека для изучения скелетных мышц, 2D-системы клеточных культур благоприятны из-за их простоты. Однако есть ограничение. Этот формат часто не может повторить взаимодействия клетка-клетка и клетка-внеклеточный матрикс, которые происходят естественным образом в организме5,6. За последние несколько лет трехмерные (3D) модели скелетных мышц стали мощной альтернативой целым животным моделям и обычным системам 2D-культур, позволяя моделировать физиологически и патологически значимые процессы ex vivo7,8. Действительно, множество исследований сообщили о стратегиях моделирования скелетных мышц человека в биоискусственном формате 3D-культуры1. Одним из ограничений для многих из этих исследований является то, что активная сила количественно определяется после удаления мышечных тканей из платформ культуры и прикрепления к преобразователю силы, который является разрушительным и, следовательно, ограничен в качестве анализа конечнойточки 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18. ,19,20,21. Другие разработали системы культивирования, которые позволяют использовать неинвазивные методы измерения активной силы, но не все поддаются тестированию молекул с высоким содержанием приложений7,8,9,10, 14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Этот протокол описывает подробный метод изготовления микротюсов мышц человека (hMMT) в платформе скелетных мышц (Myo) microTissue Array deviCe To Explore forCe (MyoTACTIC); пластинчатое устройство на 96 скважин, которое поддерживает массовое производство 3D микротиз30скелетных мышц. Метод изготовления пластин MyoTACTIC позволяет генерировать 96-луночную полидиметилсилоксановую (PDMS) культуральную пластину и все соответствующие характеристики скважины на одной стадии литья, в соответствии с которой для каждой скважины требуется относительно небольшое количество клеток для формирования микротизвестков. Микроткани, образующиеся в пределах MyoTACTIC, содержат выровненные, поперечно-полосатые и многоядерные миотрубки, которые воспроизводятся от колодца к колодцу устройства и при созревании могут реагировать на химические и электрические раздражители in situ30. В настоящем описаны и обсуждены методика изготовления пластинчатого устройства PDMS MyoTACTIC из полиуретановой (PU) реплики, оптимизированный метод реализации увековеченных миогенных клеток-предшественников человека для изготовления hMMT, а также функциональная оценка инженерной генерации силы hMMT и свойств обработки кальция.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

Трехмерные (3D) in vitro модели скелетных мышц являются ценным прогрессом в биомедицинских исследованиях, поскольку они дают возможность изучать реформацию и функционирование скелетных мышц в масштабируемом формате, который поддается экспериментальным манипуляциям. 3D-системы мышечных культур желательны, поскольку они позволяют ученым изучать скелетные мышцы ex vivo в контексте клеток человека. 3D-модели in vitro близко имитируют аспекты структуры нативной ткани скелетных мышц взрослого человека. Однако их универсальное применение ограничено наличием платформ, которые просты в изготовлении, дороги и удобны для пользователя, а также дают относительно большое количество скелетных мышечных тканей человека. Кроме того, поскольку скелетные мышцы играют важную функциональную роль, которая нарушается с течением времени во многих болезненных состояниях, экспериментальная платформа для исследований микротизвестности наиболее практична, когда минимально инвазивные измерения преходящих и сократительных сил кальция могут проводиться непосредственно внутри самой платформы. В этом протоколе описывается изготовление 96-хорошей платформы, известной как «MyoTACTIC», и массовое производство 3D-микротизов скелетных мышц человека (hMMT). Кроме того, представлены методы минимально инвазивного применения электрической стимуляции, которая позволяет повторно измерять силу скелетных мышц и обработку кальция каждого микротизнеса с течением времени.

В настоящем описаны способы отливки 96-луночной платформы культуры MyoTACTIC на основе PDMS из полиуретановой формы, изготовления массивов тканей-реплик hMMT и анализа двух аспектов функции hMMT в рамках генерации силы устройства культивирования и обработки кальция. На рисунке 1 ?...

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

В этой рукописи описывается подробный протокол для получения массивов 3D-микротизов скелетных мышц человека и минимально инвазивных анализов функции in situ, включая анализы сократительной силы и обработки кальция.

Оценка функциональных показателей здоровья скелетных мышц в микротизносах скелетных мышц человека

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Наш протокол описывает подробные методы изготовления и анализа 3D-культуры микроткани скелетных мышц человека. Мышечные микроткани могут быть применены для исследований базовой мышечной биологии, моделирования заболеваний или для тестирования молекул-кандидатов. Основным преимуществом этого метода является то, что он позволяет на месте оценивать сократительную силу и переходные процессы кальция.Из-за этого можно проводить продольные исследования функции мышечной ткани. Демонстрировать процедуру будут Бреннен Масгрейв и Хета Лад, аспиранты моей лаборатории. За два-три часа до посева клеток поместите шесть хорошо мягких тактических пластинок в 10-сантиметровую чашку для культивирования клеток.Хорошо подготовьте каждую отдельную миотактическую культуру, добавив 100 микролитров 5%-ного плуронического раствора F-127. Используйте крышку, чтобы покрыть колодцы, и нанесите парафиновую пленку, чтобы запечатать блюдо. Центрифугируйте блюдо при 1 550 G в течение одной минуты в центрифуге, оснащенной адаптером пластинчатого спиннера.Храните культуральную посуду при четырех градусах Цельсия до тех пор, пока клетки не будут готовы к посеву. Затем медленно оттаивают 150 микролитров аликвоты экстракта базальной мембраны и 110 микролитровых аликвот тромбина на льду в культуральной вытяжке. Работая в вытяжке клеточной культуры, добавьте 700 микролитров 0,9% физиологического раствора в 1,5-миллилитровую микроцентрифужную трубку, содержащую семь миллиграммов порошкообразного фибриногена.Поместите трубку в инкубатор клеточной культуры при температуре 37 градусов Цельсия на три-пять минут без вихрей. Аккуратно извлеките и проведите трубкой, затем импульсно раскрутите растворенный раствор в микроцентрифуге, прежде чем вернуть его в культуральную вытяжку. Фильтруйте раствор фибриногена с помощью одного миллилитра шприца, оснащенного шприцевым фильтром 0,22 микрометра.Затем перенесите растворенный раствор фибриногена на лед вместе с экстрактом базальной мембраны и аликвотами тромбина. Подготовьте и предварительно нагрейте тканевую питательную среду при 37 градусах Цельсия, которая будет введена в культуральные лунки после посева тканей. Извлеките пластины для культивирования клеток из инкубатора и аспирируйте культуральную среду.Затем промыть клетки один раз, добавив пять миллилитров DPBS в каждую культуральную пластину. Аспирируйте DPBS и отделяйте клетки, добавляя один миллилитр 0,25% трипсина ЭДТА в каждую культуральную чашку. Поместите тарелку в инкубатор клеточных культур в течение трех минут, удерживайте трипсин, добавив три миллилитра моющего средства в чашку для культивирования, затем перенесите клетки в коническую трубку соответствующего размера.Гранулируют клетки центрифугированием в 400 раз G в течение 10 минут. Тщательно аспирируйте среду, не повреждая клеточную гранулу, затем повторно подвешивайте клетки в одном миллилитре промывной среды. Подсчитывайте клетки с помощью гемоцитометра и трипанового синего красителя под яркой полевой микроскопией.Чтобы засеять шесть тканей, подготовьте достаточное количество клеток и внеклеточного матрикса для восьми тканей, таким образом, учитывая потери и образование пузырьков. Переложите 1,2 миллиона клеток в новую коническую трубку, затем увеличьте объем до 10 миллиметров с помощью промывочной среды. Гранулируют клетки центрифугированием в 400 раз G в течение 10 минут.Приготовьте 150 микролитров смеси ECM в 1,5-миллилитровой микроцентрифужной трубке и храните смесь на льду до использования. Аспирируйте среду из конической трубки, содержащей клетки, заботясь о том, чтобы избежать клеточной гранулы. Энергично проведите пальцем в перчатке концом трубки, пока гранула не появится в виде клеточной суспензии.Перенесите 120 микролитров раствора ECM в трубку, содержащую клеточную суспензию, и осторожно пипетку вверх и вниз, чтобы полностью повторно приостановить ячейки внутри ECM для получения одноклеточной суспензии. Избегайте образования пузырьков, затем поместите клеточную суспензию ECM на лед до использования. Поместите охлажденную 10-сантиметровую чашку, содержащую миотактические колодцы, поверх пакета со льдом внутри вытяжки для культивирования клеток и аспирируйте плуронический раствор F-127 из каждой лунки.Дайте остаточному плуроническому раствору F-127 освободиться из пористой PDMS и осесть на дно скважины, дав скважинам посидеть в течение пяти минут на льду, а затем снова аспирировать. Аккуратно прикрепите ячейку ECM-суспензией, чтобы повторно приостановить ячейки, затем перенесите 105 микролитров суспензии в свежую, предварительно охлажденную 1,5-миллилитровую трубку, захватив ее близко к верху. Добавьте 0,84 микролитра по 100 единиц на миллилитр раствора тромбина к 105 микролитрам клеточной суспензии ECM.Пипетку быстро и тщательно перемешать, избегая введения пузырьков. Добавьте 15 микролитров клеточной ECM-смеси в каждую лунку, не вдавливая пипетку в дно скважины. Двумя легкими движениями распределите клеточную суспензию за каждым столбом в колодце.Поместите крышку на 10-сантиметровую культуральную пластину и перенесите ее в инкубатор для культивирования тканей при температуре 37 градусов Цельсия примерно на пять минут. Добавьте 200 микролитров предварительно нагретой тканевой питательной среды в каждый миотаксический колодец после полимеризации клеточной ECM-смеси. Замените крышку на 10-сантиметровую посуду и держите ее в инкубаторе до дифференциации.В течение 14-дневного периода культивирования миобласты демонстрировали аспекты нативной ткани, самоорганизуясь в мягкой тактике, чтобы сформировать 3D-микротизлю с многоядерными полосатыми миотрубами. Миотубы имеют саркомерные полосы, которые были визуализированы путем иммуноокрашивания саркомерного альфа-актинина. Для достижения хорошо выровненных миотубов следует избегать технических ошибок, таких как образование пузырьков при пипетке или повреждение плуронового покрытия во время аспирации.Здесь показано репрезентативное смещение пластинки миотаксического колодца в ответ на низкочастотную и высокочастотную электрическую стимуляцию, что указывает на то, что миотрубы реагируют на изменяющиеся электрические раздражители и соответственно сокращаются. Количественная оценка пост-смещения позволяет преобразовать в абсолютную сократительную силу ГММТ. В ответ на низко- и высокочастотную стимуляцию также анализировали переходную способность кальция на ГММТ, изготовленные из GCaMP6-трансдуцированных миобластов.Количественная оценка интенсивности флуоресцентной жидкости может быть использована в качестве измерения свойств обработки кальция ГММТ. Большинство людей, которые выполняют этот посев тканей впервые, борются с добавлением клеточного внеклеточного матрикса в лунки и с образованием пузырьков. Мы рекомендуем практиковать методику на некоторых запасных колодцах для культивирования микротюса с очень простым вязким раствором перед первой попыткой с клетками.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Инженерные скелетных мышечных тканей из мышиных миобластов клеток-предшественников и применения электрической стимуляции

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Измерение максимальной Изометрические усилие, создаваемое проницаемыми скелетных мышечных волокон

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Спроектированный васкуляризированных лоскута

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Компьютерная томография и оптическая томография остеогенеза ангиогенеза муфта для оценки интеграция кости черепа аутотрансплантатов и аллотрансплантатов

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Применения<em&gt; В Vivo</em&gt; Функциональное тестирование Крысы передней большеберцовой для оценки Tissue Engineered скелетной мускулатуре Ремонт

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Прибор на основе карциномы на мышечной клетке и самостабилизационный биоробот - ЧАСТЬ 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Мышцы на основе сердечной мышцы и самостабилизирующий биоробот - часть 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Полу автоматизированное продольной Microcomputed томография-основе количественных структурный анализ связанных остеопороза позвоночника переломов модель Обнаженная крыса

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Расплава Electrospinning написания трехмерных Poly(ε-caprolactone) леса с контролируемым морфологии тканей инженерных приложений

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...