Name: assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues
Uploaded: 2021-02-18T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues at JoVE.com

Nos gustaría agradecer a Mohammad Afshar, Haben Abraha, Mohsen Afshar-Bakooshli y Sadegh Davoudi por contribuir a la invención de la plataforma de cultivo MyoTACTIC y establecer los métodos de fabricación y análisis descritos en este documento. HL recibió fondos de un Programa de Capacitación del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería (NSERC) en Una Beca de Ingeniería y Emprendimiento Organ-on-a-Chip y una beca de posgrado Wildcat de la Universidad de Toronto. PMG es la Cátedra de Investigación de Canadá en Reparación Endógena y recibió apoyo para este estudio del Instituto de Medicina Regenerativa de Ontario, la Red de Células Madre y de Medicine by Design, un Programa de Excelencia en Investigación de Canadá First. Los diagramas esquemáticos se crearon con BioRender.com.

1. Fabricación de placas MIOTÁCTICAS PDMS
NOTA: La fabricación de placas MIOTÁCTICAS PDMS requiere un molde negativo de PU, que se puede fabricar como se describió anteriormente30. El archivo solidWorks de diseño asistido por ordenador (CAD) para el diseño de placas MyoTACTIC se ha puesto a disposición en GitHub (https://github.com/gilbertlabcode/MyoTACTIC-SolidWork-CAD-file).
<ol><li>Prepare ~ 110 g de solución de polímero PDMS en un vaso de plástico desec...

<ol>
	<li>Frontera, W. R., Ochala, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skeletal+Muscle:+A+brief+review+of+structure+and+function.">Skeletal Muscle: A brief review of structure and function.</a> Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).</li><li>McGreevy, J. W., Hakim, C. H., McIntosh, M. A., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+Duchenne+muscular+dystrophy:+From+basic+mechanisms+to+gene+therapy.">Animal models of Duchenne muscular dystrophy: From basic mechanisms to gene therapy.</a> DMM Disease Models and Mechanisms. 8 (3), 195-213 (2015).</li><li>Young, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoScreen,+a+high-throughput+phenotypic+screening+platform+enabling+muscle+drug+discovery.">MyoScreen, a high-throughput phenotypic screening platform enabling muscle drug discovery.</a> SLAS Discovery. 23 (8), 790-806 (2018).</li><li>DiMasi, J. A., Hansen, R. W., Grabowski, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+price+of+innovation:+New+estimates+of+drug+development+costs.">The price of innovation: New estimates of drug development costs.</a> Journal of Health Economics. 22 (2), 151-185 (2003).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Duval, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+physiological+events+in+2D+vs.+3D+cell+culture.">Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture.</a> Physiology. 32 (4), 266-277 (2017).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug-screening+platform+based+on+the+contractility+of+tissue-engineered+muscle.">Drug-screening platform based on the contractility of tissue-engineered muscle.</a> Muscle and Nerve. 37 (4), 438-447 (2008).</li><li>Vandenburgh, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+drug+screening+with+contractile+muscle+tissue+engineered+from+dystrophic+myoblasts.">Automated drug screening with contractile muscle tissue engineered from dystrophic myoblasts.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3325-3334 (2009).</li><li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinted+human+skeletal+muscle+constructs+for+muscle+function+restoration.">3D bioprinted human skeletal muscle constructs for muscle function restoration.</a> Scientific Reports. 8 (1), 12307 (2018).</li><li>Takahashi, H., Shimizu, T., Okano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineered+human+contractile+myofiber+sheets+as+a+platform+for+studies+of+skeletal+muscle+physiology.">Engineered human contractile myofiber sheets as a platform for studies of skeletal muscle physiology.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).</li><li>Afshar Bakooshli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+culture+model+of+innervated+human+skeletal+muscle+enables+studies+of+the+adult+neuromuscular+junction.">A 3D culture model of innervated human skeletal muscle enables studies of the adult neuromuscular junction.</a> eLife. 8, 1-29 (2019).</li><li>Madden, L., Juhas, M., Kraus, W. E., Truskey, G. A., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+human+myobundles+mimic+clinical+responses+of+skeletal+muscle+to+drugs.">Bioengineered human myobundles mimic clinical responses of skeletal muscle to drugs.</a> eLife. 2015 (4), 3-5 (2015).</li><li>Urciuolo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+in+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+at+the+single+fiber+scale.">Engineering a 3D in vitro model of human skeletal muscle at the single fiber scale.</a> PLoS One. 15 (5), 0232081 (2020).</li><li>Cvetkovic, C., Rich, M. H., Raman, R., Kong, H., Bashir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D-printed+platform+for+modular+neuromuscular+motor+units.">A 3D-printed platform for modular neuromuscular motor units.</a> Microsystems &amp; Nanoengineering. 3 (1), 1-9 (2017).</li><li>Shima, A., Morimoto, Y., Sweeney, H. L., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+contractile+muscle+tissue+consisting+of+human+skeletal+myocyte+cell+line.">Three-dimensional contractile muscle tissue consisting of human skeletal myocyte cell line.</a> Experimental Cell Research. 370 (1), 168-173 (2018).</li><li>Capel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scalable+3D+printed+molds+for+human+tissue+engineered+skeletal+muscle.">Scalable 3D printed molds for human tissue engineered skeletal muscle.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 20 (2019).</li><li>Gholobova, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tissue-engineered+skeletal+muscle:+a+novel+3D+in+vitro+model+for+drug+disposition+and+toxicity+after+intramuscular+injection.">Human tissue-engineered skeletal muscle: a novel 3D in vitro model for drug disposition and toxicity after intramuscular injection.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).</li><li>Osaki, T., Uzel, S. G. M., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microphysiological+3D+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+(ALS)+from+human+iPS-derived+muscle+cells+and+optogenetic+motor+neurons.">Microphysiological 3D model of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) from human iPS-derived muscle cells and optogenetic motor neurons.</a> Science Advances. 4 (10), 5847 (2018).</li><li>Rao, L., Qian, Y., Khodabukus, A., Ribar, T., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+pluripotent+stem+cells+into+a+functional+skeletal+muscle+tissue.">Engineering human pluripotent stem cells into a functional skeletal muscle tissue.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Maffioletti, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+human+iPSC-derived+artificial+skeletal+muscles+model+muscular+dystrophies+and+enable+multilineage+tissue+engineering.">Three-dimensional human iPSC-derived artificial skeletal muscles model muscular dystrophies and enable multilineage tissue engineering.</a> Cell Reports. 23 (3), 899-908 (2018).</li><li>Chal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+human+muscle+fibers+and+satellite-like+cells+from+human+pluripotent+stem+cells+in+vitro.">Generation of human muscle fibers and satellite-like cells from human pluripotent stem cells in vitro.</a> Nature Protocols. 11 (10), 1833-1850 (2016).</li><li>Khodabukus, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+stimulation+increases+hypertrophy+and+metabolic+flux+in+tissue-engineered+human+skeletal+muscle.">Electrical stimulation increases hypertrophy and metabolic flux in tissue-engineered human skeletal muscle.</a> Biomaterials. 198, 259-269 (2019).</li><li>Nagashima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+model+of+human+skeletal+muscle+tissues+with+contractility+fabricated+by+immortalized+human+myogenic+cells.">In vitro model of human skeletal muscle tissues with contractility fabricated by immortalized human myogenic cells.</a> Advanced Biosystems. , 2000121 (2020).</li><li>Mills, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+skeletal+micro+muscle+platform+with+pacing+capabilities.">Development of a human skeletal micro muscle platform with pacing capabilities.</a> Biomaterials. 198, 217-227 (2019).</li><li>Legant, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfabricated+tissue+gauges+to+measure+and+manipulate+forces+from+3D+microtissues.">Microfabricated tissue gauges to measure and manipulate forces from 3D microtissues.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (25), 10097-10102 (2009).</li><li>Pr&#252;ller, J., Mannhardt, I., Eschenhagen, T., Zammit, P. S., Figeac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Satellite+cells+delivered+in+their+niche+efficiently+generate+functional+myotubes+in+three-dimensional+cell+culture.">Satellite cells delivered in their niche efficiently generate functional myotubes in three-dimensional cell culture.</a> PLOS One. 13 (9), 0202574 (2018).</li><li>Sakar, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+optogenetic+control+of+engineered+3D+skeletal+muscle+bioactuators.">Formation and optogenetic control of engineered 3D skeletal muscle bioactuators.</a> Lab on a Chip. 12 (23), 4976-4985 (2012).</li><li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+system+to+monitor+statin-induced+myopathy+in+individual+engineered+skeletal+muscle+myobundles.">A system to monitor statin-induced myopathy in individual engineered skeletal muscle myobundles.</a> Lab on a Chip. 18 (18), 2787-2796 (2018).</li><li>Rajabian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+skeletal+muscle+as+a+model+of+muscle+aging+and+regeneration.">Bioengineered skeletal muscle as a model of muscle aging and regeneration.</a> Tissue Engineering Part A. 27 (1-2), 74-86 (2020).</li><li>Afshar, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+96-well+culture+platform+enables+longitudinal+analyses+of+engineered+human+skeletal+muscle+microtissue+strength.">A 96-well culture platform enables longitudinal analyses of engineered human skeletal muscle microtissue strength.</a> Scientific Reports. 10 (1), 6918 (2020).</li><li>Mamchaoui, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalized+pathological+human+myoblasts:+Towards+a+universal+tool+for+the+study+of+neuromuscular+disorders.">Immortalized pathological human myoblasts: Towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders.</a> Skeletal Muscle. 1 (1), 34 (2011).</li><li>Halldorsson, S., Lucumi, E., G&#243;mez-Sj&#246;berg, R., Fleming, R. M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advantages+and+challenges+of+microfluidic+cell+culture+in+polydimethylsiloxane+devices.">Advantages and challenges of microfluidic cell culture in polydimethylsiloxane devices.</a> Biosensors and Bioelectronics. 63, 218-231 (2015).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Bakooshli, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+3D+model+of+human+skeletal+muscle+innervated+with+stem+cell-derived+motor+neurons+enables+epsilon-subunit+targeted+myasthenic+syndrome+studies.">A 3D model of human skeletal muscle innervated with stem cell-derived motor neurons enables epsilon-subunit targeted myasthenic syndrome studies.</a> BioRxiv. , 275545 (2018).</li><li>Vandenburgh, H. H., Karlisch, P., Farr, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+highly+contractile+tissue-cultured+avian+skeletal+myotubes+in+collagen+gel.">Maintenance of highly contractile tissue-cultured avian skeletal myotubes in collagen gel.</a> Vitro Cellular &amp; Developmental Biology. 24 (3), 166-174 (1988).</li><li>Bell, E., Ivarsson, B., Merrill, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+a+tissue-like+structure+by+contraction+of+collagen+lattices+by+human+fibroblasts+of+different+proliferative+potential+in+vitro.">Production of a tissue-like structure by contraction of collagen lattices by human fibroblasts of different proliferative potential in vitro.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (3), 1274-1278 (1979).</li><li>Hinds, S., Bian, W., Dennis, R. G., Bursac, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+extracellular+matrix+composition+in+structure+and+function+of+bioengineered+skeletal+muscle.">The role of extracellular matrix composition in structure and function of bioengineered skeletal muscle.</a> Biomaterials. 32 (14), 3575-3583 (2011).</li></ol>

Este manuscrito describe métodos para fabricar y analizar un modelo de cultivo 3D hMMT que se puede aplicar a estudios de biología muscular básica, modelado de enfermedades o para pruebas de moléculas candidatas. La plataforma MyoTACTIC es rentable, fácil de fabricar y requiere un número relativamente pequeño de células para producir microtejidos musculares esqueléticos. Los hMMT formados dentro de la plataforma de cultivo MyoTACTIC están compuestos por miotubos alineados, multinucleados y estriados, y responde...

El músculo esquelético es uno de los tejidos más abundantes en el cuerpo humano y apoya funciones clave del cuerpo como la locomoción, la homeostasis por calor y el metabolismo1. Históricamente, los modelos animales y los sistemas de cultivo celular bidimensional (2D) se han utilizado para estudiar procesos biológicos y patogénesis de enfermedades, así como para probar compuestos farmacológicos en el tratamiento de enfermedades del músculo esquelético2,3. Si bien los modelos animales han mejorado en gran medida nuestro conocimiento del músculo esquelético en la salud y en la enfermedad, su impacto traslacional se ha visto obstaculizado por los altos costos, las consideraciones éticas y las diferencias entre especies2,4. Al recurrir a los sistemas basados en células humanas para estudiar el músculo esquelético, los sistemas de cultivo celular 2D son favorables debido a su simplicidad. Sin embargo, hay una limitación. Este formato a menudo no logra recapitular las interacciones célula-célula y célula-matriz extracelular que ocurren naturalmente dentro del cuerpo5,6. En los últimos años, los modelos tridimensionales (3D) del músculo esquelético han surgido como una poderosa alternativa a los modelos animales completos y los sistemas de cultivo 2D convencionales al permitir el modelado de procesos fisiológica y patológicamente relevantes ex vivo7,8. De hecho, una gran cantidad de estudios han reportado estrategias para modelar el músculo esquelético humano en un formato de cultivo 3D bioartificial1. Una limitación para muchos de estos estudios es que la fuerza activa se cuantifica después de la eliminación de los tejidos musculares de las plataformas de cultivo y la unión a un transductor de fuerza, que es destructivo y, por lo tanto, se limita a servir como un ensayo de punto final9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18 ,19,20,21. Otros han diseñado sistemas de cultivo que permiten métodos no invasivos de medición de la fuerza activa, pero no todos son susceptibles de aplicaciones de prueba de moléculas de alto contenido7,8,9,10,14,18,22,23,24,25,26,27,28 ,29.
Este protocolo describe un método detallado para fabricar microtejidos musculares humanos (hMMTs) en la plataforma microTissue Array deviCe To Investigate forCe (MyoTACTIC) del músculo esquelético (MyoTACTIC); un dispositivo de placa de 96 pocillos que soporta la producción a granel de microtisones musculares esqueléticos30. El método de fabricación de placas MyoTACTIC permite la generación de una placa de cultivo de polidimetilsiloxano (PDMS) de 96 pocillos y todas las características correspondientes del pozo en un solo paso de fundición, por lo que cada pozo requiere un número relativamente pequeño de células para la formación de microtejivas. Los microtejidos formados dentro de MyoTACTIC contienen miotubos alineados, estriados y multinucleados que son reproducibles de pozo a pozo del dispositivo, y al madurar, pueden responder a estímulos químicos y eléctricos in situ30. Aquí, se describe y discute la técnica para fabricar un dispositivo de placa de cultivo MIOTÁCTICO PDMS a partir de una réplica de poliuretano (PU), un método optimizado para implementar células progenitoras miogénicas humanas inmortalizadas para fabricar hMMT, y la evaluación funcional de la generación de fuerza hMMT diseñada y las propiedades de manejo de calcio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.9% Saline Solution, Sterile</td>
			<td>House Brand</td>
			<td>1010</td>
			<td>10 mL aliquots of the solution are made and stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25G Needle</td>
			<td>BD, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2548-CABD305127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-Aminocaproic Acid, &#8805;99% (titration), Powder</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>A2504-100G</td>
			<td>A 50 mg / mL stock solution is generated by dissolving 5 mg of 6-aminocaproic acid powder in 100 mL of autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6.35 mm ID Tubing</td>
			<td>VWR</td>
			<td>60985-528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AB1167 Myoblast Cell Line</td>
			<td>Institut de Myologie (Paris, France)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arbitrary Waveform Generator</td>
			<td>Rigol</td>
			<td>DG1022Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basement Membrane Extract (Geltrex)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14132-02</td>
			<td>Stored as aliquots of 50 &#181;L or 100 &#181;L at -80&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benchtop Vacuum Chamber</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D2672</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BNC to Aligator Clip Cable</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Culture Plastics</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td></td>
			<td>Includes culture plates, serological pipettes, etc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>D8418-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, Powder, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>21600069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
			<td>This is a high glucose DMEM with L-glutamine and sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from Bovine Plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>F8630-5G</td>
			<td>Aliquots ranging from 7 - 10 mg of fibrinogen powder are made and stored at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtropur Syringe Filter, 0.22um Pore Size</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.1826.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16050-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Recombinant Insulin</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>91077C</td>
			<td>Stock solution is 100X and made by dissolving 1 mg of human recombinant insulin in 1 mL of DMEM and 1 &#181;L of NaOH 10N. Solution is filtered and stored as 1 mL aliquots at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Acquisition Software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Dimension</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>National Institutes of Health</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isotemp Oven</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope - Camera Mount</td>
			<td>Labcam</td>
			<td>Labcam for iPhone</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 1cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2606-309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Disposable Syringes, 50cc</td>
			<td>BD</td>
			<td>2612-309653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127, Powder, BioReagent</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td>A 5% stock solution of pluronic acid is made by dissolving 5 g of pluronic acid powder in 100 mL of chilled, autoclaved, distilled water. The solution is vaccum filtered and 10 mL aliquots are stored at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit)</td>
			<td>Dow</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Kits are also available at Thermo Fisher Scientific, Sigma - Aldrich, etc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyurethane Negative Mold</td>
			<td>In House</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Release Agent</td>
			<td>Mann Release Technologies</td>
			<td>200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary Vane Vacuum Pump</td>
			<td>Edwards</td>
			<td>A65401906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Almedic, Medstore, University of Toronto</td>
			<td>2586-M36-0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blade</td>
			<td>VWR</td>
			<td>55411-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Basal Medium</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23260</td>
			<td>30 mL aliquotes are generated and at stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skeletal Muscle Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td>
			<td>Promocell</td>
			<td>C-23060</td>
			<td>42 mL aliquots are generated and stored at 4&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Smartphone (iPhone)</td>
			<td>Apple</td>
			<td>SE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Duty Dry Vacuum Pump</td>
			<td>Welch</td>
			<td>2546B-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization Bag</td>
			<td>Alliance</td>
			<td>211-SCM2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thimble</td>
			<td>Igege</td>
			<td></td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from human plasma</td>
			<td>Sigma - Aldrich</td>
			<td>T6884-250UN</td>
			<td>100 units of thrombin is dissolved in 1 mL of a 0.1% BSA solution. 10 &#181;L aliquots are prepared and stored at - 20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tin coated copper wire</td>
			<td>Arco</td>
			<td>B8871K48</td>
			<td>Ordered from Amazon</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15250061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA, 0.25%</td>
			<td>Thermo FIsher Scientific</td>
			<td>25200072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Chamber 2</td>
			<td>SP Bel-Art</td>
			<td>F42027-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing functional metrics of skeletal muscle health in human skeletal muscle microtissues

Los modelos tridimensionales (3D) in vitro del músculo esquelético son un avance valioso en la investigación biomédica, ya que brindan la oportunidad de estudiar la reforma y la función del músculo esquelético en un formato escalable que es susceptible de manipulaciones experimentales. Los sistemas de cultivo muscular 3D son deseables, ya que permiten a los científicos estudiar el músculo esquelético ex vivo en el contexto de las células humanas. Los modelos 3D in vitro imitan de cerca aspectos de la estructura del tejido nativo del músculo esquelético adulto. Sin embargo, su aplicación universal está limitada por la disponibilidad de plataformas que son fáciles de fabricar, costosas y fáciles de usar, y producen cantidades relativamente altas de tejidos musculares esqueléticos humanos. Además, dado que el músculo esquelético desempeña un papel funcional importante que se ve afectado con el tiempo en muchos estados de enfermedad, una plataforma experimental para estudios de microtejidos es más práctica cuando las mediciones mínimamente invasivas de la fuerza transitoria y contráctil del calcio se pueden realizar directamente dentro de la propia plataforma. En este protocolo, se describe la fabricación de una plataforma de 96 pocillos conocida como 'MyoTACTIC', y la producción en masa de microtisones musculares esqueléticos humanos (hMMTs) en 3D. Además, se informan los métodos para una aplicación mínimamente invasiva de estimulación eléctrica que permite mediciones repetidas de la fuerza del músculo esquelético y el manejo del calcio de cada microtejido a lo largo del tiempo.

Aquí se describen métodos para fundir una plataforma de cultivo MyoTACTIC basada en PDMS de 96 pocillos desde un molde de PU, fabricar matrices de tejidos de réplica de hMMT y analizar dos aspectos de la función de hMMT dentro de la generación de fuerza del dispositivo de cultivo y el manejo de calcio. La Figura 1 ofrece una visión general esquemática de la preparación de los pocillos de cultivo MyoTACTIC antes de la siembra de hMMT. PDMS es un polímero a base de silicona ampliament...

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Assessing Functional Metrics of Skeletal Muscle Health in Human Skeletal Muscle Microtissues

Este manuscrito describe un protocolo detallado para producir matrices de microtejidos 3D del músculo esquelético humano y ensayos de función in situ mínimamente invasivos aguas abajo, incluidos análisis de fuerza contráctil y manejo de calcio.

Evaluación de las métricas funcionales de la salud del músculo esquelético en microtejidos del músculo esquelético humano

Three-dimensional (3D) in vitro models of skeletal muscle are a valuable advancement in biomedical research as they afford the opportunity to study ...

Nuestro protocolo describe métodos detallados para fabricar y analizar un cultivo de microtis del músculo esquelético humano en 3D. Los microtejidos musculares se pueden aplicar a estudios de biología muscular básica, modelado de enfermedades o para pruebas de moléculas candidatas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la evaluación in situ de la fuerza contráctil y los transitorios de calcio.Debido a esto, puede realizar estudios longitudinales de la función del tejido muscular. Demostrando el procedimiento estarán Brennen Musgrave y Heta Lad, estudiantes graduados de mi laboratorio. Dos o tres horas antes de la siembra celular, coloque una porción de placa táctica suave de seis pozos en una placa de cultivo celular de 10 centímetros.Prepare bien cada cultivo miotáctico individual agregando 100 microlitros de una solución F-127 5% plurónica. Use la tapa para cubrir los pozos y aplique una película de parafina para sellar el plato. Centrifugar el plato a 1, 550 veces G durante un minuto en una centrífuga equipada con un adaptador de plato giratorio.Guarde el plato de cultivo a cuatro grados centígrados hasta que las células estén listas para la siembra. Luego descongele lentamente 150 alícuotas de microlitros de extracto de membrana basal y 110 alícuotas de microlitros de trombina en hielo en la campana de cultivo. Trabajando en la campana de cultivo celular, agregue 700 microlitros de solución salina al 0.9% a un tubo de micro centrífuga de 1.5 mililitros que contiene siete miligramos de fibrinógeno en polvo.Coloque el tubo en una incubadora de cultivo celular de 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos sin vórtice. Retire y mueva el tubo suavemente, luego haga girar por pulso la solución disuelta en una micro centrífuga antes de devolverla a la campana de cultivo. Filtre la solución de fibrinógeno con una jeringa de un mililitro equipada con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros.Luego transfiera la solución de fibrinógeno disuelto al hielo junto con el extracto de la membrana basal y las alícuotas de trombina. Prepare y precaliente los medios de crecimiento del tejido a 37 grados centígrados, que se introducirán en los pozos de cultivo después de sembrar los tejidos. Retire las placas de cultivo celular de la incubadora y aspire los medios de cultivo.Luego lave las células una vez agregando cinco mililitros de DPBS en cada placa de cultivo. Aspire el DPBS y separe las células agregando un mililitro de EDTA de tripsina al 0,25% en cada plato de cultivo. Coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante tres minutos, sostenga la tripsina agregando tres mililitros de medio de lavado a la placa de cultivo, luego transfiera las células a un tubo cónico del tamaño adecuado.Peletizar las células centrifugando a 400 veces G durante 10 minutos. Aspire el medio con cuidado sin dañar la bolita celular, luego vuelva a suspender las células en un mililitro del medio de lavado. Cuente las células usando un hemocitómetro y un tinte azul tripano bajo microscopía de campo brillante.Para sembrar seis tejidos, prepare suficientes células y matriz extracelular para ocho tejidos, lo que representa las pérdidas y la formación de burbujas. Transfiera 1,2 millones de células a un nuevo tubo cónico, luego aumente el volumen a 10 milímetros con el medio de lavado. Peletizar las células centrifugando a 400 veces G durante 10 minutos.Prepare 150 microlitros de mezcla de ECM en un tubo de micro centrífuga de 1,5 mililitros y guarde la mezcla en hielo hasta su uso. Aspire los medios del tubo cónico que contiene las células, teniendo cuidado de evitar el pellet celular. Mueva vigorosamente el extremo del tubo con un dedo enguantado hasta que el gránulo aparezca como una suspensión celular.Transfiera 120 microlitros de la solución de ECM al tubo que contiene la suspensión celular, y pipetee cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo para volver a suspender completamente las células dentro de la ECM para generar una suspensión de una sola celda. Evite crear burbujas, luego coloque la suspensión de ECM de la celda sobre hielo hasta su uso. Coloque el plato refrigerado de 10 centímetros que contiene los pocillos miotácticos sobre una bolsa de hielo dentro de la campana de cultivo celular, y aspire la solución plurónica F-127 de cada pozo.Permita que la solución plurónica residual F-127 se libere del PDMS poroso y se asiente en el fondo del pozo dejando que los pozos se asienten durante cinco minutos en hielo, luego aspire nuevamente. Pipetee la suspensión ECM de la celda con cuidado para volver a suspender las células, luego transfiera 105 microlitros de la suspensión a un tubo fresco de 1,5 mililitros preenfriado agarrándolo cerca de la parte superior. Agregue 0,84 microlitros de 100 unidades por mililitro de solución madre de trombina a los 105 microlitros de suspensión de ECM celular.Pipetear rápida y completamente para mezclar, evitando la introducción de burbujas. Agregue 15 microlitros de la mezcla de ECM celular a cada pozo sin presionar la pipeta en el fondo del pozo. Con dos movimientos ligeros, extienda la suspensión celular detrás de cada poste en el pozo.Coloque la tapa en la placa de cultivo de 10 centímetros y transfiérala a una incubadora de cultivo de tejidos a 37 grados Celsius durante aproximadamente cinco minutos. Agregue 200 microlitros de medios de crecimiento de tejido precalentados a cada pozo miotáctico después de que la mezcla de ECM celular se haya polimerizado. Reemplace la tapa en el plato de 10 centímetros y manténgalo en la incubadora hasta la diferenciación.Durante un período de cultivo de 14 días, los mioblastos mostraron los aspectos del tejido nativo autoorganizándose en el pozo táctico suave para formar un microtejido 3D con miotubos estriados multinucleados. Los miotubos tienen estrías de sarcómeros, que se visualizaron mediante inmunotinción para la alfa actinina sarcomérica. Para lograr miotubos bien alineados, se deben evitar errores técnicos como la formación de burbujas durante el pipeteo o el recubrimiento plurónico dañino durante la aspiración.Aquí se muestra un desplazamiento representativo del poste de la placa del pozo miotáctico en respuesta a la estimulación eléctrica de baja y alta frecuencia, lo que indica que los miotubos responden a estímulos eléctricos variables y se contraen en consecuencia. La cuantificación del desplazamiento posterior permite la conversión a fuerza contráctil absoluta de los HMMT. También se analizó la transitoriedad de calcio en hmmT hecha de mioblastos transducidos por GCaMP6 en respuesta a la estimulación de baja y alta frecuencia.La cuantificación de la intensidad fluorescente se puede utilizar como medida de las propiedades de manejo de calcio de los HMMT. La mayoría de las personas que realizan esta siembra de tejido por primera vez, luchan con la adición de la matriz extracelular celular a los pozos y con la formación de burbujas. Recomendamos practicar la técnica en algunos pozos de cultivo de microtejidos de repuesto con una solución viscosa muy simple antes del primer intento con células.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Los tejidos de ingeniería músculo esquelético de células mioblastos murinos progenitoras y aplicación de estimulación eléctrica

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

Investigación

Bioingeniería

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Measurement of Maximum Isometric Force Generated by Permeabilized Skeletal Muscle Fibers

Medición de la fuerza isométrica máxima generada por las fibras musculares esqueléticas permeabilizadas

Analysis of the contractile properties of chemically skinned, or permeabilized, skeletal muscle fibers offers a powerful means by which to assess muscle ...

Engineered Vascularized Muscle Flap

Diseñado vascularizado colgajo de músculo

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Tomografía Computarizada e Imagen Óptico de Acoplamiento-Osteogénesis angiogénesis para evaluar la integración de craneales hueso autoinjertos y aloinjertos

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

Aplicaciones de la<em&gt; En Vivo</em&gt; Pruebas funcionales de la rata tibial anterior para la evaluación de la ingeniería tisular de reparación del músculo esquelético

Despite the regenerative capacity of skeletal muscle, permanent functional and/or cosmetic deficits (e.g., volumetric muscle loss (VML) resulting from ...

Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

Actuador basado en células musculares cardíacas y biorobot autoestabilizante - PARTE 1

Biological machines often referred to as biorobots, are living cell- or tissue-based devices that are powered solely by the contractile activity of living ...

Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Actuador basado en las células musculares cardíacas y auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

Semiautomated Longitudinal Microcomputed Tomography-based Quantitative Structural Analysis of a Nude Rat Osteoporosis-related Vertebral Fracture Model

Semiautomatizado Longitudinal basado en la tomografía Microcomputed cuantitativo análisis estructural de un modelo de rata desnuda fractura Vertebral relacionada con la Osteoporosis

Osteoporosis-related vertebral compression fractures (OVCFs) are a common and clinically unmet need with increasing prevalence as the world population ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional PolyÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Âµ-caprolactone Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

Escritura de Electrospinning de andamios Poly(ε-caprolactone) tridimensional con morfologías controlables para aplicaciones de ingeniería de tejidos del derretimiento

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...